El tubulosido B de Cistanche Salsa rescata las células neuronales PC12 de la apoptosis inducida por iones de 1-metil-4-fenilpiridinio y el estrés oxidativo

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Guoqing Zheng, Xiaoping Pu, Li Lei, Pengfei Tu, Changling Li

Resumen:

El neuroprotectorefectos de tubuloside B de cistanche, uno de los feniletanoides aislados de los chinosHierbas medicinales Cistanche salsa, sobre la apoptosis inducida por 1-metil-4-fenilpiridinio (MPP plus) y el estrés oxidativo en células neuronales PC12. Las células PC12 tratadas con MPP ＋ sufrieron muerte apoptótica según lo determinado por ensayo MTF, citometría de flujo y electroforesis en gel de agarosa de ADN; La acumulación intracelular de especies reactivas de oxígeno (ROS) se midió mediante tinción DCFH-DA con microscopía confocal de barrido láser (LSCM). El tratamiento simultáneo con tuhulosida B atenuó notablemente la citotoxicidad inducida por MPP＋, la fragmentación del ADN y la acumulación intracelular de ROS. Estos resultados indican claramente que el tubulosido B previene la apoptosis inducida por MPP y el estrés oxidativo. El tubulósido B se puede aplicar comocontra la enfermedad de Parkinsonagentes

Introducción

Desde el punto de vista patológico, la enfermedad de Parkinson (EP) esporádica se caracteriza típicamente por una pérdida de neuronas catecolaminérgicas, particularmente neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra pars compacta (SNc), y la presencia de intraneuronas características. inclusiones llamadas cuerpos de Lewy en las regiones cerebrales afectadas. A pesar de que una variedad de factores han sido implicados en la patogenia de la EP, los mecanismos involucrados en el inicio y la progresión de la EP siguen siendo inciertos. Aunque la causa de la EP permanece resuelta, varias líneas de evidencia sugieren fuertemente la participación del estrés oxidativo, lo que finalmente conduce a a muerte neuronal o apoptosis por la generación excesiva de radicales libres [1], [2], [3]. El hecho de que el sistema dopaminérgico nigral pueda producir altos niveles de radicales libres y tenga niveles relativamente bajos del sistema de defensa antioxidante respalda aún más esta hipótesis. Los estudios in vivo e in vitro mostraron neurotoxicidad mediada por estrés oxidativo de MPP＋, un metabolito activo de l-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP) en las neuronas dopaminérgicas [4 ], [5]. La participación de los radicales libres producidos en exceso por el estrés oxidativo como la causa inmediata de los trastornos neurodegenerativos como la EP sugiere un papel fundamental para los antioxidantes. El tubulosido B (Fig. l) fue uno de los compuestos feniletanoides aislados de los tallos deSalsa Cistanche. Estudios previos habían encontrado que muchos feniletanoides, incluido el tubulosido B, mostraban una fuerte actividad de eliminación de radicales libres [6], [7].

Teniendo en cuenta estos hallazgos, investigamos en el presente estudio el efecto de la tubu]nside B sobre la neurotoxicidad inducida por MPP plus in vitro, utilizando la línea celular de feocromocitoma del nervio simpático PC12 que se ha utilizado con éxito a lo largo de los años para estudiar la función neuronal [8], [9].

contra la enfermedad de Parkinson:cistanche

Materiales y métodos

Materiales

Tubulósido B deSalsa Cistanchefue proporcionado amablemente por el Dr. Li Lei (Departamento de Productos Naturales, Facultad de Ciencias Farmacéuticas, Universidad de Pekín, Beijing, China). La pureza del compuesto fue superior al 98 por ciento por análisis HPLC. El medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), el suero de caballo y el suero de ternera fetal se adquirieron de GIBCO BRL, 1-metil~-fenilpiridinio (MPP plus), poli-L-lisina, 3-(4, 5 -dimetiltiazol-2 -il)-2,5- bromuro de difeniltetrazolio (MTT), yoduro de propidio (PI), RNasa A, proteinasa K y diacetato de 2;7'-diclorofluoresceína (DCFH-DA) se adquirieron de Sigma.

