Hoy en día, la senescencia celular se considera una reacción común de casi todos los tipos de células en proliferación

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ResumenLa eliminación dirigida de células senescentes, el análisis, es una de las tendencias centrales en la terapia antienvejecimiento. Recientemente se demostró que los glucósidos cardíacos son senolíticos de amplio espectro. Aquí probamos las propiedades senolíticas de los glucósidos cardíacos frente a las células madre mesenquimales humanas (hMSC). Los glucósidos cardíacos no tenían capacidad senolítica frente a hMSC senescentes de varios orígenes. Utilizando enfoques biológicos y bioinformáticos, comparamos el desarrollo de la senescencia en las hMSC 'sensibles a los glucósidos cardíacos' A549 y 'insensibles'. Se encontró que la ausencia de análisis estaba mediada por la importación efectiva de potasio y el aumento de la resistencia a la apoptosis en las hMSC senescentes. El debilitamiento de la "defensa antiapoptótica" predispone a las hMSC al análisis. Revelamos que la resistencia a la apoptosis, previamente reconocida como una característica común de la senescencia, de hecho, no es una característica general de las células senescentes. Además, solo las células senescentes de apoptosis-prolina son sensibles al análisis inducido por glucósidos cardíacos. Por lo tanto, podemos especular que la efectividad del análisis podría depender de si las células senescentes se vuelven resistentes a la apoptosis en comparación con sus contrapartes en proliferación.

Palabras claveCélulas madre. Senólisis·Senescencia·Apoptosis·Resistencia al estrés

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Introducción

Hoy en día, la senescencia celular se considera una reacción común de casi todos los tipos de células en proliferación, incluidas las cancerosas y las madres, así como algunas células posmitóticas a una variedad de estímulos estresantes [1-3]. Los siguientes tipos de senescencia celular se pueden distinguir según el origen del factor inductor: replicativa (debido al daño del ADN en los extremos acortados de los telómeros), inducida por oncogenes (en respuesta a la activación aberrante de la señalización oncogénica), inducida por estrés ( mediada por el daño en el ADN causado por el estrés oxidativo, choque térmico, radiación UV e Y, etc.) e inducida por quimioterapia (activada en células cancerosas en respuesta a fármacos quimioterapéuticos)[4-7]. Existe heterogeneidad en los marcadores expresados ​​por las células senescentes según el tipo de célula y la agresión utilizada para inducir la senescencia. Sin embargo, existen varias características comunes típicas de la mayoría de los tipos de células senescentes. La característica esencial de la senescencia para cualquier tipo de célula en división es la pérdida irreversible de la proliferación [8].extracto de cistanche tubulosaLa irreversibilidad de la detención del ciclo celular está controlada por los inhibidores pl6 y p21 de la cinasa dependiente de ciclina (CDK) y, a menudo, está regulada por la proteína supresora de tumores p53 [8,9]. Las otras características importantes de las células senescentes son la activación de una respuesta persistente al daño del ADN; hipertrofia celular, que a menudo surge como resultado de una alteración de la biogénesis ribosómica y la síntesis de proteínas; alteración de la degradación lisosomal y disfunción de los demás sistemas de degradación; mayor actividad de la enzima lisosomal asociada a la senescencia- -galactosidasa; diversas alteraciones mitocondriales; adquisición del fenotipo secretor asociado a la senescencia (SASP), compuesto por factores proinflamatorios, enzimas degradadoras de matriz, especies reactivas de oxígeno, etc.; alteraciones epigenéticas y del paisaje de la cromatina, incluida la formación de focos heterocromáticos asociados a la senescencia y la distensión de los satélites asociada a la senescencia [8-10]. En otras palabras, las células senescentes conservan la actividad metabólica y la vitalidad, pero su funcionamiento está significativamente alterado en comparación con las células de origen.

