Efecto terapéutico de los glucósidos feniletanoide sobre la diszoospermia inducida por ciclopfosfamida en ratones y su mecanismo

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ZHAO Dong-hail, ZHANG Lei?, ZHANG Yan², QI Ling', ZOU Xiang-ming'

Resumen: Objetivo Explorar el efecto terapéutico de los glucósidos de feniletanoide sobre la diszoospermia inducida por ciclofosfamida (CTX) en ratones y dilucidar preliminarmente los mecanismos involucrados en el proceso. Métodos El glucósido feniletanoide se extrajo mediante extracción con etanol. Cuarenta ratones BALB/C macho se dividieron aleatoriamente en un grupo de control, un grupo modelo, un grupo de dosis baja de glucósidos feniletanoide (50 mg·kg-I) y un grupo de dosis alta de glucósido feniletanoide (100 mg). ·kg-). Con excepción del grupo control, el modelo de ratón con diszoospermia se estableció mediante inyección peritoneal de CTX a la dosis diaria de 80 mg·kg-i, una vez al día durante 5 días sucesivos. Después del modelado, los glucósidos feniletanoides se administraron por vía intragástrica en las dosis correspondientes a cada grupo de glucósidos feniletanoides. Se administró un volumen igual de solución salina normal a los ratones del grupo de control y del grupo modelo mediante gastrogavaje. Toda la medicación se realizó una vez al día durante 30 d sucesivos. El tejido testicular se obtuvo 24 h después de la última administración intragástrica. El nivel de testosterona en el homogeneizado de tejido testicular se determinó mediante ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas. Se compararon los recuentos de espermatozoides, las tasas de motilidad y las tasas de teratozoospermia en varios grupos. Los cambios morfológicos del tejido testicular se observaron mediante tinción con HE. Resultados En comparación con el grupo de control, el conteo de espermatozoides y la tasa de motilidad disminuyeron, la tasa de teratozoospermia aumentó y el nivel de testosterona en el homogeneizado de tejido testicular disminuyó en el grupo modelo (P<0.01). compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" sperm="" counts="" and="" the="" motility="" rates="" were="" increased,="" the="" teratozoospermia="" rates="" were="" decreased,="" and="" the="" testosterone="" levels="" in="" the="" testis="" tissue="" homogenate="" were="" increased="" in="" phenylethanoid="" glycosides=""><0.05 or=""><0,01). the="" histological="" results="" showed="" atrophy="" and="" degeneration="" of="" seminiferous="" tubule,="" thicker="" seminiferous="" epithelium,="" and="" azoospermic="" lumina="" in="" the="" model="" group;="" the="" number="" of="" seminiferous="" epithelial="" layers="" was="" increased="" and="" the="" seminiferous="" cells="" orderly="" arranged,="" and="" many="" sperms="" were="" found="" in="" the="" tubules="" in="" phenylethanoid="" glycosides="" groups.="" conclusion="" phenylethanoid="" glycosides="" have="" obviously="" therapeutical="" effects="" on="" ctx-induced="" dyszoospermia="" in="" mice,="" and="" their="" mechanisms="" might="" be="" correlated="" with="" recovering="" the="" testosterone="">

Palabras clave: glucósidos feniletanoides; ciclofosfamida; deterioro espermatogénico; ratones, BALB/C

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Debido a la aceleración del ritmo social, los malos hábitos de vida y la contaminación ambiental, entre otros factores, la calidad anormal del esperma, como la oligospermia y la astenospermia, se ha convertido en la principal causa de infertilidad masculina [1]. En la actualidad, existen menos fármacos para tratar la oligospermia y la astenospermia, y el efecto terapéutico no es evidente. Las prescripciones de la medicina tradicional china o los ingredientes activos tienen buenos efectos en la mejora de la función reproductiva masculina [2-6]. Sin embargo, debido a la gran variedad de medicamentos recetados, la relación entre los efectos farmacológicos y los ingredientes efectivos del medicamento no está clara, lo que limita la promoción y aplicación de los medicamentos espermatogénicos. La investigación y el desarrollo de ingredientes efectivos de la medicina tradicional china y el estudio de sus efectos terapéuticos en lesiones reproductivas tienen un buen valor de aplicación. losglucósidos de feniletanoideen Cistanche cistanche es uno de los principios activos más importantes de Cistanche. Suelen ser glucósidos naturales que contienen enlaces éster y oxo-glucósido con -glucosa como núcleo. Están ampliamente presentes en las plantas dicotiledóneas 7]. Los estudios [8] han demostrado que los glucósidos de fenetanol de Cistanche pueden proteger el esperma de rata del daño oxidativo in vitro, pero no hay informes sobre su espermatogénesis. Este experimento estudia los efectos terapéuticos de Cistancheglucósidos de feniletanoidesobre la espermatogénesis de ratones con espermatogénesis inducida por ciclofosfamida y proporciona una base experimental y teórica para la aplicación de glucósidos de alcohol fenetílico Cistanche en el tratamiento de trastornos de la espermatogénesis.

