La relación entre la ciclooxigenasa (COX-2) y la enfermedad inducida por hipoxia

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La prostaglandina E2 intracelular contribuye a la muerte celular del túbulo proximal inducida por hipoxia

Coral García-Pastorl, Selma Benito-Martínez, Ricardo J.Bosch1, Ana B. Fernández-Martínez, Francisco J. Lucio-Cazana

Las células tubulares proximales (PTC) son particularmente vulnerables a la apoptosis inducida por hipoxia, un factor relevante paraenfermedad del riñon. Aquí planteamos la hipótesis de que la muerte de PTC bajo hipoxia está mediada por la producción de prostaglandina E (PGE) dependiente de la ciclooxigenasa (COX-2), que se confirmó en células HK-2 tubulares proximales humanas porque la hipoxia La apoptosis inducida por (1 por ciento O,) (i) fue prevenida por una COX-2(ciclo-oxigenasa) y por los antagonistas de los receptores de prostaglandina (EP) y (ii) se asoció con un aumento de la PGE intracelular, (iPGE) debido a la regulación positiva transcripcional de la COX dependiente del factor inducible por hipoxia-1 -{{3 }}(ciclo-oxigenasa). La apoptosis también fue prevenida por inhibidores del transportador de captación de prostaglandinas PGT, lo que indicó que iPGE contribuye a la apoptosis inducida por hipoxia (por el contrario, la muerte de PTC inducida por hipoxia/reoxigenación se debió exclusivamente a PGE extracelular). Por lo tanto, iPGE es un nuevo actor en la patogénesis de la lesión tubular inducida por hipoxia y PGT podría ser un nuevo objetivo terapéutico para la prevención de lesiones dependientes de hipoxia en enfermedades renales.

Está bien establecido que la hipoxia tubular es un factor relevante tanto para las enfermedades agudas como para las crónicas.enfermedad del riñon'2 Las células tubulares proximales (CPT) son muy activas en términos de consumo de oxígeno debido a sus actividades de reabsorción que demandan energía y, en consecuencia, son vulnerables a la hipoxia. Se ha demostrado que la apoptosis juega un papel relevante en cultivos de PTC expuestos a hipoxia, pero no se han investigado las vías de señalización responsables de la activación de la maquinaria apoptótica. Nosotros y otros hemos encontrado que la prostaglandina E, (PGE), un importante mediador lipídico de numerosos procesos fisiológicos y patológicos en elriñón, juega un papel relevante en la señalización que conduce a la apoptosis de PTC tras el tratamiento con cisplatino7, albúmina8 o leptina y gentamicina. En todos los casos, se encontró que el aumento de PGE dependía de la expresión mejorada de ciclooxigenasa-2(COX-2)(ciclooxigenasa), una enzima inducible que, junto con la COX-1l, es el paso limitante de la síntesis de prostaglandinas. en el humanoriñón, COX basal-2(ciclooxigenasa)expresión es menos intensa que la de COX-1. COX-2(ciclooxigenasa)se ha identificado en podocitos y partes del asa de Henle y vasculatura renal en condiciones fisiológicas10. Sin embargo, en estados patológicos, la inmunorreactividad de la COX-2 se puede encontrar en muchos más tipos de células dentro delriñónincluyendo PTC, y posiblemente contribuye a la lesión renal. Curiosamente, la hipoxia aumenta la expresión de COX-2(ciclooxigenasa)y/o la producción de PGE,12-i7 en muchos tipos de células. De hecho, previamente hemos encontrado que la hipoxia potencia el contenido intracelular en PGE, así como su liberación al medio extracelular8. Por lo tanto, es teóricamente posible que PGE media el efecto apoptótico de la hipoxia en PTC.

La mayoría de los estudios sobre la apoptosis dependiente de PGE se han centrado esencialmente en los mecanismos que involucran a la PGE extracelular porque se acepta ampliamente que la PGE ejerce sus efectos biológicos a través de la activación de los receptores de PGE acoplados a la proteína G que se extienden por la membrana plasmática (receptores de prostaglandina de la serie E). EP1-4)1. Sin embargo, en algunos modelos, la PGE intracelular (iPGE) es relevante en la muerte celular apoptótica720-22. Esto implica que para inducir la apoptosis, la PGE tiene que llegar de nuevo al medio intracelular y activar un subconjunto de receptores EP, que se encuentran en el interior de la célula (receptores iEP). Debido a que la tarea de capturar PGE la realiza principalmente el transportador de captación de prostaglandinas (PGT)23-26, la inhibición de PGT da como resultado la prevención de la muerte celular apoptótica mediada por iPGE7.

Teniendo en cuenta estos antecedentes, en el presente trabajo estudiamos si una COX-2(ciclooxigenasa)El aumento dependiente de iPGE, los niveles median la apoptosis inducida por hipoxia en PTC.