Cistanche puede antienvejecimiento

Ahora está claro que las células senescentes pueden modificar el microambiente circundante afectando tanto a las células vecinas como a los nichos celulares, lo que puede provocar un mal funcionamiento de los tejidos y, por lo tanto, puede estar relacionado con la progresión del envejecimiento y las enfermedades relacionadas con la edad [11,12]. Teniendo esto en cuenta, hoy en día se presta más atención a las estrategias para la "muerte" dirigida de células senescentes[13-15]. Con este fin, se está desarrollando activamente una nueva clase de fármacos denominados senolíticos. Los senolíticos se dirigen a las vías de señalización que contribuyen a la resistencia de las células senescentes a la apoptosis, induciendo así la apoptosis preferentemente en las células senescentes[16]. La lista de senolíticos se repone constantemente con nuevos agentes. Los compuestos más conocidos con la actividad senolítica indicada son navitoclax (inhibidor de la familia Bcl-2), una combinación de dasatinib (un inhibidor de múltiples tirosina quinasas) y quercetina (un flavonol natural), inhibidores de Hsp90, inhibidores de MDM2, FOXO{ {8}}péptido de interferencia p53, un degradador de proteínas de la familia BET, CAR-T específico de uPAR, navitoclax conjugado con galacto y varios compuestos naturales senolíticos[16-24]. Recientemente, dos grupos de investigación independientes identificaron los glucósidos cardíacos, en particular la uabaína, la digoxina y la bufalina, como senolíticos de amplio espectro [25,26].opiniones sobre la cistanche tubulosaVale la pena mencionar que casi todos los senolíticos declarados tienen limitaciones, como efectos secundarios indeseables o ineficacia hacia algunos tipos de células. Las células madre mesenquimales (MSC), que se encuentran prácticamente en todos los órganos/tejidos posnatales, se caracterizan por la capacidad de autorrenovarse (divisiones simétricas) y diferenciarse, contribuyendo así al mantenimiento y la regeneración del tejido residente [27]. Debido a estas propiedades únicas, junto con las potentes funciones antiinflamatorias e inmunosupresoras, las MSC se aplican ampliamente en la terapia de reemplazo celular para el tratamiento de diversas enfermedades, incluida la diabetes mellitus, la esclerosis múltiple, el infarto de miocardio, etc. [28]. Sin embargo, al igual que sus progenies diferenciadas y otras células unipotentes, las MSC son capaces de envejecer de forma replicativa o prematura en respuesta a la activación de oncogenes y estímulos estresantes [29, 30]. La senescencia de las MSC tiene muchas consecuencias indeseables, entre las que se encuentran el agotamiento del grupo de células madre, mantenimiento y regeneración de tejidos reducidos, capacidad de diferenciación alterada, propagación de senescencia mediada por SASP, propiedades angiogénicas reducidas, modificación del nicho de células madre [29,31-33]. Teniendo en cuenta la importancia biológica del funcionamiento adecuado de las MSC, las MSC senescentes podrían considerarse el objetivo crucial para el análisis. De acuerdo con esta sugerencia, durante el año pasado se publicaron varias revisiones que destacan los posibles resultados ventajosos de la eliminación de las CMM senescentes [29, 31,34,35]. Sin embargo, solo hay unos pocos datos experimentales sobre este tema [36-40].

En el presente estudio, demostramos por primera vez que los glucósidos cardíacos, a saber, la ouabaína y la bufalina, no muestran actividad hemolítica frente a las MSC humanas (hMSC) derivadas del endometrio (END-MSC), tejido adiposo (AD-MSC), el pulpa dental (DP-MSC) y gelatina de Warton (WJ-MSC). Además, confirmamos que ambos glucósidos cardíacos son capaces de inducir la apoptosis preferentemente en senescente A549 y SK-HEP-1, como se describió anteriormente. en los estudios piloto [25,26]. Al evaluar las alteraciones en la homeostasis iónica causadas por los niveles de expresión y bloqueo de Nat/K más -ATPasa de los genes relacionados, revelamos que la ausencia de análisis inducido por ouabaína podría estar mediada por la mayor eficacia de la importación compensatoria de K más en END senescentes. MSC en comparación con A549 senescente. Además, utilizando bioinformática avanzada, demostramos que la senescencia de END-MSC, resistentes al análisis inducido por uabaína, se acompaña de la adquisición de un fenotipo resistente a la apoptosis, mientras que la senescencia de A549 sensible a uabaína no lo es. Es importante destacar que el bloqueo de la actividad de la proteína antiapoptótica MCL-1 antes del tratamiento con glucósidos cardíacos dio como resultado el análisis de END-MSC senescentes resistentes a la apoptosis. Por lo tanto, proporcionamos evidencia clara de que la resistencia a la apoptosis no es una característica general de las células senescentes. Con base en los datos obtenidos, concluimos que la efectividad de los enfoques analíticos podría depender de si las células realmente se volvieron resistentes a la apoptosis durante el desarrollo de la senescencia.

materiales y métodos

Células

END-MSC, WJ-MSC, DP-MSC, AD-MSC, A549 y SK-Help se obtuvieron de la Colección Rusa de Cultivos Celulares (Instituto de Citología, San Petersburgo, Rusia). Las líneas A549 y SK-Help se autenticaron mediante pruebas de cariología, tumorigenicidad, isoenzimas (LDH y G6PD) y análisis STR. Las células se cultivaron en medio completo DMEM F12 (Gibco BRL) complementado con 10 % de FBS (HyClone), 1 % de penicilina-estreptomicina (Gibco BRL) y 1 % de glutámico (Gibco BRL). Todas las células se analizaron de forma rutinaria para detectar contaminación por micoplasma.