Cultivo de células

Las células PCI2 se mantuvieron en DMEM suplementado con suero de caballo al 10 por ciento, suero de ternero fetal al 5 por ciento, 100 U/ml de penicilina y 100 ug/ml de estreptomicina. Las células se cultivaron en una incubadora humidificada aireada con 95 por ciento de aire y 5 por ciento de CO2 a 37 grados. Todos los experimentos se llevaron a cabo 24-48 h después de sembrar las células. Las células se recogieron de forma rutinaria mediante tripsinización al 0,25 por ciento cuando las células se acercaron a la etapa subconfluente y se sembraron en matraces de cultivo de 25 cm divididos en 1:8.

Análisis de viabilidad celular

La viabilidad celular se determinó utilizando un ensayo MTT modificado como se describió anteriormente [10]. En resumen, las células PC12 se sembraron en 96-placas de pocillos a una densidad de 1 × 104 celdas por pocillo. Los cultivos se cultivaron durante 48 h y luego se cambió el medio a uno que contenía varias concentraciones de tubulnside B o MPP＋. Después de la incubación durante un máximo de 48 h y 72 h, se añadió solución de MTr (5 mg/ml en DMEM) a las 96-placas de pocillos y se permitió que las células se incubaran durante 4 h a 37 grados. Después de retirar el medio, la célula y los cristales de colorante se solubilizaron añadiendo 200 μl de DMSO y se midió la absorción a 570 nm (540 nm como referencia) con un lector de microplacas modelo 550 (Bio-Rad). La viabilidad celular también se analizó utilizando el método de exclusión con azul de tripano. Las células se recogieron, se sedimentaron suavemente y se tiñeron con una solución al 0,6 por ciento de azul tripán durante 3 lluvias. Posteriormente, se evaluó el porcentaje de células no coloreadas en diez campos de microscopio seleccionados al azar. Como fármaco positivo se utilizaron 100 ng／ml de factor de crecimiento epidérmico (EGF).

Detección de apoptosis por citometría de flujo

Las células apoptóticas se detectaron mediante citometría de flujo utilizando yoduro de propidio (PI) [11]. Brevemente, se recogieron por centrifugación aproximadamente 1 × 106 células incubadas con sustancias de prueba y se lavaron una vez con PBS. Las células se fijaron con etanol al 70 por ciento durante 24 horas a - 20 grados y se lavaron una vez con PBS. A continuación, las células se resuspendieron en 300 μl de PBS que contenía 0,5 mg/ml de RNasa y 0,5 mg/ml de PI. Después de una incubación adicional durante 30 min en la oscuridad, se realizó una citometría de flujo con un FACScan (Becton Dickinson, Heidelberg, Alemania).

Aplicamos el protocolo de Moore [12] que aisló solo ADN fragmentado y los experimentos se normalizaron usando un número igual de cultivos de cada grupo de prueba. Brevemente, 3 × 106 neuronas de cada una de las muestras tratadas se lavaron en solución salina equilibrada de Hank (1000g durante 10 min), y los gránulos formados en el fondo del tubo se homogeneizaron. con 1 ml de tampón de lisis (Tris 10 mM a pH 7,4, EDTA 5 mM, Triton X al 1 por ciento-100) durante 20 min en hielo. Después de la centrifugación a 11,000 g durante 20 lluvias a 4 grados, se extrajeron los sobrenadantes que contenían ADN fragmentado y se digirieron con 20 mg/ml de RNasa A a 37 grados durante 1 hora y 0,1 mg/ml de proteinasa K a 56 grados. durante 1 h adicional. El ADN fragmentado se extrajo usando fenol y cloroformo y se centrifugó a 10,000g durante 1 lluvia a 4 C. La fase acuosa se transfirió a un tubo Eppendorf nuevo, se mezcló con 2 volúmenes de etanol helado y luego colocado a -20 grados durante al menos 1 h para precipitar el ADN. Después de la centrifugación a 15,000g durante 20 min a 4 grados, se eliminaron los sobrenadantes y los sedimentos de ADN se lavaron una vez con etanol al 80 % (15 000 g durante 15 min a 4 grados), se secaron al aire y se disolvieron en 20 μL de TE tampón a pH 7,6. A continuación, toda la muestra se sometió a electroforesis en un gel de agarosa al 1,5 % durante 1 hora a 85 V. El gel se examinó y fotografió mediante un sistema de documentación de gel de productos ultravioleta (GELDOC-2000, Bio-Rad, EE. UU.).

