Extracción asistida por ultrasonidos de polisacáridos de Cistanche tubulosa: optimización de procesos, aislamiento de fracciones, caracterización estructural y efectos antifatiga

 

Abstracto:Este estudio tuvo como objetivo optimizar el proceso de extracción de polisacáridos (CP) de Cistanche tubulosa e investigar sus características estructurales y efectos antifatiga. Guiadas por experimentos de un solo factor y optimizadas utilizando la metodología de superficie de respuesta, las condiciones óptimas fueron 20 minutos de ultrasonicación, una relación disolvente-material de 20:1 y una potencia ultrasónica de 220 W, con un rendimiento de CP del 8,55 %. Posteriormente, la cromatografía en columna de celulosa produjo una fracción neutra (CPN) y tres fracciones ácidas (CPA-1, CPA-2, CPA-3). Entre ellos, CPN mostró la mayor recuperación (40,3%), el mayor contenido de carbohidratos (39,5%) y una fuerte actividad antioxidante comparable a la CPA-2; por lo tanto, se seleccionó CPN para una caracterización en profundidad. Los análisis estructurales revelaron grupos funcionales de polisacáridos característicos, un predominio de glucosa y manosa, y evidencia de dos componentes con pesos moleculares marcadamente diferentes. In vivo, la CPN prolongó significativamente el tiempo de natación con carga de peso en ratones, redujo el nitrógeno ureico y el lactato en sangre sérica y aumentó el glucógeno hepático, lo que confirma la actividad antifatiga. Estos hallazgos proporcionan una base científica para desarrollar polisacáridos de Cistanche tubulosa en productos funcionales antifatiga y aplicaciones comerciales relacionadas.

Palabras clave: Polisacáridos de cistanche tubulosa; metodología de superficie de respuesta; proceso de extracción; caracterización estructural; antifatiga; Nuevos beneficios para la PC en alimentos funcionales y nutracéuticos.

 

Introducción

Cistanche tubulosa (Schenk) Wight,una preciada planta homóloga medicinal y comestible conocida como "ginseng del desierto", tiene una larga historia de uso en China [1]. Sus principales constituyentes bioactivos incluyen polisacáridos, glucósidos feniletanoides e iridoides; entre estos, los polisacáridos exhiben importantes funciones fisiológicas, como efectos inmunomoduladores [2], antioxidantes [3], antifatiga [4] e hipoglucemiantes [5], lo que muestra amplias perspectivas de aplicación en productos farmacéuticos, productos para la salud y alimentos funcionales [6]. Los métodos tradicionales de extracción de polisacáridos (p. ej., inmersión en agua caliente y reflujo) a menudo presentan duraciones prolongadas, baja eficiencia, alto consumo de energía y daños potenciales a la estructura y actividad de los polisacáridos [7–9]. Más allá de la extracción con agua caliente [10] y el reflujo [11], Teng et al. [12] compararon la extracción por ultrasonido, microondas y combinación de ultrasonido y microondas, y encontraron que el método sinérgico de ultrasonido y microondas proporcionó el mejor rendimiento (11,00%), 1,28 % más que la extracción con agua caliente, seguido por el microondas y el ultrasonido solos.

La separación y purificación de polisacáridos tiene como objetivo obtener monosustancias o fracciones específicas bioactivas, estructuralmente definidas y de alta pureza a partir de polisacáridos crudos que contienen proteínas, ácidos nucleicos, lípidos y otras impurezas. Ailadan Maimaitiaili [11] decoloró y desproteinizó polisacáridos crudos de Cistanche con resina macroporosa AB-8, luego los separó con celulosa DEAE-650M usando agua desionizada y un gradiente de NaCl, obteniendo un polisacárido neutro y cinco ácidos; in vitro, la fracción neutra mostró una actividad antioxidante superior. Actualmente, los estudios de bioactividad de los polisacáridos de Cistanche se centran principalmente en los efectos antioxidantes, antiinflamatorios y antienvejecimiento [13], mientras que las investigaciones contra la fatiga son relativamente escasas.