Condiciones que inducen la senescencia y el estrés

Para la senescencia inducida por el estrés oxidativo, las END-MSC/WJ-MSC se trataron con 200 uM/100 uM HO(Sigma) durante 1 h. Para la senescencia inducida por doxorrubicina, las DP-MSC/A549 se trataron con 1 μM de doxorrubicina (Veropharm) durante 3 días. En cada caso, las células se consideraron senescentes no antes de 14 días después del tratamiento. Para la senescencia replicativa, las AD-MSC antes del cuarto paso se identificaron como células de control y después del décimo como senescentes. Para la senescencia inducida por etopósido A549/END-MSCs/SK-Help se trataron con etopósido 2 uM/5 uM/3 uM (Veropharm) durante 3 días y se analizaron no antes de los 7 días después de la inducción de la senescencia. En este caso, el diseño del tratamiento coincidió completamente con los descritos en el estudio del que se originaron los datos de RNA-seq (Wang et al., 2017). Dos glucósidos cardíacos que aplicamos como compuestos senolíticos: Ouabain (Sigma) y Bufalin (Calbiochem).

Para comparar la resistencia al estrés entre el control y las END-MSC senescentes o A549, las células se trataron con H O2 400/800 uM (Sigma) durante 1 h o con estaurosporina 0,3/1 uM (Sigma). La viabilidad celular se analizó 48 h después de la inducción del estrés.

Para bloquear la actividad de MCL-1, se pretrataron END-MSC con 10 uM de A-1210477(Sigma) durante 3 días.

Análisis de citometría de flujo

Las mediciones de viabilidad celular, proliferación, tamaño celular, autofluorescencia, tasas de apoptosis, escisión de caspasa 3/7, potencial de membrana mitocondrial y despolarización de membrana se llevaron a cabo mediante citometría de flujo. La citometría de flujo se realizó con CytoFLEX (Beckman Coulter) y los datos obtenidos se analizaron con el software CytExpert versión 2.0. Las células adherentes se enjuagaron dos veces con PBS y se recolectaron por tripsinización. Las células desprendidas se agruparon y se resuspendieron en medio fresco y luego se contaron y analizaron en cuanto a autofluorescencia. Para acceder a la viabilidad celular, se añadieron 50 ug/ml de yoduro de propidio (Life Technologies) a cada muestra justo antes del análisis. El tamaño de las células se evaluó mediante dispersión de luz frontal citométrica de células negativas para PI. La inducción de apoptosis se verificó usando tinción conjunta con Anexina-V-APC (Invitrogen) y DAPI (Sigma) siguiendo las instrucciones del fabricante. La actividad de la caspasa se evaluó utilizando el kit de ensayo de citometría de flujo verde CellEventTM Caspase-3/7 (Invitrogen) siguiendo el protocolo del fabricante. La pérdida de potencial de membrana mitocondrial se evaluó utilizando el tinte radiométrico JC-1 (Invitrogen). El procedimiento de tinción se llevó a cabo de acuerdo con el protocolo del fabricante. Para la despolarización de la membrana, utilizamos una sonda fluorescente DiBAC4(3) (Invitrogen).

Tinción de galactosidasa asociada a la senescencia

La tinción con galactosidasa asociada a la senescencia (SA- -Gal) se realizó usando un kit de tinción con galactosidasa por senescencia (Cell Signaling Technology) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El análisis cuantitativo de las imágenes se produjo con la aplicación del paquete MatLab, según el algoritmo descrito anteriormente[41]. Para cada punto experimental, se analizaron no menos de 50 células seleccionadas al azar.