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Métodos

reactivos

AG1478, verde de bromocresol (BG), PGE, AH6809, GW627368X, violeta cristal, soluciones de azul de tripano, bromosulfoftaleína (BRS), 3-(5'-hidroximetil2'-furil)-1-bencil indazol (YC1), y actinomicina D se adquirieron de Sigma (St. Louis, MO, EE. UU.). Z-VAD-FMK y celecoxib eran de Calbiochem (Darmstadt, Alemania) y Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, EE. UU.), respectivamente. TriReagent se adquirió de Vitro (Madrid, España), y las membranas de PVDF y el reactivo de luminol de transferencia Western se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EE. UU.). Reactivo antifade ProLong Gold con 4,6-diamidino{{14 }}fenil indol (DAPI), kit de detección de apoptosis de anexina-V-FITC (isotiocianato de fluoresceína)/yoduro de propidio (PI) y sonda de diacetato de 2',7'-diclorofluoresceína (DCFH-DA) se adquirieron de Invitrogen (Carlsbad, CA, EE. EE. UU.) y Molecular Probes (Oregón, EE. UU.), respectivamente. Los anticuerpos se obtuvieron de las siguientes fuentes: anti-PGE y anti-COX-2(ciclooxigenasa)los anticuerpos procedían de Abcam (Cambridge, Reino Unido); anti-Bax y anti-Bcl-2 eran de Santa Cruz Technologies (Santa Cruz, CA.EE. UU.); el anticuerpo anti-HIF-la y -rabbit-Alexa-Fluor 488 fueron de BD Biosciences (Palo Alto, CA, EE. UU.) e Invitrogen (Carlsbad, CA, EE. UU.), respectivamente; anti- -actina y conjugado de peroxidasa IgG anti-ratón de conejo se adquirió de Sigma (St. Louis, MO, EE. UU.).

Cultivo celular y condiciones experimentales.

Se compraron células HK-2 tubulares proximales humanas de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) (Rockville, MD, EE. UU.). suero (FBS), 1 por ciento de penicilina/estreptomicina/anfotericina B y 1 por ciento de glutamina (Invitrogen. Carlsbad, CA, EE. UU.) y 1 por ciento de insulina-transferrina-selenio (ThermoFisher. Grand Island, NY, EE. UU.). En todos los experimentos, las células se sembraron en placas con una confluencia de 70-90 por ciento, y cuando se adhirieron por completo, se cultivaron en condiciones hipóxicas (1 por ciento de oxígeno) o normóxicas (21 por ciento de oxígeno).HipoxiaLos experimentos se realizaron en un In vivo200hipoxiaestación de trabajo (Ruskin Technology, West Yorkshire, Reino Unido). Parahipoxia/experimentos de reoxigenación, las células se sometieron ahipoxiadurante 24 h y, a partir de entonces, las células se incubaron en condiciones normóxicas hasta 3 h (período de reoxigenación).

Análisis de inmunofluorescencia de iPGE y análisis de transferencia Western de COX-2(ciclooxigenasa)y HIF-1 .

Las células para el análisis de inmunofluorescencia y el análisis de transferencia Western se dividieron respectivamente en cubreobjetos de vidrio (4 × 104 células/objeto de vidrio) o en placas de seis pocillos (15 × 104 células/pocillo) y se incubaron como se describe en "Resultados". Luego, se realizaron análisis de inmunofluorescencia e inmunotransferencia esencialmente como se describió anteriormente. Las diluciones de trabajo de anticuerpos fueron: 1/50 para PGE, 1/1000 para COX-2(ciclooxigenasa)/HIF-1a/a-rabbit-Alexa-Fluor 568 y 1/5000 para -actina. La detección de inmunofluorescencia se realizó con un microscopio confocal Leica SP5 (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania), a través del Servicio de Microscopía Confocal (ICTS 'NANBIOSIS'U17) del Centro de Investigación Biomédica en Red sobre Bioingeniería, Biomateriales y Nanomedicina (CIBER-BBN en el Universidad de Alcalá, Madrid, España)

Transfección transitoria.

Transfección transitoria con siRNA PGT (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), el vector de expresión de mamíferos pcDNA3 que contiene el ADNc de la 15-hidroxi-prostaglandina deshidrogenasa humana de tipo salvaje (p15-PGDH) o la Construcciones de plásmidos informadores de luciferasa para la COX humana-2(ciclooxigenasa)phpPES2-Luc, humanohipoxiaelemento de respuesta (HRE) p9HIF1-Luc y R. reniformis pRL-CMV (Promega, Madison, WI) y la determinación de la actividad de luciferasa se realizaron como se describe en otra parte27,28.

Recuento de células y morfología de células/núcleos.