Como técnica de extracción de productos naturales más nueva, la extracción asistida por ultrasonidos (EAU) ofrece un tiempo de extracción corto, alta eficiencia, simplicidad operativa y calentamiento nulo o bajo, evitando así la degradación térmica de los componentes sensibles al calor y mejorando el rendimiento y la pureza; se ha utilizado ampliamente para polisacáridos vegetales [14]. Sin embargo, las condiciones de los Emiratos Árabes Unidos para la extracción de polisacáridos (CP) de Cistanche tubulosa requieren una mayor optimización para maximizar la eficiencia. La metodología de superficie de respuesta (RSM), un enfoque eficaz de diseño y optimización basado en modelos matemáticos, permite el análisis integral de múltiples factores y sus interacciones para determinar los parámetros óptimos.

En este estudio, utilizamos RSM para optimizar el proceso de EAU para CP, separamos e identificamos los polisacáridos crudos resultantes, comparamos las actividades antioxidantes in vitro de las fracciones y, en base a la actividad antioxidante más fuerte, evaluamos los efectos antifatiga in vivo. El objetivo es brindar apoyo científico y técnico para la utilización de valor agregado de los recursos de Cistanche tubulosa y acelerar su traducción a productos funcionales para la industria del bienestar.

Polisacáridos de Cistanche tubulosa: Beneficios

 

 

 

Lista de beneficios de Cistanche

 

 

Obtener alto contenido de polisacáridos Cistanche tubulosa

 

 

1 Materiales y métodos

1.1 Materiales e instrumentos

Cistanche tubulosa was purchased from the Urumqi dried fruit market; polysaccharides were prepared in-house at Xinjiang Agricultural University. Absolute ethanol, acetone, and ether were analytical grade (Tianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd.). DPPH was from Shanghai Ruji Biotechnology Development Co., Ltd. ABTS and shiitake polysaccharide (purity >El 98%) eran de Solarbio (Pekín).

Equipo principal: trituradora XL‑02A (Yechang Machinery Co., Ltd.); baño de agua digital de temperatura constante HH‑S (Fábrica de instrumentos médicos de Jiangsu Jintan); procesador farmacéutico ultrasónico JBT/C‑YCL400T/3P(D) (Jining Jinbait Special Engineering Machinery Co., Ltd.); unidad de filtración al vacío VP50 (Beijing Labtech); evaporador rotatorio RE‑52B (Fábrica de Instrumentos Bioquímicos de Shanghai Yarong); centrífuga 80‑1 (fábrica de instrumentos Jintan Hengfeng); Espectrofotómetro UV‑2550 (Shimadzu, Shanghai).

Animales: cincuenta ratones macho SPF Kunming, peso corporal 20,00 ± 2,00 g, 3 a 4 semanas de edad, adquiridos en el Centro de animales de laboratorio de la Universidad Médica de Xinjiang (licencia SYXK‑Xin 2024‑0001).

 

Polisacáridos de Cistanche tubulosa: Beneficios

 

 

1.2 Métodos

1.2.1 Proceso de extracción de polisacáridos

Se pulverizaron rodajas de cistanche y se pasaron por un tamiz de malla 50. El polvo se colocó en un matraz de fondo redondo, se mezcló con 8 volúmenes de etanol al 80%, se calentó a reflujo a 90 grados durante 2 h y se filtró. El residuo se secó al aire. Al residuo seco se le añadió agua destilada y se extrajo mediante ultrasonido; el extracto se filtró, se retuvo el filtrado y el residuo se volvió a extraer una vez. Los dos filtrados se combinaron y concentraron hasta un cuarto del volumen original. Se añadieron tres volúmenes de etanol absoluto al concentrado, se dejó reposar a 4 grados durante 12 h y se filtró al vacío para recoger el precipitado. El precipitado se lavó secuencialmente con etanol absoluto, acetona y éter, se secó y se pesó para obtener CP bruto.

 

Polisacáridos de Cistanche tubulosa: Beneficios

 

1.2.2 Experimentos de un solo factor

1.2.2.1 Efecto de la relación disolvente-material sobre el rendimiento de CP

Se prepararon cinco porciones de polvo de Cistanche (4 g cada una). El tiempo de extracción y la potencia ultrasónica se fijaron en 20 min y 175 W. Se probaron relaciones de disolvente a material de 10:1, 15:1, 20:1, 25:1 y 30:1 (mL:g) para determinar sus efectos sobre el rendimiento de CP. Cada experimento se realizó por triplicado.

 

1.2.2.2 Efecto de la potencia ultrasónica sobre el rendimiento de CP

Se extrajeron cinco porciones de polvo (4 g cada una) con la relación óptima de disolvente a material determinada en 1.2.2.1, con un tiempo de extracción fijado en 20 min. Se probaron niveles de potencia ultrasónica de 125, 150, 175, 200 y 225 W. Se realizaron experimentos por triplicado.

 

1.2.2.3 Efecto del tiempo ultrasónico sobre el rendimiento de CP

Se extrajeron cinco porciones de polvo (4 g cada una) con la relación óptima de disolvente y material (de 1.2.2.1) y la potencia ultrasónica óptima (de 1.2.2.2). Se probaron tiempos de ultrasonido de 10, 15, 20, 25 y 30 min. Cada condición se ejecutó por triplicado.

 

1.2.3 Metodología de superficie de respuesta (RSM)

Con base en los resultados de un solo factor, se utilizó un diseño de Box-Behnken con el rendimiento de CP como respuesta y el tiempo ultrasónico, la relación solvente-material y la potencia ultrasónica como factores. La optimización de RSM se llevó a cabo en Design‑Expert 8 con un diseño de tres factores y tres niveles (consulte la Tabla 1). Los experimentos se realizaron por triplicado.

 

Polisacáridos de Cistanche tubulosa: Beneficios

 

1.2.4 Determinación del contenido de polisacáridos

El contenido de polisacáridos se midió mediante el método colorimétrico de ácido sulfúrico-antrona [15]. Se disolvió antrona (20 g) en ácido sulfúrico concentrado y se llevó a 100 ml para preparar una solución de 0,2 g/ml. Se disolvió una cantidad apropiada de CP y se diluyó hasta 100 ml. Se mezcló una alícuota de 1 ml con 5 ml de antrona-ácido sulfúrico 0,2 g/ml, se agitó, se dejó a temperatura ambiente durante 5 minutos, se calentó en un baño de agua a 90 grados durante 15 minutos, se enfrió y se midió la absorbancia a 585 nm. Se utilizó glucosa para preparar una curva estándar: Y=0.0081X + 0.0176 (R²=0.9991). La absorbancia de la muestra se sustituyó en la curva para calcular el contenido de polisacárido.

 

1.2.5 Cálculo del rendimiento de polisacáridos

El rendimiento de polisacárido se calculó según la fórmula estándar (masa de polisacárido obtenido con respecto a la masa de materia prima), utilizando el contenido de polisacárido medido.

 

1.2.6 Purificación de polisacáridos

Crude CP extract was prepared under the optimized conditions. Following Wang et al. [16], Sevag reagent (chloroform:n‑butanol = 4:1, v/v) was used for deproteinization with vigorous shaking for 10 min, followed by centrifugation; the supernatant was collected and the process repeated three times. Eight volumes of 95% ethanol were added to the filtrate and left at 4 °C for 24 h. After centrifugation (8000 r/min, 10 min), the precipitate was collected and freeze‑dried to obtain crude CP. A 10 mg/mL solution was prepared by dissolving 100 mg crude CP in 10 mL distilled water, centrifuged at 7000 r/min for 10 min to remove insolubles, and filtered through a 0.45 μm membrane. The solution was loaded onto a DEAE‑52 cellulose column and eluted stepwise with distilled water and 0.1, 0.3, and 0.5 mol/L NaCl. Eluates were monitored by anthrone–sulfuric acid assay; fractions with absorbance >1,0 se reunieron, se concentraron, se dializaron, se liofilizaron y se pesaron para obtener diferentes fracciones de polisacáridos. El rendimiento (Y) se calculó como:
Y = (C × V × D) / (m × P)
donde C es la concentración de polisacárido (mg/mL) de la solución objetivo purificada, V es el volumen (mL), D es el factor de dilución, m es la masa de CP cruda (g) y P es el contenido de polisacáridos de la CP cruda.

 

1.2.7 Comparación de actividades antioxidantes de fracciones.

1.2.7.1 Eliminación de radicales DPPH

Siguiendo a Jiang et al. [17] con modificaciones, se preparó recientemente una solución de trabajo de DPPH de 0,2 mmol/l. Se mezclaron soluciones fraccionadas a 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 y 1,0 mg/ml (1 ml cada una) con 2 ml de DPPH, se agitaron en vórtex y se incubaron en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 minutos. La absorbancia se midió a 517 nm (Ai). Cada prueba se triplicó y la vitamina C (Vc) en concentraciones equivalentes sirvió como control positivo. La tasa de eliminación se representó versus la concentración y se calculó mediante:
Eliminación de DPPH (%)=[1 − (Ai − Aj) / (A0)] × 100
donde Ai es A(2 ml de DPPH + 1 ml de muestra/Vc), Aj es A(2 ml de etanol + 1 ml de muestra/Vc) y A0 es A(1 ml de agua + 2 ml de DPPH).

