Efecto terapéutico del cistanosido A sobre el metabolismo óseo de ratones ovariectomizados

1. Introducción

La osteoporosis, un "asesino silencioso" esquelético sistémico, se ha convertido en un importante peligro para la salud que afecta a más de 2.000 millones de personas en todo el mundo en los últimos años.. Se caracteriza por una baja densidad de masa ósea (DMO) y un deterioro de la microarquitectura, que derivan de un exceso de resorción ósea sobre la formación ósea y, finalmente, resultan en fractura osteoporótica.. Hoy en día, la identificación de agentes que bloqueen la diferenciación y resorción osteoclástica es la estrategia común y exitosa para el desarrollo de fármacos terapéuticos para la osteoporosis., y de hecho existen muchos agentes sintéticos, incluidos el valerato de estradiol y el alendronato sódico, que podríanprevenir y tratar la osteoporosis. Sin embargo, los medicamentos para las enfermedades están lejos de ser ideales; Algunos de estos medicamentos podrían aumentar el riesgo de cáncer de endometrio y de mama y además tener cierto grado de efectos secundarios, como hipercalcemia, hipercalciuria, etc., que limitan sus aplicaciones clínicas. Por lo tanto, durante más de un milenio, las medicinas tradicionales chinas (MTC), especialmente las comestibles con fracciones y compuestos bioactivos aislados, se han utilizado ampliamente de forma segura y eficaz en los países asiáticos para prevenir y tratar diversas enfermedades, incluida la osteoporosis.. 

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La osteoporosis se caracteriza por una mayor resorción ósea debido a un aumento de la osteoclastogénesis, y este proceso implica el compromiso de los monocitos hematopoyéticos en precursores de osteoclastos, que se fusionan para formar osteoclastos multinucleados que se dirigen a los sitios óseos en remodelación [4]. El activador del receptor del ligando del factor nuclear κB (RANKL), un factor clave secretado por los osteoblastos, estimula la diferenciación de monocitos en osteoclastos [8,9]. La interacción de RANKL con su receptor RANK da como resultado una cascada de eventos intracelulares, que incluyen NF-κB, PI3K/Akt y quinasa dependiente de calcio/calmodulina mediante el reclutamiento de la proteína señal adaptadora factor asociado al receptor de TNF (TRAF6). Como resultado, varios genes marcadores relacionados con los osteoclastos, incluidos TRAP, catepsina K y DPD, están regulados positivamente y se acelera el proceso de resorción ósea.

Los glucósidos feniletanoides se caracterizan por restos de ácido cinámico e hidroxifeniletilo que están unidos a una -glucopiranosa (apiosa, galactosa, ramnosa, xilosa, etc.) a través de un enlace glicosídico, que se distribuye ampliamente en las plantas medicinales [10]. El cistanosido A (Cis A) es un activoglucósido feniletanoideen Cistanche deserticola YC Ma. Según el registro de la farmacopea china, C. deserticola se utilizaba tradicionalmente para tratar la deficiencia de yin renal, debilidad muscular, debilidad lumbar, etc., y los glucósidos feniletanoides son los principales componentes bioactivos de esta hierba [11]. Según la teoría del "riñón" de la medicina tradicional china, el riñón podría gobernar el sistema óseo, lo que significa que el desarrollo y las funciones de los huesos dependen de la esencia del riñón, y esta esencia del riñón puede transformarse en la médula ósea para nutrir los huesos. promover el crecimiento y la reparación del esqueleto y fortalecer el esqueleto [12]. Como C. deserticola podría fortalecer el riñón, supusimos que Cis A podría prevenir y tratar la osteoporosis. Por lo tanto, el presente estudio fue diseñado para validar el potencial deCis A en la prevención de la osteoporosismediante el uso de un modelo de ratones ovariectomizados, se determinaron marcadores de formación y resorción ósea, así como los mecanismos potenciales relacionados para estimar la bioactividad antiosteoporótica de este agente.

