Habiendo establecido el hecho de que el efecto senolítico de la uabaína depende del tipo de célula

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La alteración de la homeostasis de K*/Nat causada por la ouabaína conduce a diferentes reacciones fisiológicas en el control y la senescencia A549 y END-MSC

Habiendo establecido el hecho de que el efecto senolítico de la uabaína depende del tipo de célula, intentamos dilucidar qué puede ser la base de las diferencias reveladas en las respuestas de hMSC y A549. Con este fin, analizamos la senescencia inducida por estrés oxidativo de END-MSC y etopósido. -senescencia inducida de A549 más precisamente.beneficios del cinomorioEl principal mecanismo molecular de acción de varios glucósidos cardíacos es la inhibición de Nat/K más -ATPasa [44]. La Nat/K más -ATPasa es una enzima de la membrana plasmática que bombea sodio fuera de la célula mientras bombea potasio al interior de la célula contra gradientes de concentración. y participando así en el mantenimiento de la homeostasis de K plus y Na plus. Por lo tanto, preguntamos si podría haber diferencias en la homeostasis iónica basal e inducida por ouabaína entre las células de control y las senescentes de dos tipos.

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La perturbación en la homeostasis de K plus y Na plus causada por la uabaína debería conducir en última instancia a la disipación del potencial de la membrana plasmática. Por lo tanto, además, utilizamos la sonda fluorescente específica DiBAC4(3) para medir el potencial transmembrana de las células no excitables. El aumento de la fluorescencia de este colorante refleja la despolarización de la membrana.jacinto del desiertoEn cada tipo de célula probada, la ouabaína indujo una despolarización predecible de la membrana, lo que confirmó el desequilibrio iónico (Fig. 10a). En particular, observamos niveles comparables de despolarización de la membrana en el control y las END-MSC senescentes, mientras que el A549 senescente se caracterizó por una membrana significativamente más despolarizada en comparación con las células A549 de control.

Otras consecuencias importantes de la desregulación iónica son los cambios en el potencial de membrana mitocondrial (PM).

Por lo tanto, utilizando la sonda fluorescente JC-1, evaluamos MMP en células de control y senescentes tras el tratamiento con ouabaína. Debe destacarse específicamente que las células senescentes se caracterizan comúnmente por una disminución de MMP que refleja el mal funcionamiento de las mitocondrias, alteraciones en el metabolismo energético y un aumento de los niveles de especies reactivas de oxígeno intracelular [45]. Como era de esperar, la MMP en las células END-MSC y A549 senescentes fue más baja que en las de control.

aunque esta disminución no afectó a la viabilidad de las células senescentes (Figs. Id, 6a, 10b).método de extracción de flavonoides pdfSimilar a los resultados anteriores, la ouabaína indujo una despolarización pronunciada de MMP en A549 senescentes en comparación con sus contrapartes en proliferación, mientras que el efecto sobre MMP de control y END-MSC senescentes fue mínimo (Fig. 10b). Resumiendo los resultados descritos en esta parte, podemos concluir que el bloqueo de Na más /K más -ATPasa por ouabain conduce a la despolarización dramática de la membrana plasmática y la caída de MMP en el caso de A549 senescente, al contrario de END-MSCS senescente.

Las alteraciones en los mecanismos de K plus import median la resistencia a la ouabaína de las END-MSC senescentes

Para aclarar los mecanismos que median los cambios inducidos por la ouabaína en la polarización de la membrana y MMP entre A549 senescentes y END-MSC, además, empleamos un enfoque bioinformático avanzado. El objetivo del análisis era revelar posibles características transcriptómicas que median la resistencia o la sensibilidad a la uabaína dependiente del tipo celular de las células senescentes. En otras palabras, hicimos la pregunta: ¿en qué se diferencia la senescencia de las END-MSC (células resistentes a la ouabaína) de la senescencia de A549 (células sensibles a la ouabaína)? Para responder a esta pregunta, utilizamos tres conjuntos de datos independientes de secuenciación de ARN (RNA-Seq). El primero fue el análisis de RNA-Seq.