transferencia occidental

Western Blot se realizó como se describe anteriormente [41]. Se realizaron electroforesis SDS-PAGE, transferencia a una membrana de nitrocelulosa e inmunotransferencia con detección ECL (Thermo Scientific) de acuerdo con los protocolos estándar del fabricante (Bio-Rad Laboratories). Se utilizaron anticuerpos contra las siguientes proteínas: gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH)(clon 14C10), fosfo-p53(Ser15), p21(clon 12D1), fosfo-Rb (Ser807/811) , HMGB1 (clon D3E5), así como IgG anticonejo de cabra conjugada con peroxidasa de rábano picante. Las tasas de dilución fueron 1:1000 para todos los anticuerpos primarios y 1:7000 para los secundarios. Todos los anticuerpos se adquirieron de Cell Signaling. Se usó Scion Image 4.0 (Scion Corporation) para seleccionar y determinar la densidad sustraída de fondo de las bandas en todos los geles y transferencias.

Análisis transcriptómico

En el análisis se utilizaron muestras de los siguientes tres conjuntos de datos Gene Expression Omnibus (GEO) RNA-seq: GSE102639 (GSM2742113-GSM2742114 y GSM2742121-GSM2742122 para control y senescentA549cells, en consecuencia); GSE122081(GSM3454482-GSM3454484 y GSM3454500-GSM3454502 para células IMR de control y senescentes-90, según corresponda); y nuestro conjunto de datos GSE160702 (GSM4877895-GSM4877898 y GSM4877907-GSM4877910 para control y END-MSC senescentes, respectivamente). Los datos de todos los conjuntos de datos se procesaron de la misma manera.

Los datos de lectura sin procesar se sometieron a filtrado de calidad y recorte de adaptador a través de scripts FilterByTile y BBDuk del paquete BBtools (versión 38.75) utilizando las opciones predeterminadas. Las lecturas restantes se filtraron y recortaron adicionalmente con el uso de un script trimestral del paquete FastqPuri (versión 1.0.7).cistancheLa operación de recorte se aplicó para ambos extremos de las lecturas si contenían N o su calidad estaba por debajo del umbral de calidad establecido en 27, todas las lecturas de menos de 25 bases se descartaron. El control de calidad del recorte se realizó con el software FastQC (versión 0.11.7) y scripts FastqPuri. Las lecturas, habiendo superado todas las operaciones, comprenden no menos del 90 por ciento de los datos iniciales.

Las abundancias de transcritos se estimaron utilizando el mapeo ligero de Salmon (versión 1.1.0) que se ejecuta en el modo de alineación selectiva. La lista de señuelos se generó en base al genoma de referencia humano Gencode GRCh38.p13 (versión 33) y se usó más para construir el índice en los archivos de referencia Gencode del transcriptoma y el genoma concatenados (versión 33) usando un tamaño de kmer de 21. Se ejecutaron operaciones de mapeo con banderas adicionales——numBootstraps 30——lentejuelas——gcBias——validar asignaciones. Las tasas de mapeo resultantes fueron de alrededor del 70 por ciento.

El procesamiento de datos adicional se realizó utilizando R versión 3.6.3 con la colección de paquetes Tidyverse (versión 1.3.0). Los recuentos de genes estimados, los metadatos y los rangos de transcripción se cargaron en R y se resumieron a nivel de gen usando tximeta (versión 1.4.5). La matriz de recuento resultante se filtró para contener filas con al menos 5 recuentos estimados en todas las muestras, la matriz resultante contenía 20 400 genes.

Para la representación de mapa de calor y PCA, los recuentos de lectura se normalizaron mediante la transformación de registros del paquete DESeq2 (versión 1.26.0).agua de cistancheLos mapas de calor se construyeron con el uso de filtros genéticos (versión 1.38.0) y mapas de calor (versión 1.0.12) R. La validación de las muestras de división por variable de senescencia se realizó mediante subconjuntos de recuentos de lectura normalizados por genes relacionados con el término "senescencia celular" de Gene Ontology (GO 0090398). El análisis de expresión diferencial y la estimación de los cambios de pliegue logarítmico se calcularon utilizando DESeq2 para la última variable en la fórmula de diseño que controla el estado de senescencia de las células, la reacción al tratamiento con ouabaína y la interacción de los factores indicados. Para fortalecer las pruebas de expresión diferencial, se aplicó la corrección de cambio de pliegue logarítmico usando una combinación de estimador de contracción adaptativo del paquete palm (versión 1.8.0) y especificando un umbral adicional de cambio de pliegue logarítmico igual a 0.667. Las estimaciones reducidas resultantes se usaron aún más para la clasificación de genes y ejecutar el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes utilizando el perfil de grupo (versión 3.14.3) y los paquetes R de fusibles (versión 1.12.0) con valores de p ajustados para comparaciones múltiples de acuerdo con el método Benjamin-Hochberg. Las muestras de micromatrices de Affymetrix para control y AD-MSC senescentes se obtuvieron de la base de datos GEO (GSE66236) y se procesaron con la aplicación web Phantasus con log2 y normalización de recuentos de cuantiles. El análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes se realizó con el uso de un paquete fuse (versión 1.12.0)R.