El número de células adherentes se determinó espectrofotométricamente con un método de tinción con cristal violeta modificado2. Para detectar evidencia de apoptosis, se observó la morfología celular usando microscopía de contraste de fase. Los núcleos celulares se visualizaron después de la tinción de ADN con DAPI como se describió anteriormente0. La morfología apoptótica típica que se examinó incluía la contracción celular, la condensación y fragmentación nuclear y la formación de cuerpos apoptóticos. Para la cuantificación, se examinaron seis campos en cada condición experimental de manera ciega para estimar el porcentaje de núcleos con apariencia similar a la apoptosis.

Ensayo de apoptosis por citometría de flujo y ensayo de viabilidad celular mediante la prueba de exclusión del colorante azul tripán.

Las células adheridas a la placa se separaron por tripsinización y, junto con las células separadas previamente recuperadas del medio de cultivo, se usaron para el ensayo.

El kit de detección de apoptosis de anexina-V-FITC/PI permitió la detección de citometría de flujo de células HK-2 apoptóticas y necróticas, como se describió anteriormente7. Las células apoptóticas tempranas y tardías fueron positivas, respectivamente, para la tinción de anexina V y ambas tinción Las células necróticas solo fueron positivas para PI y las células HK-2 vivas no mostraron tinción.

Se usó la prueba de exclusión con colorante azul de tripano para evaluar la viabilidad celular. Las células viables (blancas) y las células muertas (azules) se contaron utilizando un microscopio óptico y un hemocitómetro.

Análisis estadístico.

Cada experimento fue repetido al menos tres veces. Los resultados se expresan como la media ± SEM. Fueron sometidos a un análisis de varianza de una vía (ANOVA) seguido de la prueba de Bonferroni para comparaciones múltiples. El nivel de significancia se fijó en P menor o igual a 0.05.

Resultados

La hipoxia induce la muerte de las células HK-2 tubulares proximales.

Hipoxiaredujo el número de células HK-2, según lo evaluado mediante el ensayo de cristal violeta (Fig. la), y también indujo el redondeo celular y el desprendimiento de la placa (Fig. lb, panel superior). Como se esperaba,hipoxiadesencadenó un modelo de muerte celular con características morfológicas claras de apoptosis (ver tinción nuclear con DAPI en la Fig. lb, panel inferior, izquierda) como la contracción celular con condensación nuclear significativa, fragmentación y formación de cuerpos apoptóticos.HipoxiaLa apoptosis inducida se confirmó además por el aumento de la tinción de anexina V-FITC, según lo evaluado por citometría de flujo, y su prevención con el inhibidor de pan-caspasa Z-VAD-FMK (Fig. lc).Hipoxiatambién determinó una disminución en el número de células viables pero no indujo cambios estadísticamente significativos en el número de células necróticas (Fig. 1c, recuadro).

Figura 1. La hipoxia induce la muerte de las células HK-2 tubulares proximales.(a) Disminución del recuento de células (ensayo de cristal violeta). (b) Características morfológicas de la apoptosis. Microfotografías de contraste de fase representativas (panel superior, aumento original, 10×) Microfotografías con tinción DAPI (panel inferior, aumento original, 40×). (c) Aumento de la apoptosis (estudios de citometría de flujo). Las células con anexina V plus comprenden células con anexina V más/yoduro de propidio (es decir, células apoptóticas tempranas con integridad de la membrana plasmática preservada) y células con anexina V más/yoduro de propidio más (es decir, células con apoptosis tardía). Recuadro: Tipos de poblaciones celulares (las células con anexina V-/yoduro de propidio plus son células necróticas y anexina V-/yoduro de propidio-son células vivas). Los resultados se expresan como porcentajes con respecto al número total de eventos. Información general:(1) Las células se incubaron durante 24 h en condiciones normóxicas (21 por ciento de O2) o hipóxicas (1 por ciento de O), como se indica en "¿Métodos?. El inhibidor de pan-caspasa Z-VAD-FMK (25 μM) fue añadido 1 h antes de iniciar la exposición ahipoxia. (2) Las microfotografías son ejemplos representativos de tres experimentos independientes. Barras y barras de error en gráficos: cada barra representa la media ± SEM de 3 experimentos diferentes *P<0.01 vs.=""><0.01 vs="">hipoxia;**P<0.01 vs.="" normoxia="" and="">hipoxiamás ZVAD.

COX-2(ciclooxigenasa)La vía del receptor /iPGE,/EP media la muerte de células HK-2 tubulares proximales inducida por hipoxia.

Para evaluar el papel de la COX-2(ciclooxigenasa)vía del receptor /iPGE2/EP enhipoxiainducida por la muerte celular HK-2, primero preincubamos las células con celecoxib, un COX-2(ciclooxigenasa)inhibidor1; AH6809, antagonista de los receptores EP1, EP2 y EP3 o GW627368X, antagonista del receptor EP433; o con verde de bromocresol o bromosul-fphthale en ambos inhibidores de PGT435. PGT también fue derribado a través de la transfección con siRNA.

