Se han aislado numerosos compuestos terapéuticos de recursos orgánicos naturalmente abundantes

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Numerosos compuestos terapéuticos se han aislado de recursos orgánicos naturalmente abundantes, que pueden ofrecer fuentes económicas y sostenibles de compuestos con actividades biológicas seguras y eficaces. En la industria cosmética se buscan con avidez compuestos naturales con actividades antienvejecimiento. Por lo tanto, preparamos varios extractos de hojas de Rubusfraxinifolius y utilizamos ensayos de inhibición enzimática para aislar compuestos con efectos protectores contra el envejecimiento de la piel. Se aislaron dos triterpenoides de Rubus fraxinifolius Poir. hojas. Las estructuras se caracterizaron mediante análisis espectroscópicos (LC-ESI-MS, 1D/2D NMR) y comparación con los datos notificados. Los compuestos 1 y 2 se determinaron como 2,3-O-etilenglicol,19-hidroxiurs-12-en-23,28-ácido dioico y 2,{{15} }O-propanodiol,19-hidroxiurs-12-en-28-ácido oico. El extracto de metanol y los aislados se evaluaron por sus efectos inhibidores sobre la elastasa y la tirosinasa. Los compuestos 1 y 2 inhibieron la elastasa con ICso 122,199 ug/mL y 98,22 ug/mL, y también inhibieron la tirosinasa con ICso 207,79 ug/ejército y 221,51 ug/mL, respectivamente. El acoplamiento molecular demostró que ambos compuestos tienen afinidades hacia las enzimas.

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Si bien es difícil de lograr, las sustancias antienvejecimiento naturales que son seguras para los humanos se pueden cosechar de manera económica y sostenible a partir de abundantes recursos naturales. Alrededor de 700 especies de Rubus (Rosaceae) se distribuyen globalmente, aunque se encuentran pocas especies en los trópicos. Este género contiene nutrientes (azúcar, vitaminas, etc.), metabolitos secundarios (triterpenoides, flavonoides, polifenoles, etc.) y tiene muchas actividades antienvejecimiento (antioxidante, antielastasa, antitirosinasa, anticolagenasa, anti-UV, antiinflamatorio, cicatrizante, etc.)1. Además, las especies de Rubus también reportaron contener diversos triterpenos con diversas actividades biológicas -'.

En Indonesia, R. fraxinifolius Poir. (Rosaceae) se distribuye en Java, Borneo, etc., y se conoce popularmente como 'urban.que es la cistancheAdemás, algunos agricultores locales cosechan estas plantas, y la baya generalmente se consume fresca o congelada. Nuestro estudio anterior demostró que el extracto de tallo de R. frascinifolius tiene actividad para inhibir la elastasa, la tirosinasa y como antioxidante8. Algunas otras investigaciones también mostraron que la hoja y el fruto de R. fraxinifolius tienen una potente actividad antioxidante. 10. Sin embargo, el estudio de R. fraxinifolius ha sido poco investigado y no se han informado estudios de componentes químicos.

Cistanche puede antienvejecimiento

La elastasa es una enzima serina proteasa, que tiene un papel crucial en las arrugas o la flacidez de la piel a través de la degradación de la fibra elástica dérmica (elastina) y provoca la pérdida de elasticidad de la piel. Uno de ellos es la elastasa derivada de fibroblastos de la piel. Así, como moderadores de la degradación de la fibra de elastina que causa el envejecimiento de la piel, los inhibidores de elastasa han llamado la atención como agentes para preparaciones cosméticas,12. La melanogénesis está mediada por tirosinasa y regula la biosíntesis de melanina a través de una reacción en dos etapas. En el paso inicial, la L-tirosina se hidroxila a L-3,4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA). En el segundo paso, la L-DOPA se oxida a la O-quinona correspondiente. Por lo tanto, los compuestos naturales con actividad inhibidora de la tirosinasa se usan comúnmente en cosméticos que inhiben la hiperpigmentación con melanina y, por lo tanto, favorecen el blanqueamiento de la piel.Cistanche antiedadLos inhibidores de las enzimas elastasa y tirosinasa podrían desarrollarse como agentes blanqueadores de la piel, antienvejecimiento o antiarrugas para tratar trastornos dermatológicos44.