Fig. 6 Validación del modelo de senescencia A549 inducida por etopósido. Las células senescentes A549 muestran una pérdida de proliferación, b adquieren un tamaño celular elevado, c nivel de autofluorescencia y d actividad SA-b-Gal en comparación con las de control. e Niveles de fosforilación de p53 y Rb y niveles de expresión de proteínas p21 y HMGBI en A549 control y senescente. Los valores presentados son medias ± DE. Para las comparaciones de grupos múltiples en un ANOVA de una vía se aplicaron, n=3, ns no significativo,***p<0.001. for="" pair="" comparisons="" at="" b,c,="" and="" d="" welch's="" test="" was="" used,n="3" for="" b="" and="" c,n="50" for=""><0.001.>flavonoidesLas barras de escala para las imágenes son de 500 μm. GAPDH se utilizó como control de carga de control y END-MSC senescentes realizados por nosotros. El segundo fue el conjunto de datos para control y senescencia A549 descargado de GEO [43]. Cabe destacar que las condiciones inductoras de senescencia coincidieron con las aplicadas en el presente estudio y en los estudios piloto de senólisis inducida por glucósidos cardíacos. Y el tercer conjunto de datos fue para control y senescencia IMR-90 obtenido directamente del estudio sobre glucósidos cardíacos como compuestos senolíticos [25]. Es importante destacar que se demostró que IMR-90 es propenso al análisis inducido por ouabaína. Cabe señalar que comparar solo dos conjuntos de datos relevantes para END-MSC y A549 conduciría en última instancia a resultados incorrectos, ya que en dicho análisis la diferencia buscada entre el proceso de senescencia en END-MSC y A549 sería indistinguible de las variaciones mediadas por diversos efectos técnicos de lotes (es decir, tipo de máquina de secuenciación, las condiciones de funcionamiento de la muestra). Para minimizar cualquier efecto por lotes, comparamos un conjunto de datos para células resistentes a la uabaína (END-MSC) y dos para células sensibles a la uabaína (A549, IMR-90). Para validar la relevancia del análisis comparativo adicional, realizamos un análisis de componentes principales para el subconjunto de genes relacionados con el término GO "senescencia celular" (GO 0090398) basado en el conjunto de datos resumidos que contiene muestras de los tres experimentos descritos. De hecho, para cada tipo de célula, las muestras se agruparon en dos grupos separados: el control y las senescentes (Fig. 10d).

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Para realizar un análisis de genes expresados ​​diferencialmente (DEG) durante la senescencia de células sensibles y resistentes a la ouabaína, generamos el modelo estadístico que resumía dos predictores y su interacción. La presentación esquemática del análisis se muestra en la Fig. 10c. En resumen, el primer predictor del modelo dividió todas las muestras por subgrupos de control y senescencia, el segundo, por resistencia a la uabaína o sensibilidad a la uabaína, y el último componente del modelo reflejó la interacción de ambos predictores. El resultado de las pruebas de expresión diferencial para la última variable se presenta en la Tabla complementaria 1.