 

1.2.7.2 Eliminación de radicales ABTS

Siguiendo a Xu et al. [18] con modificaciones, se mezcló 1 ml de muestra a 0,2–1,0 mg/ml con 4 ml de solución ABTS, se agitó en el vórtex y se incubó en la oscuridad durante 6 minutos a temperatura ambiente. La absorbancia se midió a 734 nm, por triplicado. Vc en concentraciones equivalentes fue un control positivo. La tasa de eliminación se representó versus la concentración y se calculó mediante:
Eliminación de ABTS (%)=[1 − (Ai − Aj) / (A0)] × 100
donde Ai es A(1 ml de muestra/Vc + 4 ml de ABTS), Aj es A(1 ml de muestra/Vc + 4 ml de agua) y A0 es A(1 ml de agua + 4 ml de ABTS).

 

1.2.8 Análisis estructural de fracciones de polisacáridos.

1.2.8.1 Espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier (FTIR)

Siguiendo a Zhang WenChao et al. [19] con modificaciones, se mezclaron 2 mg de polisacárido pretratado con 200 mg de KBr seco, se molieron y se prensaron en gránulos. Se recogieron espectros de 400 a 4000 cm⁻¹ con una resolución de 4 cm⁻¹ con 32 escaneos.

 

1.2.8.2 Determinación del peso molecular

Siguiendo a Zhang Jiayuan [20] con modificaciones, se disolvieron 5 mg de muestra en NaCl de 0,05 mol/l a 5 mg/ml, se centrifugaron y se filtraron a través de una membrana de 0,22 μm. El peso molecular se determinó mediante HPGPC con dos columnas SEC solubles en agua a base de polímeros (8 mm × 300 mm) en serie, detector: Waters RI; fase móvil: NaCl 0,05 M; flujo: 0,50 ml/min; temperatura de la columna: 40 grados; inyección: 30 μL. Las curvas de calibración fueron:
Lg Mp–RT: y=−0,1359x + 9.4523 (R²=0.9974)
Lg Mw–RT: y=−0,1375x + 9.5035 (R²=0.9976)
Lg Mn–RT: y=−0,1368x + 9.4749 (R²=0.9971)
Los pesos moleculares se calcularon en consecuencia.

 

1.2.8.3 Composición de monosacáridos

Siguiendo a Naxin S et al. [21], las muestras se procesaron y analizaron mediante cromatografía iónica/HPLC. Los estándares (5 mg de cada uno de ramnosa, arabinosa, galactosa, glucosa, xilosa, manosa, ácido galacturónico, ácido glucurónico, glucosamina HCl, galactosamina HCl; 10 mg de fucosa) se disolvieron y se llevaron a 10 ml, luego se diluyeron a una serie de concentraciones. La cromatografía utilizó un sistema Thermo U3000 con una columna Agilent ZORBAX Eclipse XDB‑C18 (4,6 mm × 250 mm, 5 μm); fase móvil: acetonitrilo:tampón fosfato (12 g/l de KH2PO4, pH ajustado a 6,8 con NaOH 2 M)=17:83 (v/v), isocrático; flujo 0,8 ml/min; columna de 30 grados; detección 250 nm; inyección 10 μL.

 

1.2.9 Experimentos antifatiga de fracciones de polisacáridos.

1.2.9.1 Agrupación y administración de animales

Aprobación ética No. 2023048. Después de 3 días de aclimatación, 50 ratones fueron distribuidos aleatoriamente en cinco grupos (n=10): control en blanco; control positivo (polisacárido de shiitake 300 mg/kg); fracción de dosis baja (150 mg/kg); fracción de dosis media (300 mg/kg); fracción de dosis alta (600 mg/kg). Las fracciones y los controles se administraron mediante sonda forzada durante 15 días; los ratones tenían libre acceso a comida y agua.