2. Resultados y Discusión

2.1. Resultados

2.1.1. Efectos de Cis A en la prueba de flexión de tres puntos óseos

Para analizar si el tratamiento con Cis A fortalece el hueso, sometimos los fémures a la prueba de flexión de tres puntos. Como se muestra en la Figura 1, la carga máxima aplicada cuando el hueso se rompe fue 21,5% y 22,0% mayor en los animales tratados con 20 mg/kg y 80 mg/ kg Cis A, respectivamente, en comparación con los animales del grupo ovariectomizado (OVX) (p < 0.05). Mientras tanto, el tratamiento con Cis A también mejoró la rigidez ósea; todos los ratones tratados con Cis A mostraron un aumento significativo de la rigidez con datos de 121,{27}} ± 12,1 (p < 0,05), 124,1 ± 16,2 (p < 0,05) y 127,7 ± 9,6 (p < 0,01), respectivamente. en comparación con 102,2 ± 10,7 de los ratones OVX. Los resultados indican que el aumento de la resistencia ósea en los ratones OVX tratados con Cis A se debió a una mayor cantidad de hueso y a una mejora de la calidad ósea.

2.1.2. Efectos de Cis A sobre la microarquitectura ósea

La microarquitectura tridimensional del hueso trabecular de ratones medida por micro-CT (Figura 2 y Tabla 1) muestra intuitivamente que los ratones del grupo OVX presentaron una reducción notable en el área trabecular y el número trabecular en comparación con el grupo simulado, lo que indica que la ovariectomía podría inducir una disminución notable en la densidad de masa ósea (DMO, −46%), el contenido mineral óseo (BMC, −66%), el contenido mineral tisular (TMC, −85%), la fracción de volumen óseo (BVF, −82%), número trabecular (Tb. N, −76%) y un aumento en la separación trabecular (Tb. Sp, +80%) sin ninguna modificación en la densidad mineral tisular total (DTM) y el espesor trabecular (Tb. Th) después de la funcionamiento de 12 semanas. Sin embargo, los ratones OVX tratados con Cis A dieron como resultado un aumento de la DMO dependiente de la dosis (+43%~57%), BMC (+65%~73%), TMC (+83%~ 90%), BVF (+80%~88%), mayor reducción de Tb. Sp (−79%~88%) y Tb mejorada aún más. N (+73%~82%) en comparación con el grupo OVX. El TMD no pareció verse influenciado por la ovariectomía, pero aumentó significativamente con el tratamiento con valerato de estradiol (EV).

2.1.3. Efectos de Cis A tanto en los marcadores de formación como de resorción ósea

Los efectos de Cis A sobre los marcadores de resorción ósea, incluidos TRAP, DPD, índice de formación ósea de catepsina K ALP y proteína Gla ósea (BGP), se muestran en la Figura 3. Después de 12 semanas de operación de ovariectomía, las actividades de TRAP, DPD y la catepsina K en el grupo OVX aumentaron significativamente, especialmente la DPD, que aumentó casi un 55,6%; TRAP y catepsina K mejoraron en un 43,5% y un 38,1%, respectivamente, en comparación con el grupo simulado. Cis A, administrado por vía oral durante 12 semanas, demostró un potencial notable para prevenir todos los marcadores de resorción ósea mencionados anteriormente, especialmente la dosis alta (80 mg/kg) que exhibe un efecto significativo en la supresión de las actividades de DPD. en un 45,0%, TRAP en un 49,0% y catepsina K en un 44,0%, respectivamente (p < 0.01), en comparación con el Grupo OVX (Figura 3). Aunque se demostró una tendencia creciente de las actividades de ALP y BGP en el grupo OVX, no se observaron cambios estadísticamente significativos. Sin embargo, se observó una mejora significativa en la actividad de ALP en los grupos tratados con Cis A bajo y alto en comparación con el grupo simulado (p <0,01).

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2.1.4. Efectos de Cis A sobre los niveles de expresión de proteínas de TRAF6, NF-κB PI3K, Akt, OPG y RANKL

El análisis de transferencia Western reveló que, en comparación con el grupo simulado, los niveles de proteína de TRAF6, NF-κB y RANKL en el grupo OVX aumentaron significativamente (p < 0.05), mientras que OPG, PI3K y Akt disminuyeron significativamente (Figura 4). Cis A (20 mg/kg o 80 mg/kg) redujo significativamente la expresión de TRAF6 (p < 0,05), seguido de una disminución de la expresión de RANKL y un aumento de OPG, lo que significa que la relación OPG/RANKL aumentó. En consecuencia, las cascadas de señalización de NF-κB se regularon negativamente y PI3K/Akt se regularon positivamente mediante el tratamiento con Cis A (p <0,05).

