Uso de la puntuación del módulo de rechazo común de tejido en el trasplante de riñón como medida objetiva de la inflamación del aloinjerto

Contacto: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Correo electrónico:audrey.hu@wecistanche.com

Arya Zarinsefat 1*, Jose M. Arreola Guerra2 , Tara Sigdel 1 , Izabella Damm1, Reuben Sarwal 1 , Chitranon Chan-on1 , Gyula Szabo3 , Jorge L. Aguilar-Frasco4, Xicohtencatl Ixtlapale-Carmona4 ,

Carlos Salinas-Ramos 4 , Leonardo Ramirez-Martinez 4 , Claudio Ramirez 4 , Mario Vilatoba4 , Luis E. Morales Buenrostro4 , Josefifina M. Alberu5 and Minnie M. Sarwal 1

Departamento de Cirugía, Universidad de California, San Francisco, CA, Estados Unidos,

2 Departamento de Medicina Interna, Hospital Centenario Miguel Hidalgo, Aguascalientes, México,

3 Departamento de Patología, Universidad de California, San Francisco, CA, Estados Unidos,

4 Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubira´n, Ciudad de México, México,

5 Departamento de Medicina, Tecnológico de Monterrey, Escuela de Medicina y Ciencias de la Salud, Ciudad de México, México

Trasplante de riñón a largo plazoLos resultados del aloinjerto (KT) no han mejorado como se esperaba a pesar de una mejor comprensión del rechazo y una mejor inmunosupresión. El trabajo anterior había validado una puntuación de rechazo computarizada, el módulo de rechazo común de tejidos (tCRM), medido mediante la evaluación basada en la amplificación de 11 genes de muestras de biopsia incluidas en parafina y fijadas con formalina (FFPE), lo que permite una evaluación cuantitativa e imparcial de la inmunidad. lesión. Aplicamos tCRM en un ensayo prospectivo de 124 receptores de KT, y contrastamos la evaluación mediante tCRM y las lecturas histológicas de 2 patólogos independientes sobre el protocolo y causan las biopsias posteriores al trasplante. Se usaron afeitados de cuatro 10- mm de muestras de biopsia FFPE para la extracción y amplificación de ARN mediante qPCR de los 11 genes tCRM, a partir de los cuales se calculó la puntuación de tCRM. Se consideró que los diagnósticos de biopsia de rechazo agudo (AR) o rechazo límite (BL) tenían inflamación presente, mientras que las biopsias estables no tenían inflamación. De las 77 biopsias que leyeron ambos patólogos, hubo un total de 40 discrepancias en el diagnóstico. Las puntuaciones medianas de tCRM para AR, BL y diagnósticos estables fueron 4,87, 1,85 y 1,27, respectivamente, con una diferencia significativa general entre todos los grupos histológicos (Kruskal-Wallis, p < 0).0{="" {34}}01).="" hubo="" diferencias="" significativas="" en="" las="" puntuaciones="" de="" tcrm="" entre="" los="" patólogos="" que="" encontraron="" inflamación="" frente="" a="" desacuerdo="" (p="0" 0,003),="" y="" ambos="" encontraron="" inflamación="" frente="" a="" ninguno="" de="" los="" dos="" (p="">< 0,001),="" junto="" con="" la="" significación="" general="" entre="" todas="" las="" puntuaciones="" (="" kruskal-wallis,="" p="">< 0,001).="" un="" modelo="" de="" regresión="" logística="" que="" predijo="" la="" inflamación="" del="" injerto="" utilizando="" varias="" variables="" predictivas="" clínicas="" y="" tcrm="" reveló="" que="" la="" puntuación="" de="" tcrm="" era="" el="" único="" predictor="" significativo="" de="" inflamación="" del="" injerto="" (or:="" 1,90,="" ic="" del="" 95="" %:="" 1,40–2,68,="" p="">< 0,0001).="" la="" evaluación="" precisa,="" cuantitativa="" e="" imparcial="" del="" rechazo="" de="" la="" muestra="" clínica="" es="" fundamental.="" dados="" los="" diagnósticos="" discrepantes="" entre="" los="" patólogos="" en="" las="" mismas="" muestras,="" las="" personas="" podrían="" utilizar="" la="" puntuación="" tcrm="" como="" desempate="" en="" situaciones="" poco="" claras.="" proponemos="" que="" la="" puntuación="" cuantitativa="" de="" tcrm="" puede="" proporcionar="" una="" cuantificación="" imparcial="" de="" la="" inflamación="" del="" injerto,="" y="" su="" rápida="" evaluación="" mediante="" pcr="" en="" el="" afeitado="" ffpe="" puede="" convertirse="" en="" un="" complemento="" fundamental="" para="" ayudar="" a="" impulsar="" la="" toma="" de="" decisiones="" clínicas="" y="" la="" administración="" de="">

Palabras clave:transplante de riñón, rechazo agudo, biomarcadores, transcriptómica, incrustado en parafina fijado con formalina (FFPE), inflamación del injerto

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INTRODUCCIÓN

Trasplante de riñón(KT) sigue siendo el tratamiento preferido para los pacientes con enfermedad renal en etapa terminal, con tasas de mortalidad reducidas en comparación con los pacientes en lista de espera y una mejor supervivencia entre varios grupos demográficos (1–3). A pesar de las mejoras significativas en un añoriñónsupervivencia del aloinjerto (4), la tasa de pérdida crónica del injerto después del primer año posterior al trasplante sigue siendo considerable. Esto se ha observado a pesar de una mejor comprensión del rechazo del aloinjerto, junto con el advenimiento de una mejor inmunosupresión. Los métodos actuales de clasificación del rechazo histológico adolecen de un error de muestreo y de la incapacidad de cuantificar con precisión la carga inflamatoria en el aloinjerto, un predictor importante de la función y supervivencia del injerto a largo plazo (5–9). Es importante destacar que estudios previos han demostrado que la correlación patológica de la patología del aloinjerto renal con grado de Banff tiene discrepancias sustanciales entre las interpretaciones de las biopsias (10, 11).

Trabajo previo en nuestro laboratorio analizando datos de micromatrices de genoma completo de 1,030riñónLas biopsias de aloinjerto de corazón, pulmón e hígado identificaron uninmunidad comúne módulo de respuesta (CRM) de 11 genes que definen el rechazo agudo (AR) a través de diferentes aloinjertos (12-14) y posteriormente fue validado enriñónbiopsias de aloinjerto (15, 16). Si bien estos datos demostraron la utilidad potencial de usar una medida objetiva como la puntuación de CRM para ayudar en el diagnóstico de la biopsia, se trataba de análisis retrospectivos de tejido almacenado previamente. Además, no se realizaron comparaciones entre múltiples lecturas ciegas de patología de la misma biopsia, o la capacidad potencial de la puntuación CRM para usarse como un desempate objetivo o punto de datos auxiliares para ayudar a llegar a un diagnóstico más sólido.

En este análisis, observamos la serieriñónbiopsias que se obtuvieron como parte de un ensayo clínico en KT. Aplicamos nuestro protocolo que mide la expresión génica de los 11 genes CRM del ARN aislado de cuatro 10-micrones de un bloque fijado con formalina e incluido en parafina (FFPE) con fenotipos confirmados histológicamente de AR, rechazo limítrofe (BL), y diagnósticos estables. Nos referimos a esta puntuación como CRM tisular (tCRM) dada la aplicación de la puntuación CRM al tejido de biopsia (15, 16). Luego comparamos los diagnósticos de 2 patólogos ciegos y los comparamos con la puntuación tCRM para cada biopsia. Planteamos la hipótesis de que la puntuación tCRM podría usarse como un punto de datos para ayudar en el diagnóstico de la biopsia, y posiblemente como un desempate objetivo cuando hay desacuerdo entre los patólogos.

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MÉTODOS

Inscripción de pacientes y diseño del estudio

Los pacientes y las muestras se recolectaron como parte del ensayo clínico TITRATE (Prueba de umbral de inmunosupresión en aloinjertos renales para extender la eGFR). Su metodología se puede consultar en el portal ClinicalTrials.gov (Identificador: NCT02581436). En resumen, este es un ensayo clínico prospectivo, ciego y controlado de 124 receptores de KT que fueron asignados a dos tipos de maniobras para evaluar la eficacia y seguridad en términos de detección oportuna de RA, tasa de filtración glomerular (TFG) e índices de fibrosis. en biopsias de protocolo a los 12 meses post-TR. La monitorización de la función renal se basó en la TFG y las biopsias del injerto realizadas por protocolo a los 3 y 12 meses post-TR y por la causa. La inmunosupresión de inducción (IS) se asignó en función del riesgo inmunológico con basiliximab (riesgo bajo), globulina antitimocítica (riesgo alto) o sin terapia de inducción en pacientes que compartían dos haplotipos. El IS de mantenimiento se basó en tacrolimus, micofenolato y prednisona.

El estudio actual fue un análisis auxiliar de los genes tCRM (15) en todas las biopsias KT disponibles. Para nuestro estudio, después de excluir las biopsias del día cero, se dispuso de un total de 136 biopsias con histología de biopsia coincidente, todas interpretadas por un patólogo del Instituto Nacional de Ciencias Médicas de México. De estas 136 biopsias, 77 también se enviaron a la UCSF, para realizar lecturas ciegas para una evaluación adicional de la correlación con el patólogo. Las biopsias se interpretaron según los criterios de Banff más recientes en el momento del estudio (17). Cualquier forma de AR de injerto (celular aguda o mediada por anticuerpos) se combinó en una categoría de AR. Para las biopsias de lectura UCSF, se disponía de datos de diagnóstico histopatológico más granulares, incluido el tipo de rechazo mediado por anticuerpos (ABMR) y el tipo de rechazo mediado por células T (TCMR).

Extracción de ARN total

Seguimos el protocolo publicado previamente para la extracción de ARN de tejidos FFPE (18). En base a nuestra experiencia anterior, utilizamos secciones de 4 × 10 mm de espesor para extraer el ARN total de muestras FFPE con PureLink FFPE Total RNA Isolation it (Thermo Fisher Scientific, Foster City, CA). La calidad de los datos de ARN se evaluó mediante la relación de señal de absorción 260/280 y el número RIN.

Síntesis de ADNc y cuantificación de la expresión génica mediante qPCR

Se transcribió inversamente un total de 50 ng de ARN en ADN complementario (ADNc) usando SuperScript VILO (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Foster City, CA) y luego se amplificó en un paso de amplificación específico para los 11 genes usando TaqMan PreAmp Master Mix y TaqMan Primers and Probes (Thermo Fisher Scientific, Foster City, CA) para un total de 18 ciclos de amplificación. Las reacciones de qPCR se realizaron en el sistema Fluidigm BioMark FD (Fluidigm, South San Francisco, CA) utilizando un gen de mantenimiento del gen 18S y ARN total universal Human XpressRef (Qiagen, Valencia, CA) como ARN de referencia durante 40 ciclos. Los datos del chip resultante se analizaron inicialmente para el control de calidad utilizando el software de análisis BioMark, versión 2.0 (Fluidigm, South San Francisco, CA) y los valores de Ct se exportaron a una hoja de cálculo. La normalización de los datos se realizó en dos pasos. Los valores de Ct de genes individuales se normalizaron frente al valor de Ct de 18S para cada gen para obtener valores de dCt. Los valores de dCt de cada muestra se normalizaron frente a los valores de dCt de la muestra de referencia para obtener valores de ddCt que posteriormente se usaron para calcular los valores de cambio de pliegue (RQ) para cada gen en cada muestra. La puntuación tCRM se calculó tomando la media geométrica de los 11 genes CRM para cada muestra, como se describió anteriormente (12).

Análisis estadístico

Todos los datos se importaron a R versión 3.6.2 (R Foundation, Viena, Austria) para análisis posteriores. Los datos demográficos de los pacientes (Tabla 1) se muestran en función de la puntuación de tCRM superior o inferior a 2,2, nuestro límite previamente determinado con AUROC óptimo para predecir AR (15). Las pruebas estadísticas se realizaron con la prueba t de Student para variables continuas y la prueba de chi-cuadrado para variables categóricas. Se realizaron gráficos de burbujas y barras de la puntuación tCRM para cada grupo de diagnóstico patológico utilizando el paquete ggplot2. Las diferencias significativas entre todos los grupos patológicos y las diferencias por pares entre cada grupo se determinaron mediante la prueba de Kruskal-Wallis. Se realizó un agrupamiento jerárquico no supervisado utilizando los diferentes grupos patológicos y genes tCRM, con mapas de calor posteriores realizados utilizando el paquete de mapas de calor. Se consideró que las puntuaciones de tCRM superiores a 2,2 tenían un diagnóstico molecular de rechazo. Definimos una biopsia como positiva para inflamación si el diagnóstico anatomopatológico fue AR o BL y negativa para inflamación si el diagnóstico fue estable. Luego creamos una variable de concordancia entre los patólogos, donde ambos declararon que había inflamación, ambos dijeron que no había inflamación o no estaban de acuerdo si había inflamación. Luego se crearon diagramas de barras y mapas de calor para las puntuaciones de tCRM entre la variable de acuerdo como se describe anteriormente.

Calculamos un modelo de regresión logística para predecir el resultado binario de inflamación en la biopsia. Ingresamos la edad del receptor, el índice de masa corporal (IMC), la función retrasada del injerto (DGF), el género, el régimen de inducción, el estado del donante vivo, el donante masculino a receptor femenino, la KT anterior, la diálisis previa a la KT y la puntuación tCRM como variables predictoras en el modelo.

Obtuvimos la delta de TFG de cada paciente, calculada como el cambio en el momento de la biopsia de la TFG desde su TFG final a los dos años del TR. Utilizamos el coeficiente de correlación de Pearson para correlacionar la TFG delta con la puntuación tCRM del paciente que se obtuvo de la biopsia. Esto se repitió después de excluir las puntuaciones de tCRM inferiores a 2. Utilizamos los niveles más altos de anticuerpos específicos del donante (DSA) que se midieron mediante citometría de compañeros para cada paciente, representados como intensidad de fluorescencia FL media (MFI), para realizar la correlación con las puntuaciones de tCRM y calcular el coeficiente de correlación de Pearson asociado. Esta correlación también se presentó en formato de diagrama de dispersión. Para el análisis de las puntuaciones en serie, graficamos a los pacientes con puntuaciones de tCRM en serie por días posteriores al trasplante, centrándonos en los cuatro pacientes que tenían un diagnóstico original de AR, fueron tratados y luego se les realizó una biopsia posterior. También se graficaron dos pacientes adicionales que tenían puntajes elevados de tCRM que se leyeron como que tenían un diagnóstico estable, pero luego desarrollaron un nuevo diagnóstico de AR en sus biopsias de seguimiento. El diseño del estudio y el análisis posterior se resumen en forma pictórica (Figura 1).

RESULTADOS

Hallazgos de biopsia de aloinjerto de riñón de dos patólogos independientes ciegos

La demografía de los pacientes y las variables clínicas de interés no mostraron diferencias importantes entre los pacientes que tenían puntuaciones de tCRM superiores o inferiores a 2,2, excepto por una mayor edad del donante en pacientes con puntuaciones elevadas de tCRM en las biopsias posteriores al trasplante (Tabla 1). Ambos centros leyeron un total de 77 biopsias, con el patólogo 1 (México) diagnosticando 16 AR, 21 BL y 40 biopsias estables, mientras que el patólogo 2 (UCSF) diagnosticó 10 AR, 39 BL y 28 biopsias estables (Tabla 2) . Hubo un total de 40 diagnósticos erróneos entre los patólogos, y la mayor parte de estos desajustes provino de diferencias en la categoría BL.

Módulo de rechazo común de tejido como desempate que discrimina entre diagnósticos patológicos

Luego analizamos la capacidad de la puntuación tCRM para discriminar entre diagnósticos patológicos para un solo patólogo (utilizando biopsias leídas en UCSF, dado que teníamos los datos histopatológicos más detallados disponibles). Al observar las puntuaciones de tCRM por diagnóstico histológico, vimos una clara separación con puntuaciones más altas de tCRM en pacientes con AR en comparación con BL/estable, y con una mayor proporción de puntuaciones > 2,2 en pacientes con AR (Figura 2A). Las puntuaciones medianas de tCRM y los rangos intercuartílicos (IQR) para AR, BL y diagnósticos estables fueron 4,87 (IQR: 2,44–6,99), 1,85 (IQR: 1,21–2,48) y 1,27 (IQR: 0.96– 2.14), respectivamente. Además, hubo una diferencia significativa general entre todos los grupos histológicos (p < 0.001),="" junto="" con="" diferencias="" significativas="" entre="" ar="" frente="" a="" bl="" y="" ar="" frente="" a="" comparaciones="" por="" pares="" estables="" (figura="" 2b).="" esto="" destaca="" la="" correlación="" de="" las="" puntuaciones="" de="" tcrm="" con="" la="" patología="" clasificada="" en="">

Al realizar un agrupamiento jerárquico no supervisado de los genes tCRM, vemos un agrupamiento relativamente preciso por el diagnóstico patológico (Figura 2C). Al examinar de cerca cada biopsia, incluso cuando la agrupación por diagnóstico muestra heterogeneidad en los grupos agrupados, la puntuación tCRM correspondiente (que se muestra como un gradiente de color) tiende a correlacionarse con el diagnóstico. Vemos puntajes más altos con diagnósticos que reflejan mayores niveles de inflamación, lo que significa la capacidad de tCRM para discriminar y cuantificar objetivamente la inflamación en el aloinjerto sin sesgos. Cuando utilizamos nuestro límite de tCRM de 2.2 (diagnóstico molecular de la inflamación), vemos una fuerte agrupación por diagnóstico molecular. Independientemente, la mayoría de AR y BL se agrupan junto con una alta expresión génica y altas puntuaciones de tCRM, con lo contrario para la mayoría de las biopsias estables clasificadas histológicamente.

El módulo de rechazo común de tejidos discrimina entre tipos específicos de rechazo de injertos

Luego analizamos la capacidad de la puntuación tCRM para distinguir entre diferentes tipos de rechazo: C4d positivo (n=9) y ABMR negativo (n=4), TCMR (n=3) , BL (n=21) y biopsias estables (n=40). La mediana de las puntuaciones de tCRM y el IQR para C4d positivo ABMR, C4d-negativo ABMR, TCMR, BL y diagnósticos estables fueron 4,22 (IQR: 3,80–5,98), 3,47 (IQR: 1,71–6,51), 2.{ {23}} (IQR: 2,58–3.05), 1,91 (IQR: 1,32–2,88) y 1,37 (IQR: 0,99–2.00), respectivamente. Además, hubo una diferencia significativa general entre todos los grupos histológicos (p < 0,001),="" junto="" con="" diferencias="" significativas="" entre="" las="" comparaciones="" por="" pares="" que="" observaron="" abmr="" c4d="" positivo="" frente="" a="" tcmr,="" c4d="" positivo="" abmr="" frente="" a="" bl,="" c4d="" positivo="" abmr="" frente="" a="" estable="" ,="" tcmr="" frente="" a="" grupos="" estables="" y="" bl="" frente="" a="" grupos="" estables="" (figura="" 3a).="" esto="" destaca="" una="" vez="" más="" la="" correlación="" de="" las="" puntuaciones="" de="" tcrm="" con="" una="" patología="" específica="" clasificada="" en="">

Al realizar un agrupamiento jerárquico no supervisado de los genes tCRM, vemos patrones similares de agrupamiento basados ​​en la inflamación del injerto como se describió anteriormente (Figura 3B). Con las categorías diagnósticas más específicas de C4d positivo y negativo ABMR y TCMR, vemos la agrupación homogénea más notable entre los grupos ABMR. Como antes, al examinar cada biopsia de cerca, incluso cuando el agrupamiento por diagnóstico muestra heterogeneidad en los grupos agrupados, la puntuación tCRM correspondiente (que se muestra como un gradiente de color) tiende a correlacionarse con el diagnóstico. Vemos puntajes más altos con diagnósticos que reflejan mayores niveles de inflamación, lo que significa la capacidad de tCRM para discriminar y cuantificar objetivamente la inflamación en el aloinjerto sin sesgos. En última instancia, la primera rama de nuestro agrupamiento no supervisado contenía la mayoría de las muestras que tenían algún grado de inflamación del injerto, específicamente cualquier caso de ABMR, TCMR o BL (Figura 3B).

El módulo de rechazo común de tejidos discrimina por acuerdo/desacuerdo del patólogo

Luego analizamos las puntuaciones de tCRM en busca de acuerdo y desacuerdo entre los patólogos, que se definió como se explicó anteriormente. De las 77 biopsias posteriores al trasplante que leyeron ambos patólogos, ambos dijeron que había inflamación en el 33,8 por ciento, sin inflamación en el 22,1 por ciento y no estaban de acuerdo con la presencia de inflamación en el 44,2 por ciento de las muestras. Al examinar las puntuaciones de tCRM, notamos un aumento en las puntuaciones a medida que la variable de acuerdo avanzaba desde la ausencia de inflamación, el desacuerdo y el acuerdo sobre la presencia de inflamación (Figura 4A). Hubo diferencias significativas en las puntuaciones de tCRM entre los patólogos que encontraron inflamación frente a desacuerdo (p=0.003), y entre ambos que encontraron inflamación frente a que no encontraron inflamación (p < 0,001="" ),="" junto="" con="" la="" significación="" global="" entre="" todas="" las="" puntuaciones="" (p=""><>

Al realizar la agrupación jerárquica no supervisada de los genes tCRM, vimos la agrupación de muestras de biopsia en función de la variable de acuerdo (Figura 4B). Podemos ver que los grupos de expresión génica alta corresponden a que ambos patólogos están de acuerdo en la presencia de inflamación, mientras que, por el contrario, la expresión génica baja corresponde a que ambos patólogos están de acuerdo en que no hay inflamación o hay desacuerdo entre ellos. Además, vemos que la puntuación tCRM correspondiente para cada biopsia tiende a favorecer puntuaciones más altas y más bajas donde los patólogos acordaron inflamación o no inflamación, respectivamente. Si bien el agrupamiento no es perfecto, se observa una clara tendencia.

Módulo de rechazo común de tejido como predictor de rechazo y función del injerto Arriba, mostramos la utilidad clínica de tCRM en relación con la realización de diagnósticos patológicos precisos. Aunque su aplicación allí se relaciona con lo que tradicionalmente es un diagnóstico probado por biopsia, queríamos explorar el uso de tCRM en un modelo para predecir el rechazo/inflamación. Utilizando nuestra variable binaria de inflamación (biopsias AR y BL), creamos un modelo de regresión logística para predecir el resultado binario de la inflamación en la biopsia. Las variables clínicas utilizadas fueron previamente descritas (tabla 3). Curiosamente, el único predictor significativo de inflamación diagnosticada por patología fue la puntuación tCRM (OR: 1,90, IC del 95 %: 1,40–2,68, p < 0).{{16="" }}01),="" mientras="" que="" tener="" un="" donante="" masculino="" para="" la="" receptora="" femenina="" fue="" protector="" con="" una="" significación="" limítrofe="" (or:="" 0,27,="" ic="" del="" 95="" %:="" 0,07–0,98,="" p="">

Luego analizamos la capacidad de tCRM para predecir cambios a largo plazo en la TFG. Correlacionamos la TFG delta (desde la TFG en el momento de la biopsia hasta la TFG final) con la puntuación tCRM del paciente de esa biopsia (coeficiente de correlación de Pearson=0.21, p=0.{{6} }25). Luego repetimos esto después de excluir las puntuaciones de tCRM inferiores a 2, de modo que solo observáramos los valores de tCRM más elevados para ver el efecto en la TFG delta, lo que resultó en un aumento en el coeficiente de correlación a 0,32 (p=0). 05). También analizamos la correlación del nivel de DSA más alto de cada paciente con su puntuación de tCRM asociada (Figura 1 complementaria), para ver si había alguna asociación entre los niveles de DSA y las puntuaciones de tCRM, que no encontramos que estuviera correlacionada (coeficiente de correlación de Pearson { {11}}, p=0.99).

Finalmente, observamos a los pacientes que tenían biopsias en serie y puntajes tCRM. Las puntuaciones de tCRM en serie se trazaron por paciente por días posteriores al trasplante (Figura 4C). Hubo cuatro pacientes que tenían un diagnóstico original de AR y fueron tratados, luego seguidos con una biopsia posterior (Figura 4C, líneas rojas). Notamos que los cuatro pacientes inicialmente tenían una puntuación tCRM elevada, y después del tratamiento tuvieron una disminución en su puntuación, y solo a un paciente se le diagnosticó RA en la segunda biopsia. Es de destacar que dos pacientes que tenían puntajes elevados de tCRM que el patólogo leyó como diagnóstico estable desarrollaron un aumento en su puntaje de tCRM y un nuevo diagnóstico de AR en sus biopsias de seguimiento (Figura 4C, líneas azules).

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DISCUSIÓN

Planteamos la hipótesis de que la puntuación tCRM podría usarse como un punto de datos para ayudar en el diagnóstico de la biopsia, y posiblemente como un desempate objetivo cuando hay desacuerdo entre los patólogos. Arriba mostramos que la puntuación tCRM puede discriminar entre diagnósticos patológicos. tCRM es capaz de discriminar entre AR combinado, BL y muestras estables, y también puede discriminar entre diagnósticos de AR más específicos, como ABMR, TCMR y ABMR, como demostramos anteriormente. Uno de los inconvenientes conocidos de la naturaleza subjetiva/objetiva combinada de los criterios de Banff es que pueden existir discrepancias entre patólogos que observan muestras de biopsia idénticas. