Arquitectura tridimensional de las nefronas en el riñón normal y quístico
Mar 17, 2022
para más información:ali.ma@wecistanche.com
Tomás Blanco1,2,7, Nicolás Goudin3,7, Mohamad Zaidán1,4,7, Meriem Garfa Traoré3, Frank Bienaime1,5,Lisa Turinsky1, Serge Garbay1, Cle´ment Nguyen1, Martine Burtin1, Gerard Friedlander1,6, Fabiola Terzi1,8y Marco Pontoglio1,8
1Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale U1151, Centre National de la Recherche Scientifique UMR8253, Université de Paris, Institut Necker Enfants Malades, Departamento « Croissance et Signalisation », París, Francia;2Service de Chirurgie Viscérale etUrologie Pédiatrique, AP-HP, Hôpital Necker Enfants Malades, París, Francia;3Estructura Fédérative de Recherche Necker, EE. UU.24-UMS3633, París, Francia; 4Service de Néphrologie-Transplantation, AP-HP, Hôpital Bicêtre, Le Kremlin-Bicêtre, Francia;5Service d'ExplorationsFonctionnelles, AP-HP, Hôpital Necker Enfants Malades, París, Francia; y6Service d'Explorations Fonctionnelles, AP-HP, HôpitalEuropéen Georges Pompidou, París, Francia
PALABRAS CLAVE: quísticoriñónenfermedad;riñón; nefrona; nefronoptisis; limpieza de tejidos
Declaración de traducción
Los métodos de limpieza proporcionan una herramienta única para comprender cómo los cambios morfológicos conducen a consecuencias patológicas.Riñonesson órganos críticos que mantienen la homeostasis del cuerpo a través del manejo del agua, los metabolitos y los electrolitos, que dependen de manera crucial de la compleja 3-estructura dimensional denefronasCuando se altera esta organización estructural, se produce la fisiopatología renal. En el presente estudio, hemos desarrollado un poderoso método basado en aclaramiento óptico, microscopía multifotónica y rastreo digital para estudiar lariñóna nivel de una sola nefrona en condiciones fisiológicas y patológicas. En particular, proporcionamos la primera 3-reconstrucción dimensional de un riñón poliquístico a escala de un solonefronas. Este método se puede aplicar a varios contextos patológicos, lo que nos permite comprender mejor el complejo proceso de deterioro renal y, en consecuencia, desarrollar estrategias terapéuticas más específicas.
El riñón mantiene la homeostasis corporal a través de su complejo3-dimensional(3D) estructura de nefrona. Cuando esta organización estructural se altera, sobreviene la fisiopatología renal. CrónicoriñónLas enfermedades se caracterizan por el desarrollo de lesiones renales. Curiosamente, los patólogos han informado de una amplia heterogeneidad en la distribución de las lesiones durante las enfermedades renales crónicas.1,2 Se desconoce si esto refleja el hecho de que segmentos específicos de las nefronas pueden dañarse de manera diferente o, alternativamente, que algunas nefronas tienen diferentes susceptibilidades a lesionarse en su conjunto. Para solucionar este problema, es obligatorio reconstruir el 3D (Tridimensional) forma denefronasen contextos patológicos.
A nuestro conocimiento,nefronassolo se han reconstruido por completo mediante cortes en serie en 2D.3–5 Aunque el corte histológico estándar proporciona alta resolución, las reconstrucciones en 3D son laboriosas y difíciles de obtener. Esto se debe principalmente a las distorsiones mecánicas, que es un efecto ineludible del procedimiento de corte. Además, la reconstrucción en 3D a partir de imágenes en 2D no permite obtener imágenes directas de estructuras en 3D en tejidos montados en su totalidad.
La microscopía multifotónica ha mejorado nuestra capacidad para detectar cambios morfológicos en secciones gruesas. Sin embargo, una limitación importante es la poca profundidad accesible debido a la dispersión de la luz. Al minimizar las diferencias del índice de refracción, los agentes de limpieza han mejorado drásticamente la capacidad de obtener imágenes de las profundidades.6,7 A pesar de que el primer agente de limpieza se introdujo hace un siglo,8 solo recientemente se han desarrollado varios protocolos de limpieza, principalmente para el cerebro.9 –17Estudios recientes han demostrado su potencial para obtener imágenes de otros órganos sólidos, como el hígado, el páncreas oriñón.18–26
poliquisticoriñónLa enfermedad renal, un trastorno genéticamente heterogéneo que involucra mutaciones en varios genes ciliares, es la enfermedad renal hereditaria más común.27,28riñónla enfermedad se caracteriza por el desarrollo de quistes que conducen a la destrucción completa del riñón.28 Los estudios de microdisección sugirieron que los quistes pueden desarrollarse como un "empuje hacia afuera" de un segmento de la nefrona, como en la enfermedad renal poliquística autosómica dominante; como expansión extática de los conductos colectores (CD), como en poliquistosis autosómica recesivariñónenfermedad; o exclusivamente en túbulos medulares, como en la nefronoftisis (NPHP).27,29 Sin embargo, cómo se desarrollan los quistes en 3D (Tridimensional) y se organizan entre sí y la tubulesis vecina normal aún desconocida.
Aquí, combinamos la limpieza óptica con la microscopía multifotónica para brindar nuevos conocimientos sobre cómonefronastoman forma y se organizan en condiciones fisiológicas y cómo se modifican durante la enfermedad, como la cistogénesis. Nuestros resultados demuestran que existen 3 tipos denefronasy que los vasos pueden influir en la organización espacial de las nefronas. Curiosamente, observamos que las nefronas tienden a estar en planos específicos. Inesperadamente, cuando aplicamos esta técnica a ratones jck, observamos que los quistes se desarrollaban solo en segmentos específicos de nefrona con quistes fusiformes entremezclados con túbulos normales.
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RESULTADOS
Configuración experimental
Para estudiar la forma de todonefronasen relación con su entorno, adoptamos una técnica basada en limpieza óptica y microscopía multifotónica (Figura complementaria S1A). Al comparar diferentes protocolos de compensación óptica, determinamos que para elriñón, el alcohol bencílico/benzoato de bencilo (BABB) fue el más apropiado en términos de eficacia (Figura complementaria S1B y C y Tabla complementaria S1).
3D (Tridimensional) la reconstrucción y el rastreo digital requieren imágenes de alta calidad con alta resolución y una alta relación señal-fondo. Observamos que la señal óptica proporcionada por la fluorescencia nativa no era uniforme en las secciones de riñón. En particular, las imágenes de la médula tenían un contraste deficiente con una baja relación señal-fondo (Figura complementaria S2). Para mejorar la relación señal-fondo, las secciones teñidas con ácido peryódico de Schiff (Figura complementaria S1D), porque notamos empíricamente que esta tinción dio lugar a un alto contraste en secciones delgadas durante 2-fotonfluorescencia. Sin embargo, la señal no fue uniforme a lo largo de las muestras gruesas teñidas con ácido periódico de Schiff.riñónsecciones (Figura complementaria S1E). Por lo tanto, tiñemos secciones de riñón con lectinas acopladas con fluorocromos: aglutinina de maní y aglutinina de germen de trigo, que tiñen los glomérulos y los túbulos, y aglutinina foliar de Griffonia simplicidad I, que marca los vasos sanguíneos.30 Sorprendentemente, con la combinación de estas selectinas, la relación señal-fondo aumentó drásticamente en secciones de riñón completo, con una mejora significativa tanto en el plano XY como en el eje z (Figura complementaria S1E y Película complementaria S1).
Visualización de segmentos de nefrona en 3D
Para visualizar la forma de todonefronas, trazamos sus caminos, comenzando en el polo urinario del glomérulo y terminando en la unión CD (Película complementaria S2). A pesar del hecho de que las lectinas utilizadas se unen globalmente a todos los segmentos de las nefronas, notamos que cuando se inspeccionaron cuidadosamente, las selectinas se caracterizaron por un patrón específico en la forma en que tiñeron las membranas basales o luminales en los diferentes segmentos de las nefronas. En otras palabras, aprovechamos el patrón estereotípico de tinción de lectina para identificar los diferentes segmentos de nefrona. De esta forma, podríamos identificar fácilmente 6 entidades: túbulo proximal (PT), rama delgada (TL) del Henleloop (HL), rama ascendente gruesa (TAL) del HL, túbulo contorneado distal (DCT), túbulo conector (CNT), y CD. La transición entre PT y TL se caracterizó por la pérdida súbita de la señal típica del borde en cepillo de PT y por la disminución del ancho del lumen, que estaba casi virtualmente ausente en TL (Figura 1a). Por el contrario, la transición entre TL y TAL se caracterizó por un aumento significativo en el diámetro tubular externo y un ancho de luz relativamente constante (Figura 1b). En todas las nefronas, la transición de TAL a DCT se encontró sistemáticamente en el polo vascular del glomérulo. Esta transición se caracterizó por un aumento repentino del diámetro tubular externo que se debió predominantemente a un aumento significativo en el diámetro de la luz (Figura 1c). La transición entre DCT y CNT se caracterizó por una reducción tanto en el diámetro tubular como en la luz (Figura 1d). Finalmente, la conexión entre CNT y CD cortical se caracterizó por un aumento repentino tanto en el diámetro tubular como en la luz (Figura 1e). La cuantificación de estas transiciones morfológicas fue estadísticamente significativa (Figura 1f), y su pertinencia se verificó con la tinción con marcadores tubulares específicos (Figuras complementarias S3-S5 y Película complementaria S3-S5).
La forma y el tamaño de los PT difieren según su profundidad.
La tinción de espesorriñónLas secciones nos permitieron rastrear las coordenadas de la evolución espacial de segmentos PT completos. Curiosamente, descubrimos que su forma era extremadamente variable y estaba determinada por la posición de sus glomérulos en la corteza. Globalmente, identificamos 3 patrones. El primero correspondía a los más superficiales.nefronas(SN) (Figura 2a; Película complementaria S6), que ocupaba la parte más externa de la corteza (el 30 por ciento más externo cerca de la cápsula renal). Sus partes enrevesadas formaban estructuras compactas con solo 6 a 7 circunvoluciones alrededor de su propio glomérulo, ocupando espacios muy pequeños y apretados. La convolución de estos SN terminaba en una pars recta larga y recta que descendía hacia la médula. En el extremo opuesto de este espectro, observamos un segundo patrón de nefronas ubicadas en la parte más profunda de la corteza (40 por ciento más de profundidad interna), junto a la médula (nefronas yuxtamedulares [JN]) (Figura 2a; Figura complementaria S6 y Película complementaria S6). Sus TP se caracterizaban por un asa corta inicial que descendía sistemáticamente hacia la papila y luego se convertía en U para ascender hacia la cápsula renal. En contraste con los SN, los túbulos contorneados proximales de JN se caracterizaron por grandes espirales que evolucionaron alrededor de su propio glomérulo y ocuparon dominios grandes y poco empaquetados en la corteza yuxtamedular. La parte contorneada del PT de JNs tenía de 10 a 15convoluciones, formando grandes dominios. Finalmente, el tercer patrón incluía nefronas ubicadas en la porción media de la corteza (nefronas medias [MN]) (Figura 2a; Película complementaria S6). Curiosamente, estos túbulos tenían una forma y una orientación espacial que representaban una transición entre SN y JN. De hecho, contenían de 8 a 9 circunvoluciones con bobinas que eran más grandes que las SN, pero más pequeñas que las JN. Además, los MN tenían pars recta más largos que los JN. Curiosamente, una comparación global de las formas de los PT mostró que los SN y los MN tenían un patrón homogéneo, mientras que los JN eran extremadamente heterogéneos (Figura complementaria S6). Además, la reconstrucción espacial de variosnefronas reveló que los PT nunca se entremezclan (SupplementaryMovie S6), lo que indica que cada nefrona ocupa su propio espacio individual en la corteza.
Los análisis morfométricos confirmaron las grandes diferencias en el tamaño y forma de los SN y JN, con un aspecto intermedio para los MN. El PT de los JN fue más de 2-veces más largo que el PT de los SN (Figura 2b); sin embargo, la rectitud fue mayor en los SN que en los JN (Figura 2c), de acuerdo con la observación de que los túbulos JN eran mucho más tortuosos (Figura 2a; Figura complementaria S6).
Figura 1|Criterios morfológicos utilizados para identificar segmentos de nefrona. (a-e) Morfología de los diferentes segmentos de la nefrona en ratones de control.Nefronasse trazaron desde el polo urinario del glomérulo hasta el conducto colector (túbulo proximal [PT]: turquesa; rama delgada [TL] del asa de Henle: gris claro; rama ascendente gruesa [TAL] del asa de Henle: gris oscuro; rama distal túbulo contorneado [DCT]: rosa; túbulo conector [CNT]: amarillo; conducto colector cortical [CCD]: naranja). Las flechas indican el diámetro de los diferentes segmentos de nefrona. (Continuado)
Figura 1|(Continuación) (f) Cuantificación del diámetro tubular externo de los diferentes segmentos de la nefrona. Los datos se expresan como media±SEM.Análisis de varianza seguido de la prueba de Tukey-Kramer: **P < 0.01, ***P < 0,001.
Figura 2 |TridimensionalLa reconstrucción del túbulo proximal (3D) revela 3 formas y organizaciones diferentes. (a) Imágenes representativas de reconstrucción en 3D de los túbulos proximales a través de toda la corteza renal, divididas en 3 niveles (líneas blancas) de acuerdo con la forma de los túbulos proximales (PT): corteza superficial (azul), media (verde) y yuxtamedular (roja), correspondientes al 30 por ciento externo, al 30 por ciento medio y al 40 por ciento interno de la corteza, respectivamente. Tenga en cuenta las diferentes formas de los 3 tipos denefronasy en particular la longitud y tortuosidad de los túbulos yuxtamedulares. Barra{{0}} mm. ( b, c ) Cuantificación de la ( b ) longitud y ( c ) rectitud de los 3 tipos de túbulos proximales. ( d ) Cuantificación del volumen de glomérulos de cada región de la corteza. Los datos se expresan como SEM medio. Análisis de varianza seguido de la prueba de Tukey-Kramer: PT yuxtamedular versus PT superficial: ###P < 0.001;="" pt="" yuxtamedular="" frente="" a="" pt="" medio:="" ***p="">< 0,001;="" pt="" superficial="" frente="" a="" pt="" medio:="" $$$p=""><>
Figura 3 |TridimensionalLa reconstrucción de nefronas (3D) revela 3 tipos diferentes de nefronas. (a) Imágenes representativas en 3D de una nefrona completa (paneles de la izquierda) desde los glomérulos hasta el conducto colector en la corteza superficial (azul), la corteza media (verde) y la región yuxtamedular (roja) en ratones de control. Segmentación de nefronas (paneles de la derecha) para los 3 tipos diferentes de nefronas. Barra=150 mm. (b) Cuantificación de la distancia interna entre las 2 ramas del asa de Henle para los 3 tipos de nefronas. (c) Cuantificación de la longitud de la nefrona para (continuación)
Figura 3|(continuación) 3 tipos denefronas. (d) Cuantificación de la longitud de los diferentes segmentos de la nefrona según el tipo de nefrona. Los datos se expresan como media±SEM. Análisis de varianza seguido de la prueba de Tukey-Kramer: nefrona yuxtamedular (JN) versus nefrona superficial (SN): ###P < 0.001;="" jn="" versus="" nefrona="" media="" (mn):="" *p="">< 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< 0.001.="" cnt,="" túbulo="" conector;="" dct,="" túbulo="" contorneado="" distal;="" pt,="" túbulo="" proximal;="" tal,="" rama="" ascendente="" gruesa="" del="" asa="" de="" henle;="" tl,="" rama="" delgada="" del="" asa="" de="">
El tamaño glomerular varía con la profundidad
Luego analizamos la profundidad y el diámetro de los glomérulos seleccionados aleatoriamente de cada una de las 3 zonas. Los análisis morfométricos revelaron que los glomérulos se ubicaron en promedio a 783 y 355 mm de la cápsula renal en JN y SN, respectivamente. Como se informó anteriormente, observamos que el tamaño de los glomérulos variaba según su profundidad. En particular, el volumen glomerular de los JN fue 3 veces mayor que el de los SN y los MN (Figura 2d).
Reconstrucción de nefrona 3D
Luego rastreamos la evolución espacial de todanefronasde PT a CNT. La vista global de su 3D (Tridimensional) la reconstrucción confirmó que la forma de la nefrona difería entre SN, MN y JN (Figura 3a; Película complementaria S7). Esta diferencia se debió principalmente a la estructura de PT. Además, observamos que HL tenía una organización espacial 3D diferente. En particular, TL y TAL estaban más separados en JNs que en SNs y MNs (Figura 3b). Los análisis morfométricos revelaron que los JN eran globalmente 2- veces más largos que los SN (Figura 3c). El aumento de longitud se distribuyó proporcionalmente en todos los segmentos, excepto en TAL y DCT, que tendieron a tener una longitud absoluta similar en todos los tipos de nefronas (Figura 3d). Esto sugirió que el alargamiento de la nefrona es un proceso sorprendentemente homogéneo.
Los vasos arqueados influyen en la convolución PT yuxtamedular
Para obtener una perspectiva más completa de lariñónestructura, aprovechamos la tinción con aglutinina de Griffonia simplicifolia, que nos permitió rastrear los vasos arqueados y sus ramas en los vasos corticales radiados (Figura 4a; Película complementaria S8). Curiosamente, el 3D concomitante (Tridimensional) la reconstrucción de nefronas y vasos mostró que los vasos arqueados tienden a estar en una sorprendente organización espacial paralela con los túbulos cercanos. En particular, observamos que el camino seguido por JN específicos (JN restringidos) tiende a seguir el camino del buque cercano (Figura 4b; Película complementaria S9). Sorprendentemente, este sesgo (observado solo en un subconjunto de JNnefronas) explicó la gran heterogeneidad en las formas de PT (Figura complementaria S6). Los análisis morfométricos revelaron que los PT "restringidos" eran significativamente más largos y tortuosos (rectitud reducida) que los "no restringidos" (Figura 4c y d). Vale la pena señalar que las partes contorneadas de los SN y los MN se colocaron por encima de los recipientes arqueados y no estaban restringidas.
Cistanche-enfermedad renal crónica
Los túbulos tienden a estar en planos.
Curiosamente, una inspección del 3D (Tridimensional) formas denefronasindicó que tienden a estar en planos (Figura 5a; Película complementaria S10). Para cuantificar este parámetro y evaluar el posible sesgo estadístico de esta conformación, medimos la tendencia general de los túbulos a doblarse fuera del plano definido por sus bucles. Nuestras mediciones mostraron que, en comparación con un modelo simulado de caminata aleatoria generado con el mismo conjunto de ángulos medidos consecutivos y longitud entre puntos consecutivos (Figura 5b), los túbulos tendían a evolucionar con una desviación más pequeña de un plano (Figura 5c). Esto indicaba que los túbulos tendían a restringir su camino a lo largo de un plano. Las diferencias observadas fueron estadísticamente significativas (P <>
La reconstrucción de nefronas en 3D revela un patrón específico para el desarrollo de quistes
Para determinar si nuestro protocolo permite rastrear nefronas en tejidos patológicos desorganizados, caracterizamos las formas y la distribución espacial de los quistes en ratones Jack, un modelo ampliamente utilizado de NPHP y enfermedad quística. Las imágenes 31-33 3D mostraron que a pesar de la aparición de quistes prominentes, thegeneral 3D (Tridimensional) el curso de las nefronas no difirió significativamente del de los ratones de control (Película complementaria S11). De manera similar, los análisis morfométricos confirmaron que la longitud global denefronas, el volumen glomerular y la longitud de cada segmento de nefrona fueron comparables con los de los ratones de control (Figura complementaria S7). Es de destacar que, debido al desarrollo de quistes, no pudimos diferenciar TL de TAL en HL. Todas las nefronas desarrollaron quistes fusiformes (SupplementaryMovies S11 y S12). Una de las características más sorprendentes fue la observación de que se produjeron dilataciones quísticas fusiformes en múltiples ubicaciones a lo largo del mismo segmento de la nefrona (Películas complementarias S12 y S13). Curiosamente, observamos que los quistes nunca se desarrollaron en las extremidades descendentes PT y HL (Figura 6a; Película complementaria S12). Por el contrario, se detectaron predominantemente en las ramas ascendentes de HL, DCT, CNT y en la parte superior de los CD, en continuidad con CNT (Figura 6a; Película complementaria S12). En particular, observamos que DCT, así como los segmentos de CNT, tenían una probabilidad particularmente aumentada de desarrollar quistes en sus respectivas partes más distales (Figura 6b). Los análisis morfométricos cuantitativos de las imágenes de reconstrucción 3D revelaron que el volumen total de quistes por nefrona era particularmente alto en CNT (Figura 7a). Además, observamos que las ampliaciones de quistes en HL y DCT fueron mayores en JN que en SN y MN (Figura 7a; Película complementaria S12). Además, la incidencia de quistes fue significativamente mayor en los JN que en los otros tipos denefronas(Figura 7b). También observamos que la distancia inter glomerular promedio (calculada en los 5 glomérulos más cercanos) tendía a ser particularmente mayor en ratones quísticos, especialmente en la corteza más superficial (Figura complementaria S8).
Figura 4|Los vasos determinan la forma de la nefrona. (a)Tridimensionalreconstrucción de la arquitectura de los vasos desde los vasos arqueados hasta los vasos corticales radiados. Barra ¼ 200 mm. (b) Imágenes representativas de túbulos proximales yuxtamedulares "no restringidos" (panel superior) y "restringidos" (panel inferior). Barra ¼ 100 mm. ( c, d ) Cuantificación de la ( c ) longitud y ( d ) rectitud de los túbulos proximales yuxtamedulares "no restringidos" y "restringidos". Los datos se expresan como media±SEM. Prueba de Mann-Whitney: "restringida" frente a "no restringida":*P < 0.05,="" ***p=""><>
3D (Tridimensional) la reconstrucción de numerosos quistes reveló que eran extremadamente variables en forma y volumen (Figura 6c; Películas complementarias S11 y S13). En la rama ascendente del HL, los quistes tenían una forma fusiforme con un diámetro pequeño. En DCT, los quistes tenían una forma más bien esférica y más grande y se intercalaban entre los túbulos no dilatados. Curiosamente, la transición entre DCT y CNT se caracterizó sistemáticamente por una estructura normal no dilatada. En contraste, en CNT, observamos sistemáticamente una estructura quística dilatada contigua directamente en contacto con el CD. Curiosamente, en la EC, esta estructura se encogió progresivamente a un tamaño de túbulo normal. Más distalmente, no se pudieron detectar más quistes en la porción contigua del CD. Otra característica consistente fue la peculiar organización espacial de los quistes en la rama ascendente del HL. De hecho, aunque los quistes eran más profundos y más cercanos al asa en los NS, eran más superficiales y más cercanos a la DCT en los JN (Figura 6c). Nuevamente, los quistes ocuparon una posición intermedia en los MN (Figura 6c).
Figura 5|Los túbulos de nefrona tienden a evolucionar como una estructura plana. (a) Un trayecto típico de un túbulo proximal de nefrona. Este camino ilustra su tendencia a estar en un plano. La planaridad de la evolución del camino se puede ver mejor cuando se gira correctamente y se alinea con el punto de vista del observador (ver la representación de la derecha del mismo segmento tubular, que, en el lado izquierdo, se representa en un ángulo diferente) . (b) Representación esquemática de un camino tubular compuesto por 4 segmentos (entre 5 puntos que definen un camino tubular dado que se muestra como ejemplo). El grado en que las trayectorias tienden a "salir de su plano" se puede representar mediante el ángulo indicado aquí como "beta". (Continuado)
Figura 5|(Continuación) Este ángulo se mide entre el segmento p3-p4 con respecto al plano (definido por los puntos inmediatamente anteriores p3, p2 y p1) y representado por un rectángulo gris oscuro en el esquema. Luego se calculó recursivamente el cálculo de los ángulos beta junto con el conjunto de puntos en una trayectoria tubular. Para evaluar el alcance del sesgo de estos ángulos beta, simulamos una caminata aleatoria (simulación de Monte Carlos [MC]) utilizando el mismo conjunto de ángulos alfa consecutivos de cada trayectoria tubular (medidos entre todos los segmentos consecutivos). Esta caminata aleatoria generó un camino con un conjunto idéntico de ángulos alfa y ángulos beta aleatorios. ( c ) Gráficos de violín de la distribución global de los ángulos beta y el resultado de MC en el túbulo proximal (PT), rama delgada (TL) del asa de Henle, rama ascendente gruesa (TAL) del asa de Henle, túbulo contorneado distal (DCT ), y túbulo conectivo (CNT). MC, P <>
DISCUSIÓN
Los métodos histológicos tradicionales tienen una capacidad limitada para detectar cambios patológicos que afectan la forma global denefronas. Aquí, presentamos un enfoque poderoso basado en la limpieza de tejidos que tiene el potencial de abordar preguntas cruciales sobreriñónarquitectura con un detalle espacial sin precedentes en condiciones normales y patológicas. Nuestros resultados confirmaron la existencia de 3 tipos de nefronas, que difieren en su ubicación, forma y tamaño, de acuerdo con sus especificidades funcionales. Además, demostramos que las nefronas tienden a estar en planos y adaptarse a la organización espacial de los vasos. Curiosamente, cuando aplicamos esta técnica a un modelo de enfermedad renal quística, observamos que los quistes se desarrollan en todas las nefronas, pero solo en segmentos específicos. Curiosamente, mostramos que la forma del quiste varía según el segmento de la nefrona y que, a lo largo de la misma nefrona, los quistes se intercalan con los túbulos normales no dilatados. En conjunto, estos resultados proporcionan el primer 3D (Tridimensional) caracterización de la disposición espacial denefronasy vasos y, lo que es más importante, proporcionan la base para comprender un proceso patológico, como la cistogénesis.
El aclaramiento óptico del riñón es un desafío debido a los altos niveles de autofluorescencia y densidad celular. Mediante la comparación de diferentes protocolos de limpieza, identificamos en BABB una poderosa técnica para implementar la visualización y reconstrucción de estructuras ubicadas en la parte más profunda de lariñón, es decir, la médula. Además, BABB es rápido y escalable y, una vez limpiadas, las muestras se pueden almacenar durante meses antes de la adquisición de imágenes. Otra ventaja principal de esta técnica es su bajo costo. Los agentes aclaradores pueden provocar el encogimiento o el agrandamiento de las estructuras.9–17 Sin embargo, debido a que estas modificaciones del tamaño del riñón son isotrópicas, no se espera que las medidas relativas se vean afectadas o sesguen su interpretación. Una de las limitaciones más importantes es la anotación de estructuras que consume mucho tiempo. Sin embargo, hay un número creciente de técnicas basadas en aprendizaje profundo que deberían superar rápidamente esta limitación.
De acuerdo con los resultados obtenidos por las técnicas clásicas, nuestro estudio mostró que las nefronas difieren en su forma y longitud según su posición. En particular, observamos que los JN tienen PT contorneados más desarrollados y glomérulos más grandes y son 2 veces más largos que los SN. El aumento de longitud es el resultado de un proceso armonioso porque el alargamiento afecta proporcionalmente a todos los segmentos de la nefrona. También observamos que los JN tienen HL más grandes. En conjunto, estos datos muestran claramente que la microanatomía de los SN y los JN es significativamente diferente y que los MN muestran características intermedias. Curiosamente, los estudios fisiológicos han demostrado quenefronastambién son funcionalmente diferentes.2 Los eventos morfogenéticos que subyacen a estas diferencias aún no se conocen. Por lo tanto, es tentador especular que la estructura particular de los JN puede explicar la especificidad de sus funciones.
Curiosamente, al proporcionar por primera vez el 3D (Tridimensional) reconstrucción denefronasy sus vasos circundantes, descubrimos una restricción espacial entre los vasos arqueados y un subgrupo de nefronas. Por lo tanto, es concebible pensar que los vasos pueden dictar la forma en que las nefronas se alargan durante el desarrollo.34,35 La inspección de las formas 3D de las nefronas combinada con simulaciones computacionales también reveló que las nefronas nunca se entremezclan y que cada nefrona tiende a estar en un plano. Queda por dilucidar el significado funcional de esta observación.
Desarrollo de quistes durante la poliquísticariñónla enfermedad sigue siendo un proceso intrigante. La NPHP, una condición patológica caracterizada por el desarrollo de quistes, es la enfermedad renal terminal más común que causa enfermedades genéticas en niños y adolescentes. Hasta el momento se han identificado veinte genes NPHP.36 Entre ellos, NEK8 codifica un miembro de la familia de quinasas relacionadas con la nunca inmitosis A, que desempeña un papel en la función ciliar y la progresión del ciclo celular.37 Nek8 se caracterizó originalmente como el gen mutado en ratones jck.32 En particular, se ha demostrado que la mutación en el mismo dominio proteico conduce a NPHP9 en humanos.38 2Estudios D sugirieron que el desarrollo de quistes difiere drásticamente entre las diferentes formas de poliquistosis renal.27,29 En particular, en NPHP, los quistes parecen derivarse exclusivamente de CD y DCT.31 Aunque informativos, estos estudios inmunohistoquímicos no pueden argumentar en contra de la posibilidad de que la pérdida de marcadores tubulares específicos39 explique artificialmente esta observación. Así, nuestro 3D (Tridimensional) proporciona la primera evidencia clara de que el desarrollo de quistes es un proceso que puede involucrar solo segmentos de nefrona específicos. Curiosamente, aunque la quinasa 8 relacionada con NIMA (Never In mitosisgene A) (NEK8) se expresa en el citoplasma de todos los segmentos de la nefrona, su expresión en los cilios está restringida a DCT y CD. Debido a que solo estos segmentos son propensos a desarrollar quistes,31 podemos postular que la interrupción de la función ciliar de NEK8 es el evento crucial para la formación de quistes. Curiosamente, también hemos observado que los quistes fusiformes están en continuidad con los túbulos normales no dilatados. El hecho de que una mutación recesiva de la línea germinal conduzca a un fenotipo patológico solo en un subconjunto de células sugiere que un segundo evento podría desencadenar el desarrollo de quistes en estas células, como se sugiere para poliquistosis autosómica dominante.riñónenfermedad.40,41
Figura 6 |TridimensionalLa reconstrucción de la nefrona (3D) revela que los quistes se desarrollan solo en segmentos específicos de la nefrona. (a) Imágenes 3D representativas con representación del volumen del quiste de una nefrona completa (paneles izquierdos) desde los glomérulos hasta el conducto colector en la corteza superficial (azul), la corteza media (verde) y la región yuxtamedular (roja) en ratones Jack. Segmentación de nefronas (paneles de la derecha) para los 3 tipos diferentes denefronas. Barra=150 mm. (b) Probabilidad de desarrollar quistes en los diferentes segmentos de nefrona en ratones Jack. (Continuado)
Figura 6|(Continuación) El eje horizontal es una longitud normalizada de nefronas que corresponde a 50 bins (túbulo proximal [PT], turquesa; Henleloop [HL], blanco; túbulo contorneado distal [DCT], rosa; túbulo conector [CNT], amarillo). (c) Imágenes representativas de reconstrucción de quistes en 3D con representación de volumen de quistes de la rama ascendente de HL (paneles izquierdos), DCT (paneles centrales) y CNT y conductos colectores corticales (CCD) (paneles derechos) en superficial (paneles superiores), medio (paneles centrales) paneles) y nefronas yuxtamedulares (paneles inferiores) en ratones jack. Barra= 50 mm.
Figura 7|Caracterización de la distribución y volumen de los quistes a lo largo de la nefrona. (a) Cuantificación del volumen total del quiste (suma de los quistes por nefrona) para cada segmento de la nefrona (asa de Henle [HL], blanco; túbulo contorneado distal [DCT], rosa; túbulo conector [CNT], amarillo) y (b) longitud del túbulo ocupado por los quistes para cada tipo de nefrona (superficial: azul; medio: verde; yuxtamedular: rojo) en ratones Jack. Los datos se expresan como media±SEM. Análisis de varianza seguido de la prueba de Tukey-Kramer: nefrona yuxtamedular [JN] versus nefrona superficial [SN]: #P < 0.05;="" jn="" versus="" nefrona="" media="" [mn]:="" *p="">< 0.05,="" **p=""><>
También observamos que el agrandamiento del quiste es más predominante en los JN que en los NS, al menos considerando los quistes que se ubican entre PT y CNT. Consistentemente, se ha informado que en el contexto de la glomeruloesclerosis, las lesiones glomerulares se encuentran con mayor frecuencia en los JN que en los SN. deteriorarse es una hipótesis interesante que merece mayor investigación.
En resumen, describimos una nueva técnica para obtener imágenesriñonesen 3D (Tridimensional) con suficiente especificidad molecular y resolución para registrar directamente la distribución espacial y cuantitativa de estructuras internas específicamente etiquetadas (nefronas, vasos y quistes). Dada la comodidad, la velocidad y la capacidad de cuantificación directa, anticipamos que esta técnica se convertirá en una poderosa herramienta para comprender la fisiopatología renal.
MÉTODOS
animales
Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por los "Services Vétérinairesde la Préfecture de Police de Paris" y por el comité ético de la Université Paris Descartes. Se usaron ratones FVB/N de dos meses de edad (n=20) para establecer las condiciones experimentales parariñónA continuación, el estudio se realizó en ratones jack macho de 2-semanas de edad (n=4) y compañeros de camada de control (n=3).
Preparación de tejidos renales
Antes de sacrificarlos, se perfundió a los ratones, mediante cateterismo intracardíaco, con 25 ml de solución salina heparinizada (1000 UI/l) seguido de 75 ml de paraformaldehído al 4 por ciento en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Los experimentos se realizaron bajo anestesia con xilacina (Rompun 2 por ciento, Bayer, Leverkusen, Alemania, 6 mg/g de peso corporal) y ketamina (Clorketam 1000, Vetoquinol SA, Lure, Francia, 120 mg/g de peso corporal).
Para estudios de limpieza,riñonesse fijaron en paraformaldehído al 4 por ciento durante 4 horas y se incluyeron en agarosa al 4 por ciento y se cortaron secciones de 1,5- mm de espesor que rodeaban el hilio renal y se almacenaron en PBS a 4la licenciatura. Primero se tiñeron las secciones de riñón y luego se limpiaron.