2.2. Discusión

Dadas las limitaciones de las opciones terapéuticas actuales para la enfermedad de osteoporosis, existe la necesidad de alternativas a partir de alimentos o plantas medicinales comestibles naturales. Como parte de nuestro esfuerzo continuo por descubrir agentes antiosteoporóticos eficaces a partir de la medicina tradicional china, encontramos una serie de extractos, fracciones y compuestos que poseen el efecto de propiedades antiosteoporóticas [13,14]. Cistanche deserticola es una MTC clásica importante, que posee un perfil de seguridad favorable [15] y amplias funciones medicinales para el tratamiento de la deficiencia renal, etc. [16]. Según la teoría de la medicina tradicional china, la medicina tradicional china que posee el efecto de tonificar el riñón generalmente seutilizado para tratar la osteoporosis; Los glucósidos feniletanoides son los principales componentes bioactivos de esta hierba, lo que implica queglucósidos feniletanoidescontenido en C. deserticola puede poseer una propiedad antiosteoporótica. Se demostró que el extracto de C. deserticola podría inhibir significativamente la reducción de la DMO y prevenir el deterioro de la microarquitectura trabecular causado por OVX [17]. En el experimento in vitro, también aumentó significativamente la FA, la proteína morfogenética ósea -2 y el ARNm de osteopontina, así como la mineralización ósea de los osteoblastos cultivados [18]. El equinacósido, un componente bioactivo principal de C. deserticola registrado oficialmente en la farmacopea china [11], exhibió actividad antiosteoporótica con una dosis alta de 30 ~ 270 mg/kg de peso corporal/día [19], y otros resultados in vitro mostraron que podría promover la regeneración ósea aumentando la proporción de OPG/RANKL en las células MC3T3-E1 Subclone 14 [20]. Cis A fue uno de los glucósidos de feniletanol aislados de C. deserticola, y varios informes revelaron que este compuesto poseía actividad antioxidante [21] y propiedades antiinflamatorias [22,23]. Un artículo publicado recientemente descubrió que Cis A exhibía actividades protectoras tanto sobre CCl4 como sobre la hepatotoxicidad inducida por alcohol en ratones, y también mostró una propiedad protectora sobre el daño inducido por etanol en hepatocitos de ratón cultivados primarios in vitro [24]. En nuestro presente estudio, los resultados mostraron que Cis A poseía actividad antiosteoporótica en una dosis baja (20 ~ 80 mg/kg de peso corporal/día) utilizando un modelo de ratones ovariectomizados, y esta bioactividad se ejerció regulando negativamente el nivel de TRAF6, suprimiendo la expresión de RANKL y NF-κB y la estimulación de OPG, PI3K y Akt, lo que significa que el efecto terapéutico de Cis A en ratones OVX se produjo a través del mecanismo de inactivación de NF-kappaB mediada por TRAF6- y activación de PI3K/Akt.

Es bien sabido que la ovariectomía puede causar osteoporosis con una disminución evidente de la DMO, la resistencia biomecánica, la calidad del hueso y la microarquitectura del hueso trabecular, y los cambios anteriores se deben en parte a la deficiencia de estrógenos [25]. Ahora, en el presente experimento in vivo, nuestro estudio demuestra que la osteoporosis inducida por ovariectomía resultó en una reducción significativa en la fuerza biomecánica y los parámetros estructurales trabeculares, incluidos DMO, BMC, TMC y Tb. N, y aumentando Tb. Sp; y el tratamiento con Cis A mejoró significativamente las propiedades mecánicas óseas, incluida la carga máxima y la rigidez, mejoró la DMO y mejoró la mayoría de los parámetros estructurales de la microarquitectura trabecular ósea en comparación con los ratones del grupo OVX, lo que indica que Cis A fue eficaz para mejorar la calidad ósea. y microarquitectura trabecular en ratones OVX.