Medición de la formación de ROS intracelular

La formación de peróxidos intracelulares se detectó con un microscopio láser de barrido confocal utilizando un compuesto no fluorescente, diacetato de diclorofluoresceína de 2"7" (DCFH-DA) [13], que se esterifica dentro de las células mediante esterasas endógenas al ácido libre ionizado, 2 ;7"-diclorofluoresceína. La 2",7-diclorofluorescina es capaz de oxidarse a 2"7"-diclorofluoresceína fluorescente (DCF) mediante hidroantioxidantes. Las células se incubaron con DCFH-DA 10 μM durante 30 min a 37 grados. Los cultivos se lavaron dos veces con solución salina equilibrada de Hank y se tomaron imágenes en el mismo medio. La obtención de imágenes se realizó con un microscopio láser de barrido confocal, DCF se excitó a 488 nm y el filtro de emisión era un filtro de barrera de 510 nm. Para proporcionar una comparación válida, se usaron los mismos parámetros de adquisición para todas las observaciones. Se estableció la posición vertical óptima en el medio de las celdas y luego se escaneó rápidamente el campo. Debido a que la iluminación a la longitud de onda de excitación de 488 nm provocó un aumento de la fluorescencia debido a la oxidación de este tinte, cada campo se expuso a la luz durante exactamente el mismo tiempo. Los valores de referencia de las células no estimuladas se usaron como valores de control para comparar con las células tratadas con MPP en presencia o ausencia de tubuloside B. Después de escanear, la intensidad de fluorescencia relativa promedio en 15-20 cuerpos de células neuronales por campo de microscopio se cuantificó en cuatro cultivos separados por condición de tratamiento.

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análisis estadístico

Todos los valores obtenidos se expresaron como medias ± DE. La significación estadística de las diferencias entre los grupos se determinó mediante la prueba t de Student; Los valores de p calculados de menos de 0.05 se consideraron estadísticamente significativos.

Resultados

Como se muestra en la Fig. 2, MPP plus produjo una disminución dependiente de la dosis en la viabilidad de las células PCI2. Por el contrario, el EGF, un factor neurotrófico bien conocido, produjo una protección significativa de la viabilidad celular a 100 ng/ml. Los efectos citotóxicos inducidos por MPP+ también se atenuaron en presencia de tubulosido B (5, 10, 50 o 100 ug-ml-1 ), aunque con menor potencia que el fármaco de referencia (Fig.3)． El tubulosido B a estas concentraciones exhibió efectos citoprotectores de una manera dependiente de la dosis y el compuesto solo no causó ninguna citotoxicidad aparente (no se muestran los datos). La electroforesis en gel del extracto de ADN de las células PCI 2 tratadas con 200 µM MPP plus durante 48 h mostró un escalonamiento del ADN. un sello distintivo clásico de la apoptosis, tubuloside B, en dosis de 10 y 100 μ g·ml-1formación reducida de la escalera de ADN (Fig. 4). La Fig. 5 muestra histogramas típicos del análisis de citometría de flujo de la muerte celular apoptótica inducida por MPP+ en células PC12. en presencia o ausencia de tubuloside B. La cuantificación del perfil del ciclo celular con PI reveló el número de células con características subdiploides (región M1) indicativas de fragmentación del ADN apoptótico. En las células no tratadas, la fracción subdiploide apoptótica fue mínima hasta el 5．94% del total de 10000 células (Fig. 5 A)． Después de 48 h de exposición a MPP＋, el porcentaje de apoptosis aumentó a 43．02;j;(Fig.5 B)． Cuando se agrega al cultivo celular, el tubulosido B inhibe la apoptosis inducida por MPP＋ de una manera dependiente de la dosis. A una concentración de 10 ug·ml-1la protección por tubuloside B no fue estadísticamente significativa, pero a 50 y 1 00ug·ml-1, una disminución del 45% y 63%, respectivamente, se observó que resultó en un aumento en el porcentaje de células de supervivencia (Fig. 5D, E) .

La acumulación de ROS intracelular puede detectarse mediante el uso de DCFH—DA．Las células PC12 tratadas con 200 uM MPP＋ durante 48 h muestran una intensa fluorescencia dentro de la célula después de teñirlas con colorante DCFH-DA (Fig. 6)． El tratamiento simultáneo con tubuloside B (en dosis de 10 y 100 ug·ml) inhibió la producción de ROS inducida por MPP＋一 (el porcentaje reducido fue 24．52％ y 55．63％, respectivamente)．