Luego realizamos un análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) en términos de ontología de genes (GO) para procesos biológicos (BP) (Tabla complementaria 2). En particular, entre los procesos significativamente enriquecidos, encontramos que la 'importación de iones de potasio' y la 'regulación positiva del transporte transmembrana de cationes se regulan al alza durante la senescencia de las END-MSC resistentes a la uabaína en comparación con la senescencia de las células sensibles a la uabaína (Fig. 10e ). Las listas de genes de enriquecimiento central relacionadas con estos procesos incluían KCNJ2, KCNJ14, KCNJ8, SLC12A7, SLC12A8, WNK4, que estaban significativamente regulados al alza en END-MSC senescentes (Fig. 10f). Las proteínas codificadas por los genes KCNJ son canales de potasio de tipo rectificador interno, que tienen una mayor tendencia a permitir que el potasio fluya hacia el interior de una célula en lugar de hacia el exterior.usos de hesperidinaSLC12 una familia de transportadores de cloruro catiónico. El gen WNK4 codifica para la serina/treonina quinasa que actúa como activador de los cotransportadores de cloruro acoplados al sodio e inhibidor de los cotransportadores de cloruro acoplados al potasio. Juntos, estos hallazgos permitieron sugerir que las END-MSC senescentes pueden restaurar los niveles intracelulares de K plus agotados de manera más efectiva que las células senescentes A549 y, por lo tanto, pueden manejar el desequilibrio iónico inducido por la uabaína.

Los END-MSC senescentes se muestran elevados

resistencia a la apoptosis en comparación con los de control, mientras que el A549 senescente no

El papel del K+ intracelular en la regulación de la muerte celular está bien establecido [46]. Las diferencias reveladas entre las END-MSC senescentes y las células A549 en la capacidad de mantener el K intracelular más la homeostasis nos llevaron a comparar la resistencia general al estrés adquirida durante la senescencia de ambos tipos de células. Se sabe que las tensiones exógenas van acompañadas de alteraciones en la homeostasis iónica, lo que conduce a un rápido intercambio de varios iones, incluido el K+, entre la célula y su entorno [46]. Los resultados de las influencias estresantes dependen en gran medida de la capacidad de las células para restablecer el equilibrio iónico intracelular apropiado. Como se muestra en la Fig. 10e, f, la senescencia de END-MSC estuvo acompañada por la regulación positiva de K más la importación, lo que sugiere que durante

Fig. 10 Las END-MSC senescentes resistentes a la ouabaína son capaces de restablecer la alteración de la homeostasis de K más/Nat causada por la ouabaína a través de la importación efectiva de K más, mientras que las células senescentes sensibles a la ouabaína carecen de esta capacidad. a Determinación del potencial de membrana de células A549 y END-MSC de control y senescentes antes y 24 h después del tratamiento con uabaína, utilizando la sonda fluorescente DiBAC4(3). b Evaluación del potencial de membrana mitocondrial de células END-MSC y A549 de control y senescentes antes y 24 h después del tratamiento con uabaína, utilizando la sonda fluorescente JC-1. c Diseño del análisis bioinformático comparativo de tres conjuntos de datos de RNA-Seq independientes. . e Resultados de GSEA para los genes expresados ​​diferencialmente entre las células resistentes al análisis mediado por ouabaína (END-MSC) y las sensibles al análisis mediado por ouabaína (A549 e IMR-90) para 'Regulación positiva del transporte transmembrana de cationes' y 'Procesos biológicos de importación de iones de potasio. f Mapa de calor que refleja los genes de enriquecimiento del núcleo para los procesos biológicos de 'Regulación positiva del transporte transmembrana de cationes' e 'Importación de iones de potasio'. Los valores son media ± DE. La significación estadística se evaluó mediante la prueba t de Student: ns no significativa,*p<><><>

desarrollo de la senescencia END-MSCs mejoran su capacidad para restaurar los niveles de K plus. Curiosamente, no pudimos revelar una tendencia similar para la senescencia de A549, por lo que A549 no pareció adquirir ninguna característica específica relacionada con la importación de K* durante la progresión de la senescencia. De acuerdo con los datos literarios, la disminución de K* intracelular inducida por el estrés y la incapacidad para restaurar su nivel favorecen la activación de caspasas y nucleasas y, por lo tanto, se proponen como un factor pro-apoptótico [46].