Figura 2. COX-2(ciclooxigenasa)La vía del receptor /iPGE,/EP media la muerte de células HK-2 tubulares proximales inducida por hipoxia.(a) Prevención de la muerte celular por inhibidores de la vía. Panel superior; Las barras muestran el porcentaje de muerte celular total (izquierda) o el porcentaje de anexina V más células apoptóticas (derecha). Antes de estar expuesto ahipoxia, las células se preincubaron durante 1 h con celecoxib (COX-2) 3 μM(ciclooxigenasa)inhibidor）;10 μM AH6809, (antagonista de los receptores EP1-3), 10 μM GW627368X (antagonista del receptor EP4); o con verde de bromocresol 50 μM (BG) o bromosulfoftaleína (BrS) 25 μM, dos inhibidores de la PGT. Panel inferior: Izquierda: Prevención de la muerte celular mediante la eliminación de PGT a través de la transfección con siRNA (prueba de exclusión de buceo con azul de tripano). Recuadro: Eficacia de la eliminación de PGT (análisis de transferencia Western) Derecha: Dependencia de la concentración del efecto preventivo del verde de bromocresol (BG). (b) Prevención de la muerte celular por transfección con un vector de expresión de mamífero que contiene ADNc de la enzima 15-hidroxi-prostaglandina deshidrogenasa (15-PGDH) que inactiva la prostaglandina (prueba de exclusión con colorante azul de tripano). Recuadro: Expresión de {{ 11}}PGDH (análisis de transferencia Western) en células transfectadas. (C)Hipoxiainduce un aumento sensible a PGT en iPGE, Izquierda: se muestra inmunofluorescencia dependiente de PGE, sola o combinada con tinción nuclear con DAPI (aumento original, 40x) Derecha: Enfoque cuantitativo de las imágenes presentadas en el panel izquierdo usando el software Image J. (d) El inhibidor de la activación de EGFR AG1478 no previene la muerte de células HK-2 EGFR. Las células se preincubaron durante 1 h con AG1478 1 μM antes de someterlas ahipoxia. (e) El inhibidor de PGT BG no modifica la expresión de Bax y Bcl-2 en células HK-2 bajohipoxia(Análisis de Western Blot). f) Prevención dehipoxia/muerte celular inducida por reoxigenación por inhibidores de la vía (test de exclusión con colorante azul tripano). Las células se preincubaron con inhibidores de la vía y se sometieron ahipoxiacomo en (a). Luego, las células se expusieron a normoxia durante 3 h. Información general: (1) Las células se incubaron durante 24 h en condiciones normóxicas (21 por ciento de O) o hipóxicas (1 por ciento de O), como se indica en "Métodos". (2) Las microfotografías son ejemplos representativos de tres experimentos independientes. (3) Los solventes de los inhibidores (luL/mL medio) no modificaron el efecto dehipoxiasobre la muerte celular (no se muestran los resultados). (4) Análisis de transferencia de Western: se confirmó la igualdad de proteínas sondeando con un anticuerpo anti- -actina o anti-GAPDH. (5) Barras y barra de error en gráficos: Cada barra representa la media ± SEM de 3 experimentos diferentes.*P<0.01><0.01>hipoxiaohipoxia/reoxigenación.

Como se muestra en la Fig. 2a,hipoxiaSe evitó en todos los casos la muerte de células tubulares proximales inducida. La inhibición de la apoptosis por celecoxib indicó que la COX-2(ciclooxigenasa)juega un papel relevante enhipoxiamuerte celular apoptótica inducida (Fig. 2a, panel superior, derecha). Más específicamente, el hecho de que la apoptosis fuera prevenida por el antagonismo de los receptores EP indica que la apoptosis está mediada por COX-2(ciclooxigenasa)-producción dependiente de PGE. Por otro lado, lo más probable es que iPGE, contribuya ahipoxia-inducida por la muerte de células HK-2 porque fue prevenida por;(i) inhibición de PGT (Fig. 2a) o (i) sobreexpresión de 15-PGDH (Fig. 2b), que inactiva iPGE2 a través de su oxidación 25 (de nota, el procedimiento de transfección en sí aumentó la sensibilidad de las células HK-2 ahipoxia: la muerte celular fue 45-55 por ciento para la transfección en condiciones de control en comparación con 15-20 por ciento en células no transfectadas). Más apoyo a la contribución de iPGE, ahipoxiainducida por la muerte de células HK-2, son nuestros hallazgos previos quehipoxiadetermina un aumento en el contenido celular de iPGE1, y que este aumento fue impedido por los inhibidores de la PGT (fig. 2c).

Las vías de señalización de MAPK pueden inducir la apoptosis. Debido a que los receptores iEP transactivan el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR)36, lo que conduce a la activación de las MAP quinasas ERK1/2 y p38 en las células HK-20, preguntamos si pre -Se previno la incubación de células HK-2 con el inhibidor de la activación de EGFR AG1478hipoxia-muerte celular inducida. Encontramos resultados negativos (Fig. 2d) y, por lo tanto, es poco probable que la transactivación de EGFR medie la muerte de células HK-2 bajohipoxia.