Extracción de ARN, transcripción inversa y PCR en tiempo real

La extracción de ARN, la transcripción inversa y la PCR en tiempo real se realizaron como se describe en nuestro estudio anterior [32]. Los reactivos para la extracción de ARN (reactivo de extracción de ARN), la transcripción inversa (kit MMLV RT) y la PCR en tiempo real (kit HS SYBR) se obtuvieron de Evrogen. Los niveles de expresión génica se evaluaron utilizando el amplificador BioRad CFX-96 PCR en tiempo real (BioRad) con el siguiente programa de ejecución para todos los genes investigados: 40 ciclos de fusión durante 10 s a 95 grados, hibridación durante 15 s a 57,5 ​​grados , y síntesis durante 15 s a 72 grados . Se aplicó el análisis de curvas de fusión para controlar la especificidad de las reacciones. El siguiente análisis de los datos obtenidos se realizó utilizando el software Bio-Rad CFX Manager (BioRad) con el método de cuantificación estándar 2deltaCt con el uso de la expresión GAPDH como referencia. Las secuencias de los cebadores se enumeran en la Tabla 1.

análisis estadístico

Para obtener significancia en la diferencia entre los dos grupos se aplicó la prueba t de Student o la prueba t de Welch. Para comparaciones múltiples entre grupos, se utilizó ANOVA con HSD de Tukey. A menos que se indique lo contrario, todos los datos cuantitativos se muestran como media ± DE y los asteriscos indican diferencias significativas de la siguiente manera: ns, no significativo,*p<0.05,><><0.001. statistical="" analysis="" was="" performed="" using="" r="">

Resultados

Las END-MSC tratadas con H2O2- entran en la senescencia prematura

En el presente estudio, utilizamos células madre mesenquimales humanas aisladas de endometrio descamado (END-MSC), que cumplen los criterios mínimos sugeridos por el ISCT para definir hMSC [41]. Anteriormente, hemos desarrollado un modelo experimental confiable para estudiar varios aspectos de la senescencia prematura de END-MSC [30]. Concretamente, hemos demostrado que las END-MSC sometidas a estrés oxidativo subletal adquirieron gradualmente todas las características típicas de las células senescentes, incluidos focos persistentes de daño en el ADN y respuesta activa al daño en el ADN, detención irreversible del ciclo celular mediada por el clásico p53/p21/Rb vía, pérdida de proliferación, hipertrofia celular, aparición de tinción SA- -Gal y desarrollo del fenotipo secretor asociado a la senescencia [30, 32, 42]. Aquí aplicamos el modelo diseñado para estudiar el efecto senolítico de la uabaína, así como para revelar las alteraciones intracelulares subyacentes en la homeostasis iónica. Inicialmente, al estimar los parámetros más comunes, confirmamos que el tratamiento con una dosis única (1 h, 200 μM) de HO fue suficiente para inducir la senescencia en END-MSC. Es importante destacar que las END-MSC estresadas se consideraron senescentes dos semanas después del estrés oxidativo; por lo tanto, todos los marcadores de senescencia se evaluaron no antes de 14 días después del tratamiento con H-Oz. De hecho, el tratamiento con H-Oz de END-MSC condujo al bloqueo de la proliferación, la hipertrofia celular como lo indica el aumento del tamaño celular, la acumulación de lipofuscina detectada por la elevación de la autofluorescencia, la aparición de SA- -Gal, la activación de la La vía p21/Rb y la pérdida de HMGB1 respaldan el establecimiento de la senescencia en las condiciones experimentales elegidas (Fig. ac, e, f).

Se cree que los efectos más dañinos de las células senescentes a nivel de tejidos y organismos son consecuencia de su vitalidad prolongada. De acuerdo con este punto, las END-MSC tratadas con HO? conservaron una alta viabilidad incluso en las últimas etapas del desarrollo de la senescencia (la viabilidad de las END-MSC senescentes se evaluó 17 días (14 días + 3 días) después del estrés oxidativo inicial) (Fig. 1d ). En resumen, el tratamiento subletal con HO2-de las END-MSC es el modelo apropiado de senescencia prematura y es relevante para investigar los efectos de los compuestos senolíticos en las END-MSC.