Este estudio aisló triterpenoides ursanos de las hojas de R. fraxinifolius y elucidó sus estructuras en análisis espectroscópicos utilizando espectroscopia de masas de ionización por electropulverización (ESI-MS) y 'H NMR, |3CNMR y 2D NMR (DEPT, HSQC, HMQC y HMBC). Posteriormente, realizamos ensayos de actividades inhibidoras de elastasa y tirosinasa de extractos crudos, fracciones y compuestos aislados.

La actividad de dos compuestos seleccionados también se observó a través del método in silico en esta investigación. Se realizó un enfoque de acoplamiento molecular con DockThorl516. Las macromoléculas utilizadas en esta investigación se obtuvieron del banco de datos de proteínas (RCSB PDB, 2000) con identidades 2y9x y 3hgp para tirosinasa y elastasa, respectivamente1718. Las macromoléculas se optimizaron en UCSF Chimera y los resultados del acoplamiento molecular se observaron con PyMOL1920.

Resultados y discusión

The ethyl acetate and methanolic extracts of R. fraxinifolius leaves showed potential as elastase inhibitors with percent inhibitory>40 por ciento en 100 ug/mL, mientras que el extracto de n-hexano no tuvo actividad (Fig. 1). Algunos Rubus también mostraron actividad inhibidora de elastasa como R. Sanctus (porcentaje de inhibición 14.68-49.20 en 100 ug/mL), R.compactus,R. robustus, etc.221. Por lo tanto, fraccionamos los extractos activos mediante cromatografía líquida al vacío/VLC y recolectamos todas las fracciones de cada uno. Las fracciones del extracto de acetato de etilo mostraron actividades inhibidoras débiles de elastasa (<20% in="" 100="" ug/ml),but="" some="" methanol="" fractions="" showed="" potential="" activity="" in="" these="" assays.="" we="" choose="" metha-nol="" fraction="" 8(m8)for="" further="" isolation="" because="" it="" hadthe="" largest="" yield(57%)="" and="" also="" have="" elastase="" inhibitory="" activity(44.82%).m8="" was="" further="" partitioned="" and="" purified="" over="" silica="" gel="" and="" through="" a="" sephadex="" column,="" and="" two="" amorphous="" powders="" were="">

Los aislamientos se identificaron y caracterizaron mediante cromatografía líquida-espectroscopia de masas (LCMS), 'H y 13CNMR, DEPT, coherencia cuántica única heteronuclear (HSQC), correlación cuántica múltiple heteronuclear (HMQC) y correlación de enlace múltiple heteronuclear (HMBC). La Tabla 1 muestra los datos espectrales de RMN de los compuestos.