Discusión

La patogenia de la EP implica un fuerte estrés oxidativo, niveles reducidos de antioxidantes y defectos mitocondriales. todos conocidos por inducir la apoptosis en varios sistemas celulares. En particular, se ha demostrado que los radicales libres desencadenan la muerte celular activa en las neuronas[14]． MPTP produce un síndrome similar al parkinsoniano grave e irreversible que provoca una degeneración selectiva de las neuronas dopaminérgicas nigroestriatales en humanos. Esta neurotoxina se ha utilizado para crear modelos animales de PD[15]. La monoaminooxidasa B convierte la MPTP en MPP＋, que se acumula en las mitocondrias. donde inhibe el complejo mitocondrial I y los días mitocondriales. función causa apoptosis[16]. Por lo tanto, la MPP más la neurotoxicidad inducida por 一 en las neuronas dopaminérgicas se ha empleado ampliamente como un modelo etiológico de la EP para la detección de agentes neuroprotectores.

En el presente estudio, hemos demostrado que el tubulósido B redujo la muerte celular inducida por MPP plus a través del estrés oxidativo en células PC12. y apoptosis, medida usando electroforesis en gel de ADN y análisis de citometría de flujo. Además, el tratamiento simultáneo con concentraciones más altas de tubuloside B inhibió la producción de ROS inducida por MPP. Por lo tanto, tubuloside B ha mostrado efectos neuroprotectores multifuncionales. Varios mecanismos, por separado o en asociación, pueden estar involucrados en las acciones del tubulosido B. El efecto antioxidante es un mecanismo posible para la neuroprotección mediada por el tubulosido B. Xiong Q descubrió que el tubulosido B mostraba una fuerte actividad de eliminación de radicales libres en el radical 1,1-difenil-2-picrilhidrazilo y el radical anión superóxido generado xantina]xantina oxidasa [6].

Se ha informado recientemente que varios feniletanoides poseen propiedades de eliminación de radicales libres y protegen las lesiones tóxicas inducidas por el estrés oxidativo. Las ROS producidas por MPP plus, como el peróxido de hidrógeno, el anión superóxido y el radical hidroxilo, dañan fácilmente las moléculas biológicas, lo que en última instancia puede conducir a la muerte celular apoptótica o necrótica. Por lo tanto, tubuloside B puede tener efectos de eliminación directa contra ROS. Si bien nuestros datos no establecen el sitio exacto en el que actúa el tubulosido B para suprimir la acumulación de ROS, sí sugieren que el mecanismo neuroprotector involucra la estimulación de las vías antioxidantes. Un estudio de la estructura molecular del tubuloside B también indica que posee una potente capacidad para eliminar los radicales libres (comunicación personal).

Otros mecanismos también podrían ser pertinentes. Por ejemplo, el tubulosido B puede tener la capacidad de contrarrestar la toxicidad de MPP＋ al inhibir la apertura del poro de transición de la permeabilidad mitocondrial y la disfunción. Además, también se debe considerar si el tubulosido B tiene un efecto promotor del crecimiento directo en las células neuronales. El mecanismo exacto de la acción neuroprotectora del tubulosido B sigue sin estar claro. Se requieren estudios adicionales para dilucidar el cuadro completo de su efecto neuroprotector.

En conclusión, el tubulosido B del extracto de salsa Cistanche tiene efectos protectores evidentes sobre la apoptosis inducida por MPP plus y el estrés oxidativo. Sus efectos neuroprotectores contra la toxicidad de MPP ＋ podrían ser importantes y sugieren que puede tener potencial terapéutico en la prevención y el tratamiento de la EP.

tratamiento de la EP: cistanche

Referencias

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9. Yao Z, Drieu K, Szweda LI, Papadopoulos V. Los radicales libres y la peroxidación de lípidos no median la muerte celular neuronal inducida por -amiloide. Cerebro Res 1999; 847: 203- 10

10. Yamamoto T, Yuyama K, Nakamura K, Kato T, Yamamoto H. Caracterización cinética de la toxicidad del óxido nítrico para las células PC12: efecto del tiempo de vida media de la liberación de NO. Eur J Pharmacol 2000; 397:25-33

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14. Merad-Boudia M, Nicole A, Santiard-Baron D, Saille C, CeballosPicot L Deterioro mitocondrial como un evento temprano en el proceso de apoptosis inducido por el agotamiento del glutatión en las células neuronales: relevancia para la enfermedad de Parkinson. Biochem Pharmaco11998; 56: 645-55

15. Langston JW, Ballard P, Tetrud JW, Irwin I. Parkinsonismo crónico en humanos debido a un producto de la síntesis de análogos de meperidina. Ciencia 1983; 219:979-80

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