El glucósido cardíaco uabaína no tiene actividad senolítica frente a las END-MSC senescentes en un amplio rango de concentraciones

La evidencia reciente sugiere que los glucósidos cardíacos, incluida la uabaína, la digoxina y la bufalina, representan una familia de compuestos con actividad hemolítica [25,26]. Aunque hoy en día los glucósidos cardíacos se consideran senolíticos de amplio espectro, faltan datos sobre sus efectos en las hMSC senescentes. Por lo tanto, aquí probamos si la ouabaína tiene el potencial de inducir la muerte selectivamente en END-MSC senescentes. Para hacerlo, evaluamos la viabilidad del control y las END-MSC senescentes después del tratamiento con uabaína en el amplio rango de concentración (desde 10-' a 10~ M). Curiosamente, ninguna de las concentraciones aplicadas condujo a una disminución notable en la viabilidad de las células de control y senescentes el primer día después de la aplicación de ouabain (Fig. 2 y Fig. S1 complementaria).

Sin embargo, al tercer día después del tratamiento con ouabaína, revelamos una disminución significativa dependiente de la dosis en la viabilidad de las END-MSC de control (Fig. 2a y Fig. S1 complementaria). Inesperadamente, las células senescentes resultaron ser más resistentes a la uabaína en cada concentración probada. De acuerdo con este resultado,10-m ouabain condujo a una muerte apoptótica más propensa en las células de control (20,75 % An plus /PI- y 36,47 % An plus /PI plus ) en comparación con las senescentes (15,01 % An+/PI -y 12,15 por ciento An plus /PI plus )(Fig.2b). Los resultados obtenidos demuestran claramente que en el contexto de END-MSC senescentes, la ouabaína no tiene actividad senolítica.

Para excluir los posibles efectos asociados con la variabilidad de los estímulos inductores de la senescencia sobre la acción senolítica de la uabaína, realizamos un conjunto adicional de experimentos. Es decir, tratamos END-MSC con etopósido en lugar de estrés oxidativo para inducir la senescencia prematura.bioflavonoides cítricosLas END-MSC tratadas con etopósido mostraron todas las características típicas de las células senescentes (Fig. 3a-e).

Es importante destacar que la ouabaína no tuvo acción hemolítica hacia las END-MSC senescentes tratadas con etopósido (Fig. 3f y Fig. S2 del suplemento mental). Estos datos proporcionan una confirmación adicional de los resultados anteriores y evidencian que la falta de análisis inducido por ouabaína no es la consecuencia del disparador de senescencia concreto utilizado para inducir la senescencia.

Fig. 1 Validación del modelo de senescencia prematura de END-MSC inducida por estrés oxidativo. Las END-MSC senescentes a proliferan libremente, b sufren hipertrofia, c adquieren una autofluorescencia elevada, retienen una alta viabilidad celular d y e muestran actividad SA- -Gal en comparación con las de control. f Los niveles de fosforilación de p53 y Rb y los niveles de expresión de las proteínas p21 y HMGBI en control y senescentes END-Ouabain no tiene acción hemolítica hacia las células madre mesenquimales humanas de varios orígenes Para ampliar nuestras observaciones con respecto a la ausencia de análisis inducido por ouabain en END-MSC , analizamos los efectos de la uabaína en las hMSC aisladas de otras fuentes, incluido el tejido adiposo, la pulpa dental y la gelatina de Wharton. Para fortalecer aún más nuestros datos, aplicamos diferentes modelos de senescencia: senescencia replicativa para AD-MSC, senescencia inducida por doxorrubicina para DP-MSC y senescencia inducida por estrés oxidativo para WJ-MSC (Fig. 4a-f).