Compuesto 1: se aisló como un polvo blanco amorfo. Los espectros LCMS-ESI para este compuesto mostraron un pico de iones moleculares en m/z 543,32[MH]t, lo que sugiere la fórmula molecular C32H48O- con nueve equivalentes de insaturación. Los espectros IR revelaron máximos de absorción correspondientes a hidroxilo (3,343,4 cm-l) y grupos funcionales olefínicos (1,684 cm-1). Además, los espectros de 'H RMN del compuesto I revelaron una señal de protón metino (CH) en un singlete de 2,6, una señal característica para el H-18 del tipo ursano triterpenos con 19-O-sustituciones. El triterpeno tipo 19a-hidroxi-ursano también tiene una señal típica de protones en el área alrededor de ou 2.6 ppm. Esta señal sin blindaje puede diferir notablemente de otras señales de protones de metileno ordinales I, con un cambio característico debido a un protón olefínico (H12) a 5,28 (t, J=6Hz).beneficios de la cistancheLas asignaciones de desplazamiento químico 'H y l3C completas e inequívocas fueron asistidas por espectros HMQC (13Cx'H) y HMBC (15Cx'H). A partir del pico cruzado HMBC, se confirmó que el protón en ou 2.60 era H{ {5}}(Figura 2a). Se encontraron otros caracteres específicos para los cinco singletes de metilo en 1.89,1.02,0.82,1.32,1.20(cada uno,H24-27;29),un doblete de metilo en og 0.92(d, J=6 Hz), y la señal del protón olefínico a 5,30(t, J=7 Hz, H-12). Los espectros presentes13CNMR muestran 32 resonancias de carbono, y con los espectros DEPT y HMQC, mostraron dos carbonos carbonílicos (δC183.70,C-28 y 8-178.96,C-23), un carbono olefínico en oc 127,23,C-12,un carbono cuaternario olefínico(oc139,49,C-13),un carbono cuaternario portador de oxígeno （o-72,7, C-19 ）, diez metilenos alifáticos y seis carbonos de metilo. Los dos carbonos olefínicos en δ-127.23（C-12） y 139.49(C-13) eran característicos del tipo ursano-triterpenoide. Otra señal indicó la presencia de etilenglicol （-OCH-CH-O-） en señales en δ4.62（d, J=11.5 Hz）,4.05（d, J=11. 5 Hz）,3.52（d, J=11.5Hz）y 4.06（d, J=11.5Hz）y compatible con δ61.27（t）y 63.20（t）. Estaba ubicado en C-2yC-3 basado en la presencia de correlación de largo alcance en los espectros HMBC. Por lo tanto, el compuesto 1 se identificó como 2,3-O-etilenglicol,19-hidroxiurs-12-en-23,28-ácido dioico (Fig. 3a).

Compuesto 2: se obtuvo como un polvo amorfo blanco. MS-ESI m/z 527,33 [MH]t (calcd. For 528,3815). En los espectros LCMS-ESI, un pico de iones moleculares está presente en m/z 527,33 [MH]t, lo que indica la fórmula molecular CH Os, que requiere 8 grados de instauración. {15}}) y grupos funcionales olefínicos (1.686 cm-1). Además, los espectros de 'HNMR para el compuesto 2 mostraron un singlete de 2,42, que es característico del H18 de un triterpeno de tipo ursano con {{24 }}O-sustitución.Extracto de Cistanche Anti RadiaciónOtros espectros característicos específicos incluyeron la presencia de seis singletes de metilo en og1.22 0.76,0.97,0.69,1.30y 1.17(cada uno,H -24-28,H-30), un doblete de metilo a 0,91 (d,J=7Hz), y la señal del protón olefínico a 5,37 (d, J=7 Hz, H-12). Los espectros l3(CNMR y DEPT correspondientes muestran resonancias de 33 carbonos, y los espectros HSQC y HMQC indican la presencia de un carbono carbonílico (oc 182.23, C-28), un carbono olefínico （δ-129.36, C -12）, un carbono cuaternario olefínico （δ-140.24, C-13）, un carbono cuaternario portador de oxígeno (oc73.68, C-19), once alifáticos metileno y siete carbonos metílicos. Estos datos indicaron que el compuesto 2 lleva un esqueleto de ursano-triterpenoide. Las otras señales indican la presencia del grupo funcional 1,3-propanodiol, en og 3.22(d,J=11 0,5 Hz), 3,42 (d, J=10, 5 Hz), 1,38 (m), 1,51 (m) y 4,02 (d, J=11, 5 Hz) y 3,36 (t, J{ {57}}.5Hz). Su grupo funcional tiene una correlación de largo alcance con C2-C3. Con base en estos resultados, el compuesto 2 se identificó como 2,3-O-Propanediol,{{ 66}}hidroxiurs-12-en-28-ácido oico (Figs. 2b y 3b). Un compuesto similar es el ácido 2,3-O-isopropilideno, aislado de Rubus xanthocarpus.7

En la Tabla 1, todos los espectros de RMN de 'H y 'C se compararon con el ácido tormentoso (TA/2a,3a,19-trihidroxi-12-ursen-28-oico）², que es un El triterpenoide ursano que se ha encontrado en varias especies de Rubus-p El ácido tormentic tenía fuertes similitudes con los compuestos 1 y 2, excepto que diferían los cambios químicos relacionados con C-23 y C31-33. Este resto también se confirmó en Experimentos DEPT, HMQC y HMBC (Fig. 2).