Además de la DMO total, la prueba de flexión de tres puntos y la medición de la microarquitectura del hueso trabecular podrían diagnosticar directamente la osteoporosis, los marcadores de formación ósea, incluidos ALP y BGP, y el índice de resorción ósea, incluidos TRAP, DPD y catepsina K, también se emplearon para dilucidar los mecanismos antiosteoporóticos relacionados de Cis A. En nuestro estudio, la actividad de ALP en los ratones del grupo OVX demostró una tendencia creciente no significativa, lo que indicó una mayor tasa de recambio óseo [26,27] en la osteoporosis posmenopáusica; la dosis alta (80 mg/kg de peso corporal/día) y baja (20 mg/kg de peso corporal/día) de los tratamientos con Cis A mostraron una mejora significativa en la actividad de ALP en comparación con el grupo simulado, mientras que la actividad de BGP no pareció verse influenciada por la ovariectomía en todos los grupos tratados; TRAP, DPD y catepsina K aumentaron significativamente en el grupo OVX, y la administración de Cis A disminuyó notablemente los tres marcadores de resorción ósea. Los datos anteriores implicaban que Cis A poseía actividad antiosteoporótica potencial, y este efecto era ejercido por la regulación del metabolismo óseo, incluida la supresión de la resorción ósea y el aumento de la formación ósea.

La coordinación entre osteoblastos y osteoclastos es un factor crítico en el mantenimiento de la integridad esquelética. Los osteoclastos, que expresan TRAP, se adhieren a la superficie del hueso mediante la formación de zonas de sellado unidas a actina, dentro de las cuales se liberan enzimas proteolíticas, como la catepsina K, lo que lleva a la formación de fosas de resorción. La modulación de la osteoclastogénesis por células inmaduras del linaje osteoblástico está mediada por RANKL y OPG [28]. OPG es un receptor señuelo que inhibe la activación de la osteoclastogénesis por RANKL, disminuyendo así la resorción ósea. RANKL, que proporciona una señal importante a los progenitores de osteoclastos, es una molécula unida a la membrana de la familia de ligandos del factor de necrosis tumoral que promueve la formación de osteoclastos. Se cree que la relación de expresión de OPG/RANKL es un parámetro clave de la actividad osteoclastogénica, y las cascadas de señalización activadas por RANKL incluyen las vías NF-κB y PI3K [29]. La importancia de la vía NF-κB para la osteoclastogénesis queda demostrada por el hecho de que la eliminación de NF-κB en ratones resultó en la ausencia de osteoclastos maduros [30]. Se demostró que TRAF6 es un objetivo prometedor para nuevos fármacos antiosteoporóticos. Los ratones con deficiencia de TRAF6-que presentaban osteoclastogénesis defectuosa y osteopetrosis grave demostraron así la importancia de TRAF6 en el metabolismo óseo. La evidencia emergente apunta a una función reguladora crítica para TRAF6 en las cascadas de señalización mediadas por RANKL/RANK [4,31]. Los datos del estudio actual indicaron que el tratamiento con Cis A en los ratones OVX dio como resultado una regulación negativa de los niveles de expresión de la proteína TRAF6, una disminución de RANKL y un aumento de las expresiones de OPG, evitando así la activación de RANKL de NF-κB en sentido descendente y activando las vías de señal PI3K/Akt. lo que sugiere que Cis A inhibe la diferenciación de osteoclastos mediante la inactivación de NF-kappaB mediada por TRAF6- y la activación de PI3K/Akt y aumenta la relación OPG/RANKL, inhibiendo posteriormente la osteoclastogénesis y promoviendo la formación de hueso.