De acuerdo con esta sugerencia, mediante el análisis bioinformático de los conjuntos de datos de RNA-seq anteriores, revelamos una regulación negativa significativa de los procesos relacionados con la apoptosis durante la senescencia de END-MSC en comparación con A549 e IMR-90 (Fig. lla) . Además, la senescencia de A549 e IMR-90 se caracteriza por una regulación positiva significativa de genes proapoptóticos, incluidos BAD, BAX, BOK, BAK-1 y NOXA (Fig. 11b). Estos datos indican que las END-MSC adquieren un fenotipo resistente a la apoptosis durante la senescencia, mientras que las IMR senescentes-90 y A549 se volvieron propensas a la apoptosis (Fig. 11b). Para fortalecer esta observación, analizamos adicionalmente el conjunto de datos de micromatrices para el control y las AD-MSC senescentes replicativas que también conservaron la resistencia a la ouabaína durante la senescencia como se indicó anteriormente (Fig. 4g). Al analizar los niveles de expresión de los genes relacionados con la apoptosis, observamos un fenotipo distinto resistente a la apoptosis de AD-MSC senescentes similar al de las END-MSC senescentes (Fig. S8a, b suplementaria).

Para verificar los resultados del análisis transcriptómico, estimamos los niveles de expresión de los genes relacionados con la apoptosis y la importación de K plus en ambos tipos de células senescentes: END-MSC y A549 mediante RT-PCR (Figura complementaria S9). Además, analizamos la expresión de la misma lista de genes utilizando otros modelos celulares resistentes y sensibles a la ouabaína, DP-MSC senescentes tratadas con doxorrubicina y SK-Help senescentes tratadas con etopósido, respectivamente (Figura complementaria S9). Como se muestra en la figura complementaria S9, ambos tipos de células resistentes a la ouabaína: END-MSC senescentes y DP-MSC mostraron patrones de expresión génica similares, específicamente KCNJ2, SLC12A y WNK4 que participan en la restauración de K plus estaban regulados al alza, BAX proapoptótico estaba regulado a la baja, mientras que El MCL-I antiapoptótico estaba regulado al alza. Además, el patrón de expresión de los mismos genes difería de los observados para A549 y SK-Hep1 sensibles a la uabaína. Estos resultados confirman nuestros datos transcriptómicos y refuerzan la conclusión sobre los variados perfiles de apoptosis adquiridos durante la senescencia de diferentes tipos de células.

A continuación, probamos si las distinciones observadas en el fondo de apoptosis durante la senescencia de END-MSC y A549 pueden tener un impacto en la resistencia general al estrés de las células senescentes. Para ello, evaluamos la viabilidad celular ante el estrés oxidativo y la estaurosporina, típicamente aplicada para inducir la apoptosis. De hecho, los END-MSC senescentes resultaron ser significativamente más resistentes a ambos estreses en comparación con sus contrapartes de control (Fig. 1lc). Por el contrario, las células A549 demostraron una situación inversa, ya que las células senescentes mostraron una tendencia a ser más sensibles a la muerte celular inducida por estrés (Fig. 11d). Esta observación cambia el paradigma existente de que la resistencia a la muerte mejorada es una característica común de cualquier tipo de células senescentes, lo que demuestra su obvia especificidad celular.

Sobre la base de los datos anteriores, asumimos que la reducción de la "defensa" de la apoptosis de las END-MSC senescentes debería crear condiciones favorables para un análisis posterior. En este sentido, nos enfocamos en un conocido miembro antiapoptótico de las proteínas de la familia BCL-2—MCL-1, ya que su expresión estaba aumentada en END-MSC senescentes resistentes a la apoptosis (Fig. 1lb y Fig. Suplementaria). .S9a). Con este fin, pretratamos las END-MSC de control y senescentes con A-1210477, el inhibidor específico de MCL-1, y luego aplicamos glucósidos cardíacos para inducir el análisis. Es de destacar que A-1210477 en sí mismo no tuvo efecto sobre la capacidad de proliferación de las células de control y sobre la viabilidad de las senescentes como se indica en las curvas de crecimiento (Fig. 1le). La aplicación posterior de glucósidos cardíacos condujo a la disminución del número de células viables, sin embargo, el efecto fue más pronunciado en las ESC senescentes (Fig. 11f). Por lo tanto, la inhibición de MCL-1 con A-1210477 predispone a las ESC senescentes a la muerte inducida por ouabaína, lo que indica el análisis. La última evidencia de la resistencia a la apoptosis adquirida durante la senescencia de END-MSC es una barrera intrínseca para el análisis efectivo desencadenado por los glucósidos cardíacos.