El ácido tormentoso triterpenoide está ampliamente distribuido en los alimentos vegetales naturales. Tiene varias bioactividades: efectos hipoglucemiantes, propiedades antiinflamatorias y antiaterogénicas que reducen la proliferación de células del músculo liso vascular y actividades antiproliferativas en líneas celulares de cáncer de riñón, próstata y melanoma2426. Por lo tanto, debido a que estos compuestos tienen el mismo esqueleto, pueden tener posibles actividades potenciales apropiadas.

La figura 4 representa la actividad inhibidora de elastasa y tirosinasa de los aislados. Los datos obtenidos de los ensayos de inhibición enzimática in vitro se expresaron como desviación estándar (DE). Los compuestos 1 y 2 inhibieron la elastasa con ICso 122,199 y 98,22 ug/mL, y también inhibieron la tirosinasa con ICso 207,79 y 221,51 ug/mL, respectivamente. Algunos triterpenoides pentacíclicos (ácido ursólico y ácido oleanólico) reportaron tener actividad inhibidora de la elastasa2728. El valor de inhibición de elastasa del compuesto 2 también es menor que el del compuesto 1. Ambos compuestos tenían menos actividad de inhibición que el ácido oleanólico de control positivo, que tenía un valor IC50 de 90,39 ug/ml. De acuerdo, estudios previos mostraron una ICso para el ácido oleanólico de 76,5 ug/mL y un valor de ICso de 31,0 ug/ml para el ácido ursólico28. Los análisis cinéticos informados anteriormente de los triterpenos pentacíclicos mostraron que estos compuestos inhiben de manera competitiva y reversible la elastasa de neutrófilos. En el mismo estudio, los experimentos de acoplamiento molecular demostraron que el resto de andamiaje molecular 28-COOH y los dobles enlaces en los triterpenos pentacíclicos son esenciales para sus actividades inhibidoras.

Uno de los problemas que surgen con el aumento de la edad es la hiperpigmentación.hierba de cistanchePor lo tanto, existe una búsqueda continua de agentes aclarantes de la piel o nuevos despigmentantes. La supresión de la tirosinasa puede actuar contra la melanogénesis”. Como se muestra en la Fig. 4, el extracto de metanol y los compuestos I y 2 demostraron actividades moderadas como inhibidores de la tirosinasa.

En esta investigación, también se utilizó el acoplamiento molecular para analizar las actividades de unión de compuestos seleccionados a tirosinasa y elastasa como sus objetivos. Las estructuras cristalinas utilizadas fueron 2Y9X, una estructura cristalina de tirosinasa de Agaricus bisporus con inhibidor tropolona; y BHGP, una estructura cristalina de elastasa pancreática porcina complejada con un potente inhibidor de peptidilo FR130180. Ambos fueron seleccionados porque se obtuvieron del mismo organismo utilizado para el ensayo in vitro de esta investigación. Las macromoléculas también se unen a sus respectivos inhibidores para que se pueda obtener el estado activo de las conformaciones enzimáticas. Los cocristales se usaron como el centro del objetivo de acoplamiento molecular para reducir las probabilidades de unión del compuesto para que el proceso de puntuación sea más eficiente.

A partir del acoplamiento molecular, se obtuvieron afinidades de unión promedio para ambos compuestos, como se muestra en las Figs. 5 y 6. La predicción de afinidad se usa para clasificar diferentes ligandos considerando la pose de energía superior de cada compuesto, una predicción de una mejor pose de energía se muestra mediante puntuaciones más bajas de afinidades de unión16. El reacoplamiento del inhibidor designado tropolona se realizó con afinidades de unión promedio de -7,41 kcal/mol. Las afinidades de unión medias de los compuestos 1 y 2 a la tirosinasa fueron -7,84 kcal/mol y-8,37 kcal/mol, respectivamente (Tabla 2). Se predijo que ambos compuestos tenían una mejor afinidad que el inhibidor.