Para los estudios inmunohistoquímicos en secciones delgadas, los riñones se fijaron en paraformaldehído al 4 por ciento durante la noche y se incluyeron en parafina y se cortaron secciones de 4-mm.
tinción
Tinción con ácido peryódico de Schiff. El 1.5-mmriñónlas secciones se incubaron en ácido peryódico de Schiff puro o diluido en PBS 1:100 durante 5 minutos a temperatura ambiente antes de aclararlas.
Inmunohistoquímica en secciones delgadas incluidas en parafina. Se calentaron secciones de cuatro micrómetros de riñones incluidos en parafina para la recuperación del antígeno y se incubaron durante la noche a 44 gradocon lectinas acopladas con flfluorocromo para rastrear los túbulos (aglutinina de cacahuete de rodamina [RL-1072-5] y aglutinina de germen de trigo de rodamina [RL-1022-5], Vector Laboratories, Burlingame, CA, diluida a 1:200) y segmentar- anticuerpo primario específico para representar distintos segmentos tubulares (lectina de Lotus tetragonolobus biotinilada [B-1325], Vector Laboratories, diluida a 1:100; ratón anti-Calbindin D28K[D-4], Santa Cruz, Heidelberg, Alemania, diluido a 1:200; cabra anti-AQP2 [C-17], Santa Cruz, diluido a 1:200). Al día siguiente, las secciones se incubaron con el anticuerpo secundario durante 1 hora a temperatura ambiente (conjugado de Alexa Fluor 488 [S32354], Invitrogen; anti-cabra Alexa Fluor 488 [A-11055], Invitrogen; anti-ratón AlexaFluor 488 [A-21202], Invitrogen, Carlsbad, CA; todo diluido a 1:500) antes de colorearse con 40,6-diamidino-2-fenilindol. Todas las imágenes se adquirieron con un microscopio Nikon Eclipse E800 (Champignysur Marne, Francia) y se prepararon con el software Fiji (versión 1.50). Tinción con lectina en secciones gruesas. El 1.5-mm de espesorriñónsecciones se incubaron a 44 gradodurante 1 mes en Texas Red o lectinas acopladas con isotiocianato de fluoresceína: aglutinina de maní (RL-1072-5) y aglutinina de germen de trigo (RL-1022-5), diluidas a 1:100 en azida PBS al 0,1 por ciento y Triton-X al 0,1 por ciento. Luego, las secciones se lavaron todos los días durante 2 semanas con PBS antes de limpiarlas.
Cistanche-función renal
compensación óptica
Para limpieza de escala, 1.5-mmriñónlas secciones se incubaron en ScaleA2 (4 M de urea, 0,1 por ciento de Triton X-100, 10 por ciento de glicerol) o ScaleB4 (8 de Murea, 0,1 por ciento de Triton X-100 ) durante 2 semanas, hasta 1 año, a las 4la licenciatura.
Para la limpieza de BABB, se deshidrataron secciones de riñón de 1,5-mm en enjuagues secuenciales de etanol a temperatura ambiente. A continuación, las muestras se incubaron en BABB (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO) en una proporción de 1:2 durante al menos 2 días a 4 grados.
Adquisición de imágenes de microscopía de dos fotones
Se tomaron imágenes de los tejidos con gel acuoso en un microscopio multifotónico invertido (LaVision BioTec) equipado con un láser Mai Tai HP Titanium-Sapphire (Spectra-Physics, Santa Clara, CA) (Figura complementaria S1A). La longitud de onda de excitación fue de 815 nm al 8 por ciento de la potencia. Usamos un 20Xobjetivo de inmersión en agua (XLUMPLFL20XW,Olympus [Tokio, Japón]; apertura numérica, 0.95; distancia de trabajo, 2,0 mm). Para la adquisición de fluorescencia, usamos un detector no descaneado al 80 por ciento con un filtro de paso de banda de 593/40 nm.
El primer paso consistió en la adquisición de imágenes de mosaico 2D en la pila z central mediante el uso de parámetros de adquisición subóptimos (400 mm X400 mm y 1011X1011 píxeles, con un 10 por ciento de superposición y un promedio de línea de 2) para guiar la selección de los campos centrales más relevantes (Figura complementaria S9A ). Una vez que se definieron la cuadrícula XY y los campos de interés z, se ajustaron los parámetros para adquirir imágenes de alta calidad. Tal enfoque redujo la región de interés a 5X12 campos por pila z. Luego, adquirimos 850 pilas z/cortes ópticos (tamaño de paso de 1- mm) que rodeaban el hilio renal en la parte media delriñónsección.
Unión, procesamiento y seguimiento de imágenes Cada pila se dividió en mosaicos de acuerdo con el método desarrollado por Preibischet al.,43 que permite unir una gran colección de imágenes utilizando el complemento "Grid/Collection stitching" del software Fiji (HTTP://Fiji. sc/Fiyi). Debido a que observamos un cambio importante entre 2 imágenes adyacentes después de unirlas, escribimos un programa personalizado en Python. Este programa compensa el cambio de imagen, permitiéndonos alinear correctamente las imágenes (Figura complementaria S9B). Las imágenes corregidas con costura se analizaron utilizando la versión 8.4.2 de Imaris (Bitplane, Zúrich, Suiza). Los túbulos y los vasos se rastrearon utilizando el modo manual del paquete de trazador de filamentos de Imaris y se unieron mediante una Imaris Xtension que desarrollamos con MATLAB (https://www.dropbox.com/s/sm9u5em3orjrpmc/Standalone_Join_ Filament_Tool.zip?dl=0) (Figura complementaria S9C). Los quistes de glomérulos y quistes se reconstruyeron en 3D usando el modo manual del paquete de superficie de Imaris. el 3d (Tridimensional) la organización espacial de los glomérulos se mostró utilizando el modo manual del paquete de manchas de Imaris.