En varios modelos experimentales, la reducción del ATP derivado de mitocondrias durantehipoxiaprovoca un aumento en la proporción de expresión de la proteína proapoptótica Bax a la proteína antiapoptótica Bcl-2, lo que conduce a la liberación de citocromo C en el citosol, la activación de la caspasa 9 y la subsiguiente escisión y activación del efector aguas abajo. caspasas37,38. Sin embargo, la preincubación con inhibidor de PGT BG en células HK-2 bajohipoxiano dio como resultado cambios compatibles con un cambio antiapoptótico en el equilibrio entre la expresión de Bc-2 y Bax (Fig. 2e), lo que no respalda el papel de estas proteínas en las células HK-2 muerte bajohipoxia.

Después de la exposición hipóxica, los episodios de reoxigenación (lesión por isquemia/reperfusión) pueden inducir daño celular adicional. La "paradoja" de la lesión por reoxigenación se puede entender teniendo en cuenta que las células experimentan cambios específicos en las actividades enzimáticas, la función mitocondrial, la estructura del citoesqueleto, el transporte de membrana y las defensas antioxidantes en respuesta ahipoxia, que luego predisponen colectivamente a la lesión por reoxigenación39. La reoxigenación contribuye a la lesión renal aguda durante el accidente cerebrovascular isquémico, el trasplante de riñón, la insuficiencia circulatoria o la cirugía renal y cardiovascular. En este contexto, el valor terapéutico potencial de la inhibición dehipoxia/muerte de células tubulares proximales inducida por reoxigenación a través de la intervención en COX-2(ciclooxigenasa)La vía del receptor /iPGE,/iEP es evidente. Por lo tanto, preguntamos si iPGE media específicamentehipoxia-muerte celular inducida o también mediahipoxia/muerte celular inducida por reoxigenación (un modelo in vitro que imita la lesión por isquemia/reperfusión renal in vivo). Como se muestra en la Fig. 2f, la COX evitó la muerte celular (evaluada mediante la prueba de exclusión por inmersión con azul tripano)-2(ciclooxigenasa)inhibidor celecoxib, así como por los antagonistas del receptor EP AH6809 o GW627368X. Al igual que para la Fig. 2a, estos resultados sugieren que COX-2 juega un papel relevante enhipoxia/muerte celular inducida por reoxigenación y, más específicamente, que la muerte celular está mediada por COX-2(ciclooxigenasa)-producción dependiente de PGE, ya que fue impedida por el antagonismo de los receptores EP. Sin embargo, debido a que los inhibidores de la PGT verde de bromocresol o bromosulfoftaleína no previnieron la muerte celular (Fig. 2f y Figura complementaria 2d), es más probable quehipoxiaLa muerte de células HK-2 inducida por reoxigenación está mediada exclusivamente por PGE extracelular.

HIF-1 -regulación transcripcional dependiente de COX-2(ciclooxigenasa)La expresión génica contribuye a unahipoxia-aumento inducido en iPGE, en células HK-2 tubulares proximales. La biosíntesis de PGE implica la liberación de los glicerofosfolípidos de la membrana del ácido araquidónico por la fosfolipasa A, seguida de la conversión por las isoenzimas COX del ácido araquidónico en prostaglandina H y, finalmente, por la isomerización de la glándula prosta en H, a PGE, por la prostaglandina E sintasa. como la PGE sintasa microsomal-1 (mPGES-1)19. hemos encontrado quehipoxia-la apoptosis inducida en las células HK-2 probablemente esté mediada por una COX-2(ciclooxigenasa)-aumento dependiente de la producción de PGE,(Fig.2). Dado que COX-2(ciclooxigenasa)es una enzima cuya expresión puede ser inducida porhipoxia, planteamos la hipótesis de que unhipoxiaEl aumento inducido de PGE, la producción en células HK-2 podría ser la consecuencia de un aumento en la expresión de COX-2(ciclooxigenasa). Para confirmar nuestra hipótesis, estudiamos (i) el efecto dehipoxiaen la expresión de COX-2(ciclooxigenasa)proteína y mRNA y (ii) el efecto de COX-2(ciclooxigenasa)inhibidor celecoxib en elhipoxiaaumento inducido en iPGE, nuestros resultados indicaron quehipoxiadeterminado de manera transitoria regulación positiva transcripcional de COX-2(ciclooxigenasa)expresión (Fig. 3a,b) y que COX-2(ciclooxigenasa)inhibición mitigó el aumento de iPGE, en células HK-2 bajohipoxia(Fig. 3c). Curiosamente,hipoxiatambién determinó la regulación positiva transitoria de la expresión de la proteína mPGES-1 (Fig. 3a, recuadro), pero no afectó la expresión del ARNm de mPGES-1 (Fig. 3b. recuadro). Estos resultados indicaron que una mayor expresión de COX-2(ciclooxigenasa)y mPGES-1 es responsable de lahipoxiaaumento inducido en iPGE.

Figura 3. Regulación transcripcional de COX dependiente de HIF-la-2(ciclooxigenasa)la expresión génica contribuye al aumento de iPGE inducido por hipoxia, en células HK-2 tubulares proximales.(a) La expresión de COX-2(ciclooxigenasa)la proteína se incrementa transitoriamente porhipoxia(Análisis de Western Blot). Recuadro: la proteína de expresión mPGES-1 también se regula transitoriamente porhipoxia. (b)Expresión COX-2(ciclooxigenasa)El ARNm se incrementa transitoriamente porhipoxia. Recuadro: La expresión de mPGES-1 mRNA no se ve afectada porhipoxia. (c)Prevención por celecoxib, una COX-2(ciclooxigenasa)inhibidor, del aumento de iPGE, inducido porhipoxia. Las células se preincubaron durante 1 h con celecoxib 3 μM. Se muestra inmunofluorescencia dependiente de PGE∶ izquierda sola o combinada con tinción nuclear con DAPI (aumento original, 40x). Derecha: enfoque cuantitativo de las imágenes presentadas en el panel izquierdo utilizando el software Image J. (d) Contribución de los mecanismos transcripcionales. Izquierda: el inhibidor transcripcional actinomicina D (Act. D) previene unahipoxiaaumento inducido en la COX-2(ciclooxigenasa)expresión de proteínas (análisis de transferencia Western). Las células se pretrataron durante 1 hora con 1 ug/ml de Act. D antes de ser expuesto ahipoxiadurante 3 h. Derecha: Aumento de la actividad de una COX-2(ciclooxigenasa)construcción reportera. (e) El inhibidor de HIF-la YC-1 previenehipoxiaCOX transcripcional inducida-2(ciclooxigenasa)regulación al alza. Las células se preincubaron durante 1 h con 00,5 uM YC-1. Izquierda: Prevención de COX-2(ciclooxigenasa)regulación al alza. Las células fueron expuestas ahipoxiadurante 8 h. Centro: Prevención del aumento de la actividad de una COX-2(ciclooxigenasa)construcción reportera. Derecha: Inhibición de la actividad de una construcción informadora impulsada por HRE. Las células fueron expuestas ahipoxiadurante 8 h. (f) el inhibidor de HIF-la YC-1 aumenta la muerte celular apoptótica (estudios de citometría de flujo). Antes de estar expuesto ahipoxia, las células se preincubaron durante 1 h con 0.5 μM YC-1. Inset∶ YC-1 inhibe elhipoxiaaumento inducido en la expresión HIF-1a (análisis de transferencia Western). Información general: (1) Las células se incubaron durante 24 h en condiciones normóxicas (21 por ciento de O) o hipóxicas (1 por ciento de O), como se indica en "Métodos". (2) Las microfotografías son ejemplos representativos de tres experimentos independientes. (3)Análisis de transferencia de Western: se confirmó la igualdad de proteínas al sondear con un anticuerpo anti- -actina (4) Barras y barras de error en los gráficos: cada barra representa la media ± SEM de 3 experimentos diferentes *P<0.01 vs.="" other="">

Examinar más a fondo la contribución de los mecanismos transcripcionales al aumento de la COX-2(ciclooxigenasa)expresión de proteínas bajohipoxia, expresión de COX-2(ciclooxigenasa)se evaluó en células HK-2, que se preincubaron con el inhibidor de la transcripción actinomicina D antes de someterse ahipoxiadurante 5 h. Como se muestra en la figura 3d,hipoxiaaumento inducido en la COX-2(ciclooxigenasa)la expresión de proteínas fue impedida por actinomicina D. Además,hipoxiatambién determinó un aumento en la actividad de una COX-2(ciclooxigenasa)construcción promotora previamente transfectada en células HK-2 (Fig. 3d derecha). Tomados en conjunto, los resultados que se muestran en la Fig. 3d sugieren que los mecanismos transcripcionales contribuyen a unahipoxiaaumento inducido en la COX-2(ciclooxigenasa)expresión de proteínas. Sin embargo, hubo una discrepancia entre el momento de la activación del promotor COX-2 y el momento de la COX máxima-2(ciclooxigenasa)Expresión de ARNm: mientras que el aumento transitorio de COX-2(ciclooxigenasa)La expresión de ARNm fue máxima después de 2 h (Fig. 3b), el promotor COX-2 se activó después de 3 h (Fig. 3d), lo que probablemente refleja la contribución de los mecanismos postranscripcionales al aumento de COX{{6 }}(ciclooxigenasa)expresión4. En consecuencia, especulamos que COX-2(ciclooxigenasa)El ARNm se estabiliza bajohipoxia, lo que daría como resultado un aumento de los niveles de COX-2(ciclooxigenasa)expresión de ARNm sin ninguna contribución (en ese momento) de aumento de la actividad de la COX-2(ciclooxigenasa)promotor. Sin embargo, también es posible que un lapso de tiempo entre la activación del promotor y la acumulación de sustrato medible también pueda contribuir a la discrepancia entre el momento de la activación del promotor de la COX-2 y el momento de la COX máxima{{1 }}(ciclooxigenasa)expresión de ARNm.