Mientras tanto, las afinidades de unión promedio de elastaseredocking fueron -7.84 kcal/mol. Las afinidades de unión medias de los compuestos 1 y 2 a la elastasa fueron -7,58 kcal/mol y -8,06 kcal/mol, respectivamente. Aunque el resultado mostró que el compuesto 1 tiene afinidades más bajas que el cocristal, es ligeramente diferente (<0.5 kcal/mol)compared="" to="" the="" inhibitor="" used="" hence="" the="" scores="" may="" ovelrlap31.="" these="" scores="" showed="" that="" both="" compounds="" were="" predicted="" to="" have="" affinities="" toward="" the="" enzymes,="" which="" is="" in="" conjunction="" with="" the="" in="" vitro="" assay="">

Métodos

Procedimientos experimentales generales. Los espectros de RMN 'H y ' se registraron a 500 MHz usando un instrumento JEOL JNM-ECZ500R/S1. Los espectros infrarrojos (IR) se midieron con un FTIR, IRPrestige-21, Shimadzu. Se realizaron otros análisis utilizando un instrumento Waters UPLC-MIS XEVO G2-XS QTof, un lector de microplacas VersaMax y un lector de microplacas BioTek ELX800, láminas de aluminio recubiertas de lore TLC-Silica gel 60 GF254 (Merck, Darmstadt, Alemania) , la cromatografía en columna (CC) se realizó con gel de sílice 60 (Merck, Darmstadt, Alemania) con malla 70-230 para cromatografía abierta y malla 230-400 para cromatografía al vacío. Materiales vegetales. Se recolectaron hojas de R. fraxinifolius de un área de plantación en el monte Pangrango, Java Occidental a una altura de 4,343 pies, en diciembre de 2018. El espécimen fue identificado por un botánico (Dr. Joni Setijo) en el Centro de Investigación de Biología, Instituto Indonesio de Sciences, Indonesia, con número de espécimen 033/IPH.1.01/If.07. La recolección de material vegetal había recibido permiso del agricultor y cumplía con las normas y directrices institucionales.

Extracción y aislamiento. Hojas en polvo secadas al aire (2300 g) se extrajeron usando un aparato Soxhlet con gradiente de solvente (n-hexano, EtOAc y MeOH) para proporcionar los extractos respectivos, luego se evaporaron con un evaporador rotatorio y horno de vacío. El extracto de metanol (291 g) y el extracto de acetato de etilo (65 g) se adsorbieron en gel de sílice y se realizó una cromatografía líquida al vacío/VLC, eluyendo con un gradiente gradual de EtOAc:MeOH (de 1:0 a 0:1) para producir fracciones para cada extracto (Eal-Hall y M1-Mill and). Se combinaron fracciones similares que tenían reacciones positivas con reactivos sulfúricos de vainillina en TLC. Rendimiento de fracción: Eal-3 (2,27 g);Ea4-6(8,47 g);Ea7-8(12,9 g);Ea9-11 (22,3 g); y M1-3 (4,89 g);M4-5 (5,1 g);M6-7 (6,02g);M8(166,42g);M9(10,53g);M{{38 }}(2,9 g). Todas las fracciones se sometieron a actividad inhibidora de elastasa, p. M8 dio el mayor rendimiento y tuvo una potente actividad. Padre M8 se reparte sucesivamente mediante CC sobre gel de sílice (eluyente CH2Cl2/MeOH con un gradiente gradual) y se purifica utilizando la columna Sephadex LH-20 (eluyendo con CHCl3-MeOH 100:10, v/v. Dos fracciones mostraron naturaleza sólida y se cristalizaron con cloroformo y metanol para obtener dos aislados: compuesto 1 (18 mg) y: 2 (31 mg).La pureza de todos los aislados se evaluó por TLC bidimensional y visualizando la mancha usando sulfúrico al 5 por ciento. ácido en metanol, seguido de calentamiento de las placas a 110 grados durante 5 min.

Los cristales se identificaron y caracterizaron mediante cromatografía líquida-espectroscopia de masas (LCMS), LH y aumento de distorsiones '3C por transferencia de polarización (DEPT) NMR, coherencia cuántica única heteronuclear (HSQC), correlación cuántica múltiple heteronuclear (HMQC) y múltiple heteronuclear. correlación de enlace (HMBC).