Discusión

Dentro del presente estudio, probamos los efectos senolíticos de los glucósidos cardíacos, a saber, la ouabaína y la bufalina, en las hMSC. Recientemente se identificó que ambos compuestos tienen un efecto citotóxico selectivo en células senescentes (modelos de senescencia inducidos por oncogén/terapia) de diferentes orígenes, incluidas células primarias IMR-90,HUVEC, ARPE-19,T/ C-28 y células cancerosas SK-Help,A549,SK-Mel-5,MCF7,HCT116, HaCat,H1299,U373-MG,H1755[25,26].Inesperadamente, no pudieron revelar ningún efecto citotóxico preferencial ni de la ouabaína ni de la bufalina en las END-MSC senescentes en comparación con las de control. Es importante destacar que la ausencia de análisis se verificó utilizando hMSC obtenidas de tejido adiposo, pulpa dental y gelatina de Warton, y varios modelos de senescencia. Esto último nos llevó a sugerir que la resistencia al análisis inducido por glucósidos cardíacos podría ser la característica común de las hMSC. Al mismo tiempo, pudimos inducir la apoptosis preferentemente en A549 senescente y SK-Help, reproduciendo así el efecto senolítico de los glucósidos cardíacos descritos en los artículos relevantes [25,26]. Con células resistentes y sensibles al análisis inducido por uabaína (resistentes a uabaína/sensibles a uabaína) disponibles, intentamos dilucidar las causas fundamentales que subyacen a esta diferencia. El mecanismo molecular común de acción de los glucósidos cardíacos se une a la Nat/K más -ATPasa y bloquea su actividad. Al hidrolizar ATP, esta enzima asegura el bombeo de Na+ fuera de la célula e importa K+ a las células y, por lo tanto, mantiene el gradiente electroquímico fisiológico, la homeostasis iónica, el pH celular y el volumen celular que son esenciales para la supervivencia y el funcionamiento celular [47]. Por lo tanto, especulamos que la capacidad senolítica de la uabaína podría depender de la gravedad del desequilibrio K más/Nat en las células tratadas. De acuerdo con esta sugerencia, revelamos que la ouabaína indujo una despolarización más pronunciada de la membrana plasmática y una caída de MMP en A549 senescentes sensibles a la ouabaína.