HIF-1 es un factor de transcripción heterodimérico compuesto por la subunidad dependiente de oxígeno y la subunidad expresada constitutivamente. Por debajohipoxia, HIF-1 se acumula y entra en el núcleo, donde genera el factor de transcripción HIF-1 después de dimerizarse con HIF-1 . HIF-1 luego promueve la expresión de sus genes diana uniéndose ahipoxia-elementos sensibles (HRE) presentes en su región reguladora y posteriormente orquestan respuestas celulares adaptativas para combatirhipoxia 3. Dado quehipoxiapuede activar COX-2(ciclooxigenasa)expresión de manera dependiente de HIF-1-a través de un HRE funcional presente en la secuencia del promotor COX-22, examinamos el papel de HIF-1 en unhipoxiaaumento inducido en la COX-2(ciclooxigenasa)expresión. También analizamos la actividad de una construcción promotora de COX-2 transfectada en células HK-2. Como se muestra en la Fig. 3e, la preincubación con el HIF-1un inhibidor YC-1, que embotóhipoxiaEl aumento inducido en la expresión de HIF-la y la actividad de una construcción informadora HRE resultó en la prevención del aumento en la expresión de COX-2(ciclooxigenasa)y actividad de la COX-2(ciclooxigenasa)construcción promotora en HK-2 sujeta ahipoxia. En resumen, los resultados que se muestran en la Fig. 3a-e respaldan la noción de que HIF-1 -regulación positiva transcripcional dependiente de COX-2(ciclooxigenasa)es responsable de lahipoxiaaumento inducido en iPGE2.

Aunque las consecuencias de la activación de HIF-1a enhipoxia-inducida por la apoptosis son controvertidas (probablemente porque pueden depender del contexto), analizamos (de manera preliminar) el papel de HIF-1a en nuestro sistema experimental. Dado que anteriormente hemos encontrado esa intervención en la COX-2(ciclooxigenasa)/iPGE, la vía del receptor EP inhibe el aumento de la expresión de HIF-la desencadenada porhipoxia8,56 preguntamos si la inhibición de HIF-la resulta en la prevención dehipoxiainducida por la apoptosis de las células HK-2. Como se muestra en la Fig. 3f, la preincubación con YC-1, un inhibidor de HIF-1, en realidad aumentóhipoxia-apoptosis inducida. Por lo tanto, es poco probable que HlF-la

Discusión

Tejidohipoxiase cree que es críticamente relevante en la fisiopatología tanto de la enfermedad renal crónica como de la lesión renal aguda, siendo el PTC la porción más susceptible de los túbulos renales contrahipoxia. Aquí examinamos el papel de PGE, en el daño infligido porhipoxiaa PTC humano y descubrió que el aumento de la producción de iPGE se originó a partir de la regulación positiva de COX dependiente de HIF-la-2(ciclooxigenasa)la expresión génica y el aumento de la expresión de mPGES-1, contribuye ahipoxiamuerte celular apoptótica inducida en células HK-2. Dado que la hipoxia tubular es un factor relevante tanto para la enfermedad renal aguda como crónica-2, estos resultados apuntan al transportador de prostaglandinas PGT como una nueva diana terapéutica en enfermedades renales.

Hipoxiano solo aumenta la iPGE, sino también su liberación al medio extracelular8, por lo que la PGE (extracelular) secretada también podría desempeñar un papel enhipoxia-apoptosis inducida (por ejemplo, desencadenando cascadas apoptóticas a través de la activación canónica de los receptores EP ubicados en la membrana celular). Dos estudios previos han demostrado que la muerte celular bajohipoxiatambién se debió a COX-2(ciclooxigenasa)-producción dependiente de PGE,1345. Por otro lado, en ciertos tipos de células (fibroblastos, microglía, neuronas y líneas celulares de leucemia linfoblástica aguda), la apoptosis inducida por PGE está mediada por la activación dependiente de PGE de los receptores EP46-48. Hemos encontrado aquí quehipoxiaLa apoptosis de las células HK-2 inducida también fue prevenida por el antagonismo de los receptores EP (Fig. 2a, panel superior, derecha). Pero debido a que los receptores EP se han descrito clásicamente como receptores de membrana plasmática, por lo que son inaccesibles para iPGE2-especulamos que los receptores EP que median el efecto apoptótico de iPGE, en las células HK hipóxicas-2 son un subconjunto ubicado intracelularmente (es decir, receptores iEP).