Como se muestra en la Fig. 4g, varios tipos de hMSC diferían en la viabilidad tras el tratamiento con ouabaína, por ejemplo, tanto las DP-MSC de control como las senescentes eran mucho más resistentes a la acción de la ouabaína que las WJ-MSC (Fig. 4g y Fig. S3b complementaria, C). Sin embargo, la ouabaína no pudo inducir la senólisis en ninguno de los tipos de hMSC senescentes (Fig. 4g y Fig. S3 complementaria). Juntos, los datos obtenidos demuestran que la ausencia de análisis inducido por uabaína es una característica común para varios tipos de hMSC. MSC. Los valores presentados son medias ± DE. Para comparaciones de grupos múltiples en a y d, se aplicó ANOVA unidireccional, n=3, ns no significativo,***p<0.001. for="" pair="" comparisons="" at="" b,c="" and="" e="" welch's="" t-test="" was="" used,n="3" for="" b="" and="" c,n="50" for=""><0.001. scale="" bars="" for="" images="" are="" 500="">

GAPDH se utilizó como control de carga

La bufalina del glucósido cardíaco no logra matar a los senescentes END-MSCS

Para verificar la ausencia de acción senolítica de los glucósidos cardíacos hacia las hMSC, aplicamos bufalina, otro compuesto con la actividad senolítica declarada perteneciente a la familia de los glucósidos cardíacos [25]. La bufalina casi no tuvo efecto sobre la viabilidad del control y las END-MSC senescentes tratadas con H2O2-en un amplio rango de concentración (de 10-7 a 10-5 M) (Fig. 5a y Figura S4a).

De manera similar a lo que observamos para el tratamiento con ouabaína, la ausencia de análisis con bufalina fue independiente de los estímulos inductores de la senescencia, ya que la viabilidad de las ESC que envejecieron en respuesta al estrés oxidativo o al etopósido no se vio afectada (Fig. 5a, b, Fig. Suplementaria S4a, b). Los resultados descritos anteriormente confirman que los glucósidos cardíacos resultaron ser ineficaces para la inducción de muerte dirigida en END-MSC senescentes. MSC. Los valores presentados son medias ± DE. Para comparaciones de grupos múltiples en a y d, se aplicó ANOVA unidireccional, n=3, ns no significativo,***p<0.001. for="" pair="" comparisons="" at="" b,c="" and="" e="" welch's="" t-test="" was="" used,n="3" for="" b="" and="" c,n="50" for=""><0.001. scale="" bars="" for="" images="" are="" 500="" um.="" gapdh="" was="" used="" as="" a="" loading="">

La bufalina del glucósido cardíaco no logra matar a los senescentes END-MSCS

Para verificar la ausencia de acción senolítica de los glucósidos cardíacos hacia las hMSC, aplicamos bufalina, otro compuesto con la actividad senolítica declarada perteneciente a la familia de los glucósidos cardíacos [25]. La bufalina casi no tuvo efecto sobre la viabilidad del control y las END-MSC senescentes tratadas con H2O2-en un amplio rango de concentración (de 10-7 a 10-5 M) (Fig. 5a y Figura S4a).

De manera similar a lo que observamos para el tratamiento con ouabaína, la ausencia de análisis con bufalina fue independiente de los estímulos inductores de la senescencia, ya que la viabilidad de las ESC que envejecieron en respuesta al estrés oxidativo o al etopósido no se vio afectada (Fig. 5a, b, Fig. Suplementaria S4a, b). Los resultados descritos anteriormente confirman que los glucósidos cardíacos resultaron ser ineficaces para la inducción de muerte dirigida en END-MSC senescentes.

Fig. 2 La uabaína no tiene actividad hemolítica frente a las END-MSC senescentes tratadas con HO2-en un amplio rango de concentraciones. Viabilidad celular relativa (porcentaje) de control y END-MSC senescentes en 3 días después del tratamiento con 1077,10~6,10-5 Muabaína. b Inducción de apoptosis en END-MSC sobre 10-6 Muabaína evaluada mediante tinción doble con anexina V/DAPI. n=3 experimentos independientes. Todos los datos corresponden a la media ± DE. La significación estadística se evaluó mediante la prueba t de Welch: ns no significativa, ***p<>

Tanto la ouabaína como la bufalina, glucósidos cardíacos, pueden inducir la muerte celular selectivamente en células senescentes A549 y SK-Hep1.

Teniendo en cuenta el hecho de que nuestros resultados no se corresponden con la evidencia publicada recientemente sobre la acción senolítica de amplio espectro de los glucósidos cardíacos, decidimos reproducir este efecto utilizando el modelo celular descrito en los estudios relevantes [25,26]. Por lo tanto, realizamos una serie de experimentos utilizando células de carcinoma de pulmón A549 de control y senescentes. La senescencia en células A549 fue inducida por tratamiento con etopósido. La senescencia inducida por etopósido de las células A549 es un modelo de senescencia inducida por terapia que se usa con frecuencia y, por lo tanto, está bien caracterizado [4]. Además, se demostró que la ouabaína elimina selectivamente las células A549 senescentes tratadas con etopósido[25]. de la vía p53/p21/Rb y el nivel de expresión de HMGB1 (Fig. 6a-e).

Para verificar la actividad hemolítica de la uabaína hacia las células cancerosas senescentes, primero estimamos la viabilidad celular dependiente de la dosis. De acuerdo con nuestros resultados descritos anteriormente, no pudimos detectar ninguna disminución significativa en la cantidad de control viable o células A549 senescentes dentro de las 24 h posteriores a la aplicación de ouabain (Fig. S5a complementaria). Sin embargo, 3 días después del tratamiento, la ouabaína redujo significativamente la viabilidad de las células A549 senescentes de manera dependiente de la dosis, mientras que la cantidad de células A549 de control disminuyó en mucha menor medida (Fig. 7a y Fig. Suplementaria S5a). Es decir, aproximadamente el 90 por ciento de las células de control conservaron la viabilidad en 10- Muabaína en comparación con el 50 por ciento de las células A549 senescentes tratadas con la misma dosis (Fig. 7a). Además, las células A549 senescentes eran más propensas a la muerte celular inducida por bufalina que sus contrapartes de control (Fig. 7b) (Fig. 5b y Fig. S5b complementaria).

Según los datos publicados, la ouabaína desencadenó la apoptosis dependiente de caspasa-3-en células A549 senescentes [26]. De hecho, revelamos un aumento significativo en la fracción doble positiva y/o PI en células cancerosas senescentes tratadas con 10-6muabaína (Fig. 7c). Además, mediante el ensayo de fluorescencia observamos la activación de caspasa-3 en células A549 senescentes tratadas con ouabaína (Fig. 7d). En conjunto, estos resultados son completamente consistentes con los datos descritos por otros autores y confirman la actividad hemolítica de la uabaína hacia A549.

Además, utilizamos doxorrubicina en lugar de etopósido para causar senescencia en A549 (Fig. 8a-e). Como se esperaba, el A549 senescente tratado con doxorrubicina, así como el tratado con etopósido, demostraron una mayor sensibilidad tanto a la ouabaína como a la bufalina en comparación con sus contrapartes de control (Fig. 8g y Fig. S6 complementaria). Esto último confirma que los efectos senolíticos de los glucósidos cardíacos son independientes de los estímulos inductores de la senescencia. Por lo tanto, los glucósidos cardíacos tienen efectos senolíticos.

Fig. 3 La uabaína no puede inducir la senólisis en las END-MSC senescentes tratadas con etopósido. Validación del modelo de senescencia inducida por episodios para END-MSC: a capacidad de proliferación, b tamaño celular, c niveles de autofluorescencia y d actividad SA- -Gal, e nivel de fosforilación de Rb y niveles de expresión de proteínas p21 y HMGBI. f Viabilidad celular relativa (porcentaje) de control y células senescentes después del tratamiento con 10-6 ouabaína. Los valores son media ± DE. Para comparaciones de grupos múltiples en un ANOVA de una vía, se aplicaron, n=3, ns no significativo, ***p<0.001.for pair="" comparisons="" at="" b,c,d,f="" welch's="" t-test="" was="" used,="" n="3" for="" b,="" c,f="" n="50" for="" d,="" ns="" not="" significant,=""><0.05,><0.001. scale="" bars="" for="" images="" are="" 500="" μm.="" gapdh="" was="" used="" as="" loading="" control="" activity="" towards="" a549,="" but="" these="" compounds="" turned="" out="" to="" be="" ineffective="" for="" targeted="" death="" induction="" in="" senescent="">

Finalmente, decidimos reproducir los experimentos de análisis en células de cáncer de hígado tratadas con etopósido SK-Help, otro modelo celular con efectos senolíticos comprobados de los glucósidos cardíacos según Guerrero et al. estudio [25] (Fig. 9a-e). El SK-Help senescente tratado con etopósido demostró una mayor sensibilidad a ambos agentes en comparación con sus contrapartes de control, lo que demuestra la acción hemolítica de los glucósidos cardíacos hacia este tipo de células (Fig. 9f y Fig. S7 complementaria).

Juntos, estos datos evidencian que la selectividad de la hemólisis inducida por los glucósidos cardíacos depende más de la naturaleza celular que del desencadenante concreto de la senescencia.

Este artículo está extraído de Cellular and Molecular Life Sciences (2021) 78:7757–7776 https://doi.org/10.1007/s00018-021-03980-x