Morfometría
La longitud del segmento tubular, la longitud de la nefrona y la rectitud se determinaron utilizando el paquete de trazador de filamentos de Imaris. Según el software Imaris, la rectitud se cuantificó como la relación entre la distancia entre 2 puntos y la longitud del segmento de la nefrona. Treinta y un PTs y 12 enterosnefronasse reconstruyeron y midieron en 3 ratones de tipo salvaje, mientras que 37 PT y 17 nefronas completas se reconstruyeron y midieron en 4 ratones jack. Los volúmenes de quistes y glomerulares se determinaron utilizando el "paquete de superficie" de Imaris. Se midieron 31 y 34 glomérulos en ratones de tipo salvaje y jack, respectivamente. Setenta y cuatro quistes se midieron en total.
Los ángulos "fuera del plano" de los giros tubulares (indicados como "beta") se midieron entre el plano (definido por 3 puntos consecutivos) y la dirección con el siguiente cuarto punto consecutivo en el espacio (Figura 5b). Para evaluar la importancia estadística del sesgo observado, simulamos la distribución de los ángulos beta con una rotación aleatoria de los ángulos beta (simulación Monte Carlo) en estructuras que estaban compuestas por los mismos segmentos con el mismo conjunto de ángulos alfa.
Para el cálculo de la probabilidad de desarrollar una lesión quística junto con los segmentos de la nefrona, representamos cada nefrona por un conjunto de puntos en el espacio. Cada punto se anotó con respecto a la presencia de quiste versus estructura normal y el tipo de segmento. La probabilidad en cada longitud estandarizada (establecida en 50 contenedores) se calculó como la relación entre el número de puntos con anotación quística y el número total de puntos en el contenedor.
Para el cálculo de la interdistancia glomerular media se consideró para cada glomérulo la interdistancia glomerular media calculada sobre los 5 glomérulos más próximos.
Análisis de datos y estadísticas.
Los datos se expresan como media ± SEM. Las diferencias entre los grupos experimentales se evaluaron mediante análisis de varianza seguido, cuando fue significativa (P < {{0}}.05),="" por="" la="" prueba="" de="" tukey-kramer.="" cuando="" se="" compararon="" solo="" 2="" grupos,="" se="" utilizó="" la="" prueba="" de="" mann-whitney.="" los="" análisis="" estadísticos="" se="" realizaron="" utilizando="" el="" software="" graph="" prism="" (sandiego,="" ca,="" versión="">
DIVULGACIÓN
Todos los autores declararon no tener intereses en conflicto.
EXPRESIONES DE GRATITUD
Agradecemos al Laboratoire Experimentation Animale et Transgenese(LEAT), Histology and Imaging Platforms of Structure Federative deRecherche Necker por su asistencia técnica. Agradecemos a Pierre Isnard, Marie-Claire Gubler y Nicolas Kuperwasser por la lectura crítica del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por Institut National de laSanté et de la Recherche Médicale, Université Paris Descartes,Assistance Publique – Hôpitaux de Paris, Agence Nationale de laRecherche, Whoami Laboratoire d'Excellence Who am I, RochePharma Research and Early Development (Basilea, Suiza) , y Institut Roche de Recherche et de Médecine Translationnelle (París, Francia).
CONTRIBUCIONES DE AUTOR
TB, NG y MZ diseñaron y realizaron los experimentos y analizaron los datos. FB, LT, MGT y SG también realizaron algunos experimentos y analizaron los datos. MB y CN realizaron los experimentos con ratones. TB y MZ también contribuyeron a escribir el manuscrito. GF revisó el manuscrito. FT y MP proporcionaron el marco conceptual y diseñaron el estudio, supervisaron el proyecto y escribieron el artículo.
Cistanche-Arquitectura tridimensional del riñón de las nefronas
MATERIAL SUPLEMENTARIO
Archivo complementario (PDF)
Figura S1. Configuración experimental, procedimiento de adquisición y procesamiento de imágenes.
Figura S2. Límites de la señal de autofluorescencia en resoluciones XY y z.
Figura S3. Una imagen bidimensional de la transición entre PT y TL en 4-mm incrustado en parafinariñónsecciones.
Figura S4. Una imagen bidimensional de la transición entre TAL y DCT en secciones de riñón incluidas en parafina de 4- mm.
Figura S5. Una imagen bidimensional de la transición entre DCT y CNT en secciones de riñón incluidas en parafina de 4- mm.
Figura S6. La reconstrucción tridimensional revela 3 formas diferentes de túbulos proximales.
Figura S7.Tridimensionalreconstrucción revela que la longitud y la segmentación denefronasno se ven afectados por los quistes.
Figura S8. La densidad de glomérulos en control y quísticariñones.
Figura S9. Procedimiento de adquisición y procesamiento de imágenes postratamiento. Tabla S1. Comparación de métodos de compensación. Archivo complementario (Películas)
Película S1. La tinción con lectina mejora notablemente la resolución y la relación señal-fondo.
Película S2. Trazado de la trayectoria de un túbulo.
Película S3. Reconstrucción tridimensional de un riñón aclarado que muestra la unión entre el túbulo proximal y la rama delgada del asa de Henle.
Película S4. Reconstrucción tridimensional de un riñón aclarado que muestra la unión entre la rama ascendente gruesa del Henleloop y el túbulo contorneado distal.
Película T5.Tridimensionalreconstrucción de un despejadoriñónmostrando la unión entre el túbulo contorneado distal y el túbulo conector.
Película S6. La forma y el tamaño de los túbulos proximales difieren según su profundidad.
Película S7. Reconstrucción tridimensional de nefronas en ratones de control.
Película S8. Trazado de la trayectoria de un vaso desde un vaso arqueado hasta un vaso radiado acortical.
Película S9. Los vasos arqueados modelan la forma de los túbulos proximales yuxtamedulares.
Película S10.Nefronastienden a acostarse en un avión.
Película T11. La reconstrucción tridimensional de la nefrona muestra un patrón específico para el desarrollo de quistes.
Película T12.TridimensionalLa segmentación de la nefrona revela que los quistes se desarrollan en segmentos específicos de la nefrona.
Película T13. Disposición espacial e interrelación denefronasy vasos en un poliquísticoriñón.
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