En contraste con el papel de iPGE2 enhipoxiainducida por apoptosis en células HK-2, encontramos que solo la PGE extracelular mediahipoxia/muerte de células HK-2 inducida por reoxigenación porque no fue prevenida por inhibidores de PGT (Fig. 2f). Aunque los mecanismos patológicos de lesión celular después dehipoxia/reoxigenación no se entienden completamente, se acepta que la muerte celular se produce en gran medida a través de la producción excesiva de especies reactivas de oxígeno (ROS). Esto es particularmente cierto para las células HK-249,50. Sin embargo aunquehipoxiatambién puede aumentar la producción de ROS, hasta donde sabemos, no hay evidencia de que ROS juegue un papel relevante enhipoxia-inducida por la muerte de las células HK-2. Esto sugiere que los efectos letales de la hipoxia y la hipoxia/reoxigenación en las células HK-2 están mediados por diferentes mecanismos, lo que podría explicar por qué BG y BS protegen contrahipoxiapero no contrahipoxia/reoxigenación. En consecuencia, la inhibición de la PGT podría proporcionar beneficios terapéuticos en la PTC frente a la lesión celular inducida por hipoxia, pero no frente al efecto deletéreo de la misma.hipoxia/reoxigenación.

HIF-1 -regulación ascendente dependiente de COX-2(ciclooxigenasa)fue un evento crítico parahipoxia-apoptosis de células HK-2 inducida (Fig. 3e). Sin embargo, nuestra observación de que el inhibidor de HIF YC-1 mejoró la muerte celular apoptótica (Fig. 3f) es desconcertante, aunque informes anteriores ya han mostrado resultados similares1. Una posible explicación es un escenario hipotético en el que HIF-la no solo media la regulación positiva proapoptótica de COX-2(ciclooxigenasa)sino también la regulación positiva de las moléculas protectoras. De hecho, HIF-1-regulaba la expresión de moléculas protectoras contrahipoxiacomo el ARN largo no codificante DARS-AS1' y el microARN-2103 se ha encontrado específicamente en las células HK-2. Sin embargo, aunque estas pruebas respaldan nuestro escenario hipotético, se deben realizar experimentos específicos para confirmarlo.

Investigación de la respuesta de las células renales ahipoxiapuede mejorar nuestra comprensión de la patología renal. Hemos estudiado, aunque de manera preliminar, el papel de un aumento en la proporción de expresión de la proteína pro-apoptótica Bax a la proteína anti-apoptótica Bcl-2 enhipoxia-apoptosis inducida en células HK-2. Nuestros resultados indicaron que la inhibición de PGL no produjo cambios compatibles con un cambio antiapoptótico en el equilibrio entre la expresión de Bcl-2 y Bax (Fig. 2e), lo que no respalda el papel de estas proteínas en Muerte celular HK-2 dependiente de iPGE bajohipoxia. Hasta donde sabemos, solo hay dos estudios sobre la implicación del eje Bcl{{0}}/Bax en la apoptosis inducida por hipoxia en PTC y ambos involucraron concentraciones anóxicas o casi anóxicas de O,5 Cuando se expuso PTC al 0,2 por ciento de O., la expresión de Bax permaneció sin cambios y la apoptosis se vinculó con un grado de expresión reducido de Bcl-2 Sin embargo, la expresión de Bcl-2 no se vio afectada por el 1 por ciento de O, a pesar de la presencia de apoptosis, lo cual es coincidente con nuestros resultados, por lo tanto, se deben considerar otros mecanismos que no necesariamente implican cambios cuantitativos en la expresión de Bcl-2 o Bax: por ejemplo, la inducción de apoptosis en células de glioma cultivadas por iPGE2 solo requiere su asociación física con Bax, que desencadena la translocación de Bax a la mitocondria 202. Por lo tanto, el mecanismo a través del cual la iPGE contribuye a la apoptosis de las células HK-2 merece más estudio.

Nuestro grupo ha encontrado que una COX-2(ciclooxigenasa)dependiente de iPGE, media la muerte apoptótica en células HK-2 expuestas a cisplatino, cuerpos apoptóticos7" yhipoxia(nuestros resultados actuales). Debido a que la PGE se libera rápidamente al exterior de la célula después de ser sintetizada2, su transporte hacia el interior por parte de la PG1 juega un papel fundamental en la apoptosis inducida por la iPGE en las células HK-2. Por lo tanto, siempre que el daño del PTC esté mediado por iPGE, el tratamiento con inhibidores de PGT podría ser un enfoque terapéutico útil con aplicaciones potenciales como la prevención del daño del PTC inducido por cisplatino, la inhibición de la propagación del daño tubular a través de cuerpos apoptóticos o la limitación de la efecto nocivo dehipoxiaen PTC.