 

1.2.9.2 Prueba de natación con carga de peso

Cinco horas después de la última alimentación forzada, se adjuntó a cada cola de ratón un peso de plomo equivalente al 7% del peso corporal. Los ratones nadaron en un tanque de 60 cm de profundidad a 30 ± 2 grados. El tiempo desde la inmersión hasta que la cabeza permaneció sumergida durante 10 s sin salir a la superficie se registró como tiempo de natación exhaustiva.

 

1.2.9.3 Nitrógeno ureico en sangre (BUN)

Después de nadar, se recogió sangre a través del seno orbitario en tubos heparinizados y se centrifugó a 3000 r/min durante 10 minutos. El BUN se midió estrictamente según las instrucciones del kit.

 

1.2.9.4 Lactato en sangre

El suero (20 µl) se procesó según las instrucciones del kit. La absorbancia se leyó a 530 nm (1 cm de trayectoria) con agua bidestilada como cero y se calculó la concentración de lactato.

 

1.2.9.5 Glicógeno hepático

Inmediatamente después de la extracción de sangre, los ratones fueron sacrificados mediante dislocación cervical. Se extirparon los hígados, se lavaron con solución salina, se secaron y se colocaron 80 mg de tejido en un tubo con 3 volúmenes de álcali (pH 8,0). Las muestras se hirvieron durante 20 minutos, se enfriaron y se cuantificó el glucógeno según las instrucciones del kit.

 

1.2.10 Análisis de datos

Los datos se analizaron utilizando SPSS 17.1 y se informaron como media ± DE (X±S). Se utilizó ANOVA unidireccional con prueba de homogeneidad de varianza; P <0,05 se consideró estadísticamente significativo. Las cifras se prepararon en Origin 2021 y GraphPad Prism 9.

Traducción comercial y aplicaciones destacadas

Nuevo posicionamiento de beneficios: El polisacárido neutro optimizado de Cistanche (CPN) demostró efectos duales antioxidantes y antifatiga: resistencia prolongada, BUN y lactato reducidos y afirmaciones elevadas de apoyo al glucógeno hepático como "apoya la resistencia", "ayuda a reducir la fatiga inducida por el ejercicio" y "apoyo antioxidante".

Formatos de producto: Bebidas de resistencia listas para mezclar, shots de gel, gomitas funcionales y cápsulas. Combine CPN con electrolitos, vitaminas B y carbohidratos de IG bajo para formulaciones deportivas; o con los glucósidos feniletanoides tradicionales de Cistanche para obtener SKU sinérgicos de "energía + recuperación".

Guía de procesamiento: las condiciones de los EAU (20 min, proporción de solvente 20:1, 220 W) son escalables y energéticamente eficientes; El fraccionamiento con DEAE-52 produce una fracción neutra de plomo (CPN) con mayor contenido y actividad de carbohidratos, lo que permite una estandarización consistente (p. ej., mayor o igual al 39 % de carbohidratos, huella digital HPGPC con Mw bimodal).

Cumplimiento y fundamentación: utilizar los resultados presentes in vivo para fundamentar las afirmaciones de estructura/función; ampliar con pruebas piloto en humanos que midan el tiempo hasta el agotamiento, la cinética del lactato y el esfuerzo percibido. Aplique extractos de etiqueta limpia y declaraciones de solventes.

Control de calidad: adopte bandas marcadoras FTIR, proporciones de monosacáridos (predominantemente glucosa/manosa) y perfil de peso molecular HPGPC como criterios de liberación. Ensayos de antioxidantes (DPPH/ABTS) como controles de actividad durante el proceso.

 

Afiliaciones de autores y referencias (fuente autorizada)

DUAN Jihua1, HAN Haixia2,+, ZHAO Wenyan3, JIA Mingxi2, SUN Jingjing2, ZHOU Jixiang2, SONG Suqin4, ZHU Dongliang3*, BAO Xiaowei2*
(1. Centro de Investigación y Desarrollo de Alimentos Xinjiang Sikai (Co., Ltd.), Changji, Xinjiang 831100; 2. Facultad de Ciencias de los Alimentos y Farmacia, Universidad Agrícola de Xinjiang, Urumqi 830052, China; 3. Instituto de Pruebas de Instrumentos y Productos Farmacéuticos, Departamento de Logística de la Región Militar de Xinjiang, Xinjiang, Urumqi 830052; 4. Estación Experimental Integral de Urumqi, Academia de Agricultura de Xinjiang Ciencias, Xinjiang, Urumqi 830052)

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