Ensayo de inhibición de elastasa. El ensayo de inhibición de elastasa se realizó como se describió anteriormente con algunas modificaciones32. Brevemente, en placas de microtitulación de pocillos Nunc-96,20-μL alícuotas de 0.8-unidades/mL PPE en tampón base de grado Trizma (pH 8.0 ） se mezclaron con 20-μL de muestras y luego se diluyeron las mezclas a 180 μL en tampón base de grado Trizma. Los extractos de prueba se preincubaron con enzima durante 15 minutos y se agregaron alícuotas de 20- μl del sustrato N-succinil-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilida (A3PVN; 2,9 mM) y se incubaron durante otros 15 minutos. Los pocillos de control positivo y blanco contenían ácido oleanólico y agua, respectivamente. Los experimentos se realizaron por triplicado y las tasas de inhibición se determinaron de acuerdo con la absorción; ance a 401 nm utilizando un lector de microplacas VersaMax. El porcentaje de inhibición se calculó utilizando la siguiente ecuación:

donde Ei es la absorbancia de la reacción enzimática, Eb es la absorbancia del blanco de enzima, T es la absorbancia de la muestra de prueba y Tb es la absorbancia del blanco de prueba. también se determinaron los valores a partir de un gráfico lineal del porcentaje de inhibición de elastasa frente a la concentración (50), 75,100,125,150 ug/ml. Ensayo de inhibición de tirosinasa. La inhibición de la tirosinasa se determinó usando el método de formación de DOPA-cromo como se describió anteriormente con ligeras modificaciones13. Brevemente, en 96-placas de pocillos, se mezclaron alícuotas de 20 μL de DMSO (control) o compuestos de prueba en concentraciones variables con alícuotas de 40 μL de 30 U/mL de tirosinasa de hongo (Sigma Aldrich) y 100-μL de Tampón de fosfato 0.1-M (pH 6,8). Se preincubaron durante 10 min a temperatura ambiente. Las reacciones se iniciaron añadiendo alícuotas de 4 μl de 10 mML-DOPA a cada pocillo e incubando a 37 grados durante 20 min. Luego se determinó la actividad de tirosinasa midiendo la absorbancia a 475 nm. Se utilizó ácido kójico como control positivo. Los experimentos se realizaron por triplicado. El porcentaje de inhibición de tirosinasa se calculó mediante la siguiente ecuación:

donde E es la absorbancia de la reacción enzimática, Eb es la absorbancia del blanco de enzima, T es la absorbancia de la muestra de prueba y Tb es la absorbancia del blanco de prueba. también se determinaron los valores a partir de un gráfico lineal del porcentaje de inhibición de elastasa frente a la concentración (250, 125, 62, 5, 31, 25, 15, 6 ug/ml).

acoplamiento molecular. En esta investigación, se predijo la actividad farmacológica in silico con acoplamiento molecular utilizando un médico. El acoplamiento molecular dirigido se realizó utilizando un ligando cocristalizado como centro del sitio activo. La estructura 2Y9X se utilizó para el acoplamiento molecular de tirosinasa con tropolona, ​​un inhibidor de la tirosinasa de hongos, como su cocristal. El centro del sitio de acoplamiento molecular se define en-10.032;-28.769 y-43.467 como dimensiones X, Y y Z respectivamente. La cadena A se separó para su uso y el átomo de holmio se eliminó de la estructura usando UCSF Chimera.

En esta investigación también se utilizó la estructura de 3HGP, una elastasa porcina. FR130180, ya que el cocristal se utilizó como centro del sitio de acoplamiento molecular. Las coordenadas fueron 12.453, 9.237 y 1.199 para las dimensiones X, Y, Z, respectivamente. La afinidad de unión se analizó a partir de los diez mejores confórmeros de cada cálculo de acoplamiento molecular.

Este artículo está extraído de Scientifc Reports|(2021) 11:20452|https://doi.org/10.1038/s41598-021-99970-x