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3. Materiales y métodos

3.1. Materiales Vegetales, Preparación y Determinación

Tallos de Cistanche deserticolaYC Ma, identificado por el Prof. Xue-yan Fu del Departamento de Farmacia de la Universidad Médica de Ningxia, se recogieron el 2015 de septiembre en el condado de Yongning, provincia de Ningxia, China. En el herbario del departamento de farmacia se conservó un espécimen de vale (#20150901). Un total de 30,0 kg de tallos de C. deserticola secados al aire se extrajeron a reflujo con etanol al 70% (180 l, 3 × 2 h) 3 veces. Los filtrados se combinaron y se sometieron a una columna de resina macroporosa (AB-8) con un sistema de disolventes en gradiente gradual de etanol creciente en agua (0 %, 20 % y 60 %, cada 60 l) para dar tres fracciones, luego El 60 % de la fracción se purificó adicionalmente mediante Sephadex LH-20 (Pharmacia Biotech Co., Uppsala, Suecia) y cromatografía líquida semipreparativa de alta resolución (Agilent 1100, Agilent Technologies, Waldbronn, Alemania) para obtener color amarillo pálido. cistanósido A 4,5 g (Cis A; el rendimiento fue del 0,015%). La estructura se dilucida principalmente mediante análisis de datos de RMN (Bruker Avance, 400 MHz, Alemania) y espectros de MS (Agilent 6540, Agilent Technologies), que fueron consistentes con los datos reportados [19]. Su pureza se determinó mediante el método de normalización de áreas de HPLC (Figura 5). En experimentos con animales, según nuestro experimento preliminar, la dosis de Cis A fue de 20 a 80 mg/kg/día.

3.2. Productos químicos y disolventes

Se utilizaron los siguientes: kit de extracción de proteínas totales y kits de cuantificación de proteínas BCA (Ken Gen Biotech. Co. Ltd, Nanjing, China), anticuerpos primarios de TRAF6, NF-κB, PI3K, Akt, RANKL, OPG, -actina y tubulina ( Cell Signaling Technology, Beverly, MA, EE. UU.), anticuerpos secundarios de IgG anti-conejo de cabra conjugada con peroxidasa de rábano picante (ZSGB-BIO, Beijing, China), valerato de estradiol (1 mg, Delpharm Lille SAS, París, Francia), Gla óseo kits ELISA de reticulación de proteínas y desoxipiridinolina (Xinyu Biological Engineering Co. Ltd., Shanghai, China) y el kit ELISA de catepsina K (Biovision, Mountain View, CA, EE. UU.). Todos los demás productos químicos y agentes bioquímicos utilizados fueron reactivos de grado analítico AR.

3.3. Experimentos con animales

Se compraron sesenta ratones hembra de la cepa Kunming, de 8 semanas de edad y un peso corporal de 26,0 ± 1,62 g, de la Universidad Médica de Ningxia, y se mantuvieron 10 ratones en una jaula con una dieta de laboratorio estándar. y agua del grifo en condiciones de aire controlado (24,0 ± 0,5 ◦C, 45 %–50 % de humedad y ciclos de iluminación de 12 h/12 ​​h de luz y oscuridad). Después de aclimatarse durante 1 semana, la cirugía se realizó en condiciones asépticas y todos los ratones se anestesiaron con hidrato de cloral (100 mg/kg, ip); los ratones que fueron sometidos a exposición quirúrgica sin extirpar los ovarios fueron el grupo simulado (n=10); los demás fueron sometidos a ovariectomía bilateral al igual que los grupos OVX (n=50). Los experimentos con animales anteriores se llevaron a cabo de acuerdo con la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio y fueron aprobados por el Comité de Bioética de la Universidad Médica de Ningxia.

Después de otro período de recuperación de {{0}}semana, los 50 ratones OVX anteriores se dividieron aleatoriamente e igualmente en 5 grupos: tratados por vía oral con valerato de estradiol (1 mg/kg/día) como control positivo (EV); con 20, 40 y 80 mg/kg/día de Cis A como grupos de dosis baja, moderada y alta, respectivamente; con el vehículo (carboximetilcelulosa()-Na al 0,5%) como grupo modelo (OVX). A todos los ratones se les administró por vía oral un volumen igual de 1 ml/100 g de peso corporal de vehículo, EV o Cis A, que comenzó en la segunda semana después de la operación y duró 12 semanas. El peso corporal se midió quincenalmente y la dosis se ajustó en consecuencia. Después de la última administración oral, se extrajeron muestras de sangre de la arteria femoral de ratones anestesiados, se dejaron coagular y se centrifugaron a 3000 × g durante 10 minutos para obtener suero; Se disecaron el fémur y la tibia derechos. Todas las muestras se almacenaron a -80 ◦C para una evaluación adicional de la microarquitectura ósea y los parámetros bioquímicos séricos relacionados con la osteoporosis.