En términos generales, se demostró que el impacto de la inhibición de Nat/K más -ATPasa en la supervivencia celular es específico del tipo de célula. Por ejemplo, se demostró que la ouabaína potencia la apoptosis en linfocitos, células Jurkat y células epiteliales caninas, mientras que no logró inducir la muerte en células epiteliales de aorta de rata, células granulares cerebrales de rata y linfocitos LLC-PK1 tubulares renales porcinos a pesar de una modulación similar. de la relación catiónica [48-54]. Uno de los mecanismos propuestos de acción proapoptótica de la uabaína es el agotamiento de la apoptosis intracelular que favorece la contracción apoptótica, la activación de caspasas y el inicio de la programación apoptótica [46, 47]. Teniendo en cuenta la pérdida de K más comparable pero el efecto opuesto sobre la inducción de muerte obtenido para los modelos resistentes y sensibles a la uabaína, sugerimos las diferencias en los sistemas compensatorios de cationes. La caída en el nivel de K plus intracelular debería conducir esencialmente a la activación de la importación de K plus desde el espacio extracelular para compensar la falta de este catión. Por lo tanto, la eficacia de la restauración de K plus podría ser la base de la predisposición a la apoptosis tras el tratamiento con uabaína. Para probar esta sugerencia, aplicamos un análisis bioinformático complejo que compara las alteraciones en las firmas transcriptómicas durante la senescencia de las células resistentes a la uabaína (END-MSC) y las células sensibles a la uabaína (A549 e IMR-90). Observamos una fuerte regulación positiva de los procesos relacionados con la importación de iones de potasio durante la senescencia de END-MSC, mientras que durante la senescencia de A549 e IMR-90 sensibles a oua-bain, estos procesos permanecieron sin cambios o incluso disminuyeron. En base a eso, podemos especular que los END-MSC senescentes pueden hacer frente de manera efectiva al agotamiento de K plus inducido por ouabain a través de sistemas de importación de cationes activos, lo que previene la inducción de apoptosis. Por el contrario, el A549 senescentes sensibles al baño y el IMR-90 parecen ser menos capaces de superar la pérdida de K+ y, por lo tanto, son propensos a la apoptosis. células A549 senescentes, que demuestran un desequilibrio iónico pronunciado típico de las células moribundas.

En lugar de ser la característica única de la apoptosis inducida por uabaína, una caída del contenido de K+ intracelular es probablemente la característica común de la muerte apoptótica provocada por diversos tipos de estrés, por ejemplo, el tratamiento con estaurosporina y el estrés oxidativo [46]. En consecuencia, la disminución de la capacidad del A549 senescente para restaurar el K plus citoplasmático debería conducir en última instancia a una disminución en la resistencia general al estrés. Sin embargo, esta noción contradice la definición moderna de senescencia celular, que establece que las células senescentes son altamente resistentes a la apoptosis [16]. Debe destacarse específicamente que la resistencia mejorada a la apoptosis formó la base para el desarrollo analítico [16, 17].

La primera mención del aumento de la resistencia al estrés de las células senescentes se remonta a 1995, cuando se descubrió que los fibroblastos senescentes replicativos eran más resistentes a la retirada del suero en comparación con los de control [55]. Este estudio inicial fue seguido por un número limitado de investigaciones que indicaron que las células senescentes son más resistentes a la luz ultravioleta, la estaurosporina, la tapsigargina y otros estreses que sus contrapartes en proliferación [56, 57]. Sin embargo, estamos lejos de ser los primeros en plantear la cuestión de la mayor resistencia a la apoptosis como característica general de las células senescentes. Así, en la revisión publicada en 2003, se informó que "... la resistencia a la apoptosis no es una característica general de las células senescentes, que también pueden ser propensas a la apoptosis según el tipo de célula y los estímulos apoptóticos..."[58]. De hecho, varios datos demostraron una mayor sensibilidad de las células senescentes a la apoptosis inducida por estrés que las células de control [59-61]. Por ejemplo, las HUVEC senescentes eran más propensas a la apoptosis inducida por LDL oxidado o TNFa en comparación con las células de control [61]. A pesar de la evidente controversia, la última duda apareció en 2015 y sonó de la siguiente manera: "Parece dudoso que la resistencia a la apoptosis global sea una característica general de las células senescentes"[62]. En el mismo año, se publicó el primer estudio que descubrió el análisis [16 ]. Dentro de este estudio, los autores destacaron la mayor expresión de redes de genes pro-supervivencia en células senescentes que contribuyeron a su mayor resistencia a la apoptosis. Por lo tanto, inicialmente, los senolíticos representaban los fármacos para atacar proteínas que protegían a las células senescentes de la apoptosis. El descubrimiento de la analítica junto con los impresionantes resultados de la eliminación de células senescentes utilizando ratones transgénicos INK-ATTAC desencadenó una serie de estudios en busca de nuevos compuestos con actividad hemolítica [16-26,63]. En los últimos dos años, se publicaron muchas reseñas sobre análisis [13-15,64-66]. Sin embargo, desde 2015, la mayor resistencia a la apoptosis de las células senescentes no fue un tema de debate, aunque, de hecho, no se probó en estos estudios.