1 Material y métodos

1.1 Animales de experimentación, principales reactivos e instrumentos

40 ratones BALB/C adultos SPF, 6-8 semanas de edad, peso 20-22 g, comprados en el Centro Experimental Animal de la Facultad de Medicina Básica de la Universidad de Jilin, número de certificado de animal: SCXK (Kirguistán) {{3} }. Los ratones se criaron de forma adaptativa durante 5 días antes del experimento. Condiciones de alimentación: 22 grados -25 grados, ritmo circadiano (12 h/12 ​​h), agua potable y comida gratis. Cistanche es un producto de Xinjiang Dakang Trading Company, la ciclofosfamida para inyección se adquirió de Jiangsu Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd. (número de lote 11061921), el kit de inmunoensayo ligado a enzimas de testosterona homogeneizado de tejido testicular se adquirió de Tianjin Jiuding Medical Bioengineering Co., Ltd (número de lote 20120812), los demás reactivos son todos de grado analítico de producción nacional. Lector de microplacas PLUS384 (MDC, EE. UU.), microscopio invertido TE2000U (Nikon, Japón), centrífuga J-26XP (Nanodrop, EE. UU.).

1.2 Preparación de la cistancheglucósidos de feniletanoide

10 g deCistanche tubulosaEl polvo se calentó a reflujo con etanol al 70 por ciento, dos veces, 2 horas cada vez para obtener laglucósido feniletanoideconcentrarse. La solución concentrada se sometió a cromatografía en columna de resina macroporosa D101 y se eluyó con etanol al 70 por ciento para obtener elCistanche glucósido feniletanoidealcohol. El espectrofotómetro UV identificó el extracto a una longitud de onda de 333 nm.

1.3 Preparación del modelo animal y métodos de administración

40 ratones machos BALB/C fueron alimentados de forma adaptativa durante 5 días, y los ratones se dividieron aleatoriamente en 4 grupos (10 ratones en cada grupo): grupo de control, grupo modelo, dosis baja de glucósidos de feniletanoide de Cistanche y dosis alta de alcohol fenetílico de Cistanche grupo glucósido. Con excepción del grupo de control, a los otros tres grupos de ratones se les administró una inyección intraperitoneal de ciclofosfamida de 80 mg·kg-1 para cada ratón durante 5 días consecutivos para preparar modelos animales de trastorno de espermatogénesis. Después de preparar el modelo, los ratones de los grupos de dosis baja y alta deCistanche feniletanoiderecibieron respectivamente 50 y 100 mg·kg-'·d-'. , 1 vez al día durante 30 días consecutivos. Todos los ratones se sacrificaron 24 horas después de la última administración y se tomaron pruebas bilaterales. El testículo derecho se fijó en formaldehído. El epidídimo y los testículos se tomaron del lado izquierdo. Los testículos se homogeneizaron y centrifugaron a 3,000 r·min durante 10 min. Se tomó el sobrenadante y se almacenó en un refrigerador a 20 grados para su análisis. En el epidídimo izquierdo se analizó la densidad de esperma, la motilidad de esperma y la tasa de deformidad.

1.4 Determinación de la densidad espermática, motilidad espermática y tasa de deformidad

Coloque un tubo de ensayo que contenga 10 ml de solución nutritiva de esperma en un baño de agua a temperatura constante para precalentar a 37 grados, retire el tejido conectivo y la grasa de un lado del epidídimo, corte el tejido y colóquelo en el tubo de ensayo a 37 grados. durante 10 min. Después de que el esperma esté completamente libre, tome 1 gota en la placa de conteo de células sanguíneas y calcule la densidad del esperma de acuerdo con el método de conteo de células. El resultado se expresa como el número de espermatozoides por mililitro; además, tome 5 μL de suspensión de esperma del tubo de ensayo y mézclelo con la misma cantidad de Eosin-Y Uniformemente, colóquelo a temperatura ambiente durante 10 minutos, agregue un cubreobjetos y observe con un microscopio de luz. Los espermatozoides muertos se tiñen de rosa y los espermatozoides vivos no se tiñen pero el citoplasma es transparente. Cuente 200 espermatozoides por espécimen, calcule la viabilidad de los espermatozoides y el resultado se expresa como un porcentaje, la viabilidad de los espermatozoides=una cantidad de espermatozoides vivos/una cantidad total de espermatozoides × 100 por ciento. Otros 5 μL de suspensión de esperma se fijaron en metanol durante 5 min, se secaron y tiñeron con una solución acuosa de eosina al 2 % durante 1 hora, se enjuagaron y se secaron con secador. Busque partes con menos superposición de espermatozoides bajo un microscopio de baja potencia y use un microscopio de alta potencia para verificar la morfología de los espermatozoides en secuencia. Cada ratón inspeccionó 1000 espermatozoides completos. Las cabezas de los espermatozoides estaban desenganchadas, en forma de plátano, amorfas, con cabeza gorda, con dos cabezas, etc., se juzgaron como deformidades. Se calculó la tasa de deformidad de los espermatozoides y los resultados se expresaron como porcentaje. Tasa de deformidad de los espermatozoides=una cantidad de espermatozoides deformados/cantidad total de conteo de espermatozoides × 100 por ciento.

1.5 Determinación de hormonas reproductivas

Los testículos se despegaron y se colocaron en un plato de viales, y el medio de homogeneización preenfriado (0.01 mol·L-sacarosa, 0.01 mol·L{{ 6}}Tris-HCl, 0,1 mmol· L-1Soluciones de EDTA-Naz, pH 7,4), cortar el tejido testicular con tijeras oftalmológicas, verterlo en un tubo de homogeneización de vidrio y homogeneizar, centrifugar a 4 000 ×g durante 10 min a baja temperatura, tome el sobrenadante y use un reactivo inmunoabsorbente ligado a enzimas. El nivel de testosterona en el homogeneizado de tejido testicular se determinó mediante la caja y se analizaron 3 muestras paralelas para cada muestra. Los pasos y métodos experimentales se completaron de acuerdo con las instrucciones del kit.

1.6 Observación morfológica del tejido testicular

Tome secciones de parafina de testículos de ratón, tinciones HE y observe la distribución de espermatogonias y células espermatogénicas en el tejido testicular bajo el microscopio óptico.

1.7 Análisis estadístico

El análisis estadístico se realizó con el software estadístico SPSS 17.0. La densidad espermática, la tasa de motilidad espermática, la tasa de deformidad espermática y el nivel de testosterona testicular de los ratones en cada grupo se expresaron como z±s, y la comparación entre los grupos se realizó mediante un análisis de varianza unidireccional.

2. resultados

2.1 Densidad espermática, viabilidad espermática y tasa de deformidad espermática de cada grupo de ratones

En comparación con el grupo de control, la densidad espermática y la tasa de motilidad espermática del grupo modelo disminuyeron (P<0.01), and="" the="" sperm="" deformity="" rate="" increased=""><0.01). compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" sperm="" density="" and="" sperm="" motility="" rate="" of="" mice="" in="" each="" dose="" group="" of="" cistanche="" phenethyl="" alcohol="" increased=""><0.05 or=""><0.01), and="" the="" rate="" of="" sperm="" deformity="" decreased=""><0.05 and=""><0.01). compared="" with="" the="" low-dose="" cistanche="" phenethyl="" alcohol="" glycoside="" group,="" the="" high-dose="">Cistanche alcohol fenetílico glucósidogrupo aumentó la densidad y la motilidad de los espermatozoides (P<0.05), and="" the="" rate="" of="" sperm="" deformity="" decreased=""><>

2.2 Niveles de testosterona en tejidos testiculares de ratones en cada grupo

Los niveles de testosterona en los homogeneizados de tejido testicular del grupo control y del grupo modelo fueron (10.26±0.57) y (5.33±0.84) nmol·L-', respectivamente. El nivel de testosterona del grupo modelo fue significativamente más bajo que el del grupo control (P<0.01). the="" testosterone="" levels="" in="" the="" testicular="" tissue="" homogenate="" of="" the="" low-dose="">Cistanche feniletanoide glucósidogrupo fueron (7.55±1.21) y (10.35±0.94) nmol·L-1. Los niveles de testosterona de Cistanche en dosis bajas y altasglucósido feniletanoidefueron significativamente más altos que los del grupo modelo (P<0.05 or=""><0.01). the="" level="" of="" testosterone="" in="" the="" testicular="" tissue="" homogenate="" of="" the="" high-dose="" cistanche="" phenethyl="" alcohol="" glycoside="" group="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" of="" the="" low-dose="" group=""><>

2.3 Morfología de testículos de ratón en cada grupo

Observado por un microscopio de luz; los túbulos espermatogénicos en los testículos del grupo normal están densamente dispuestos, el nivel y el número de células germinales son muchos, el epitelio seminífero está dispuesto ordenadamente y todos los túbulos seminíferos están formados por espermatozoides. En el grupo modelo, los túbulos seminíferos en los testículos de los ratones se atrofiaron y degeneraron, el epitelio seminífero se adelgazó significativamente, se redujo la cantidad de capas epiteliales, se desordenó la disposición y se redujo la cantidad de espermatozoides en la cavidad. En comparación con el grupo modelo, el número de túbulos seminíferos y capas epiteliales seminíferas en la dosis bajaCistanche feniletanoide glucósidoel grupo aumentó, la disposición epitelial fue más regular y el daño de los túbulos seminíferos mejoró significativamente; la dosis altaCistanche feniletanoide glucósidoEl grupo mejoró la estructura de los túbulos seminíferos de manera más significativa. El número y la cantidad de epitelio seminífero han aumentado significativamente, están dispuestos de manera ordenada, hay espermatozoides maduros en los túbulos seminíferos y la estructura básicamente ha vuelto a la normalidad. Consulte la Figura 1 (Recuadro 6).