3.4. Prueba de flexión de tres puntos

La propiedad biomecánica del fémur derecho del ratón se determinó utilizando una disposición de flexión de tres puntos. La plantilla para doblar tiene un soporte en forma de V para asegurar los extremos distal y proximal del fémur durante la prueba. El fémur se colocó horizontalmente con la parte anterior hacia arriba y la carga se aplicó hacia abajo en el centro de la parte media del fémur. La distancia entre los soportes fue de 8 mm. Los huesos se cargaron a una velocidad de desplazamiento constante de 0.02 mm/s hasta el fallo utilizando una máquina de prueba BOSE (3220) (Bose Corporation, Endura TEC Systems Group, Minnetonka, MN, EE. UU.). Las curvas de carga-desplazamiento se obtuvieron y utilizaron para el cálculo de las propiedades estructurales y del material, incluida la carga máxima, la carga máxima, el módulo elástico, la resistencia a la flexión, etc.

3.5. Análisis de tomografía microcomputarizada

Los fémures derechos de todos los ratones se limpiaron de tejidos blandos adheridos y la microarquitectura del hueso trabecular de la metafísica femoral distal derecha anterior se determinó mediante un escáner micro-CT (eXplore Locus SP, GE Healthcare, Londres, ON, Canadá) con la resolución isotrópica se estableció en 8 µm en las tres dimensiones espaciales. La región de interés (ROI) se seleccionó utilizando las mismas coordenadas en la placa de crecimiento del fémur. Los parámetros morfométricos óseos, incluida la DMO, el contenido mineral óseo (BMC), el contenido mineral tisular (TMC), la densidad mineral tisular (TMD), la fracción de volumen óseo (BVF), la separación trabecular (Tb. Sp), el número trabecular (Tb. N ) y el espesor trabecular (Tb. Th), se evaluaron mediante el análisis del ROI mediante el uso del software de análisis óseo ABA.

3.6. Análisis de parámetros bioquímicos

La actividad de la fosfatasa alcalina (ALP) sérica se midió en un analizador automático (Ciba-Corning 550 Diagnostics, Corp., Oberlin, OH, EE. UU.)); Los niveles séricos de DPD, BGP y catepsina K se determinaron mediante los kits de reactivos correspondientes, y la fosfatasa ácida resistente a tartrato (TRAP) se analizó de acuerdo con la literatura relacionada [32].

3.7. Análisis de Western Blot

Los niveles de expresión de proteínas de TRAF6, NF-κB PI3K, Akt, OPG y RANKL en diferentes grupos se detectaron mediante análisis de transferencia Western. Brevemente, la proteína se extrajo de la tibia derecha de ratones usando un tampón de lisis que contenía 0.5 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, proteasa e inhibidores de fosfatasa. Los lisados ​​se centrifugaron durante 10 minutos a 12,{7}} x g para obtener los sobrenadantes para su posterior análisis. La concentración de proteínas de los lisados ​​se midió utilizando un ensayo de cuantificación de ácido bicinconínico. Las proteínas (50–100 µg) se separaron usando SDS-PAGE al 10%, se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno y se incubaron con anticuerpos monoclonales primarios dirigidos a TRAF6, NF-κB RANKL, PI3K, Akt, OPG y -actina (1:500). La misma membrana fue retirada y reprobada, con señales quimioluminiscentes detectadas por el software Image Lab. -La actina o tubulina sirvió como control interno.

3.8. Análisis estadístico

Todos los datos obtenidos de experimentos con animales se analizaron mediante un análisis de varianza unidireccional con la prueba de Dennett mediante SPSS (Versión 22.0, IBM SPSS Statistics, IBM Corp., Armonk, Nueva York, NY, EE. UU. ) software; un valor de p < 0.05 se consideró estadísticamente significativo y todos los resultados se presentaron como media ± DE.

4. Conclusiones

En resumen, Cis A,glucósidos feniletanoides activosaislado de C. deserticola, mostró una actividad antiosteoporótica significativa en ratones OVX, y el mecanismo molecular puede estar relacionado con la inactivación de NF-kappaB mediada por TRAF6- y la activación de PI3K/Akt, por lo que probablemente sea un agente prometedor para el tratamiento de la osteoporosis. enfermedad.

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