Curiosamente, al comparar las firmas transcriptómicas de las células resistentes a la ouabaína (END-MSC) y las células sensibles a la ouabaína (A549 e IMR-90), descubrimos que solo la senescencia de las END-MSC estuvo acompañada por la adquisición de capacidades notables. perfil antiapoptótico. Por el contrario, la senescencia de A549 e IMR-90 se caracteriza por una importante regulación positiva de los genes proapoptóticos, incluidos BAD, BAX, BOK, BAK-1, NOXA, etc. Es importante destacar que estos resultados se ampliaron utilizando otras DP-MSC de células resistentes a la uabatina. Por un lado, estos resultados proporcionan una explicación molecular adicional para la ausencia de análisis inducido por ouabaína en hMSC y, por otro lado, demuestran claramente que A459 e IMR-90 se predisponen a la apoptosis durante la senescencia. Cabe destacar que nuestros datos sobre alteraciones transcriptómicas en genes relacionados con la apoptosis en IMR senescentes-90 coincidieron con los resultados presentados, pero no discutidos, en el artículo publicado por Guerrero et al., como conjuntos de datos para control y IMR senescentes{ {19}} células se originaron a partir de este estudio [25]. El análisis preciso del mapa de calor proporcionado en este estudio reveló una regulación positiva de BAX, BAD, BAD, BAKI y NOXA en IMR senescente-90 en comparación con las células de control. Además, Baar et al. también reveló una regulación positiva "inesperada" de genes proapoptóticos y una regulación negativa de genes antiapoptóticos en IMR senescentes-90, mencionando que IMR senescente-90 debería estar preparado para sufrir apoptosis [21].

Con el fin de fortalecer nuestra observación, comparamos la resistencia del control y las END-MSC senescentes y A459 con los estímulos inductores de apoptosis más comunes: el estrés oxidativo y la estaurosporina. Según los resultados de nuestro análisis bioinformático, las END-MSC senescentes resultaron ser mucho más resistentes al estrés que las células de control. Al mismo tiempo, A549 senescente demostró la reacción opuesta siendo ligeramente más susceptible que las células de control a ambos tipos de estímulos estresantes. Por lo tanto, la acción senolítica de los glucósidos cardíacos, al menos para A549, podría estar mediada por la predisposición de las células senescentes de este origen a la apoptosis en comparación con sus contrapartes de control, mientras que la ausencia de senolisis inducida por uabaína en hMSC podría explicarse por el aumento en resistencia apoptótica global durante la senescencia de estas células. Además, el debilitamiento de la "defensa antiapoptótica" por la inhibición de MCL-1 predispone a las END-MSC a la senólisis inducida por los glucósidos cardíacos. Aunque pudimos lograr la senólisis deseada de END-MSC al inhibir MCL-1, la estrategia para modular la expresión de genes antiapoptóticos concretos para predisponer a senolisis a hMSC senescentes no parece muy prometedora, ya que la expresión la dinámica de los genes antiapoptóticos o proapoptóticos concretos puede diferir entre células de diversos orígenes. Creemos que la adquisición del llamado perfil "antiapoptótico" durante la senescencia celular, más que las alteraciones en los genes concretos antiapoptóticos o proapoptóticos, es responsable de la resistencia a la uabaína, en este sentido, la posibilidad de cambiar todo el perfil podría parecer más razonable.

Nuestras conclusiones que destacan la resistencia a la apoptosis adquirida durante la senescencia de las hMSC como una barrera intrínseca para un análisis efectivo podrían extenderse mucho más allá de los glucósidos cardíacos. En particular, se encontró que las hMSC senescentes eran resistentes a otros compuestos senolíticos. De hecho, al analizar la evidencia existente, encontramos que varios compuestos con la actividad senolítica indicada, incluidos navitoclax, ribósido de nicotinamida, danazol geldanamicina, ganetespib, fisetina, inhibidores de BCL-XL, quercetina, etomoxir, antimicina A, FOXO4-DRI ,17-DMAG resultó ineficaz para la eliminación dirigida de preadipocitos humanos senescentes (células precursoras similares a fibroblastos derivadas del tejido adiposo humano) y hMSC de la médula ósea [17-19, 36, 40]. Los datos relacionados con la ausencia de análisis en hMSC contradicen un poco los resultados inspiradores obtenidos utilizando modelos de ratones in vivo, lo que demuestra resultados positivos con la aplicación sistémica de análisis [37, 38]. Por ejemplo, se demostró que la eliminación de células madre de glándulas salivales senescentes usando ABT263 puede prevenir la xerostomía inducida por radioterapia [38]. Además, la eliminación de las MSC senescentes de la médula ósea mediante la quercetina mejoró la formación de la médula ósea [37]. Es importante destacar que se demostró que las MSC de ratones y ratas senescentes, a diferencia de las hMSC, responden a los análisis. Por ejemplo, la quercetina, la quercetina-estaño+dasatinib y ABT263 eliminaron significativamente las MSC de ratones senescentes [16]. Además, se ha demostrado que 17-DMAG reduce en gran medida las bmMSC senescentes en un modelo de ratón progeroide [19]. Por lo tanto, se especula que las mejoras en el funcionamiento de varios órganos y sistemas descritos en estos estudios son consecuencia de la eliminación dirigida de células madre de ratón senescentes. Sin embargo, estos análisis aún no han mostrado ningún rejuvenecimiento funcional de las hMSC. Una distinción tan obvia entre la capacidad de respuesta de ratones y MSC humanas hacia el análisis sugiere que las mejoras de las terapias senolíticas pueden no conservarse en todas las especies. Los resultados obtenidos para el compuesto senolítico UBX0101 pueden considerarse una buena ilustración que confirma la última afirmación. Se ha demostrado que este agente elimina las células senescentes en un modelo de osteoartritis en ratones, lo que reduce significativamente el dolor y promueve la reparación del cartílago dañado [20]. Desafortunadamente, UBX0101 no logró atenuar la progresión de la enfermedad y el dolor en pacientes con osteoartritis dolorosa de moderada a grave durante los ensayos clínicos de fase II [67-69]. Se plantean preocupaciones similares sobre la combinación senolítica dasatinib+querce-estaño[68].

En resumen, dos conclusiones importantes se desprenden de los datos obtenidos. El primero demostró que los glucósidos cardíacos no pueden eliminar las hMSC senescentes. La ausencia de análisis podría estar mediada por la importación celular efectiva de K plus y el aumento de la resistencia a la apoptosis en las hMSC senescentes. Este último es más fundamental y revela que la resistencia a la apoptosis no es una característica general de las células senescentes, ya que durante la senescencia algunas células adquieren un fenotipo 'resistente a la apoptosis', mientras que otras no. Es importante destacar que solo las células A549 senescentes propensas a la apoptosis podrían ser eliminadas de manera efectiva por los glucósidos cardíacos. En base a eso, podemos especular que la efectividad de otros enfoques senolíticos podría depender de si las células senescentes son realmente resistentes a la apoptosis en comparación con sus contrapartes en proliferación. Finalmente, aunque el 'análisis' es un tema candente y se publican muchos datos inspiradores, las conclusiones sobre la efectividad del análisis deben tomarse con precaución ya que la heterogeneidad de la senescencia celular sigue siendo un 'rompecabezas'.

Este artículo está extraído de Cellular and Molecular Life Sciences (2021) 78:7757–7776 https://doi.org/10.1007/s00018-021-03980-x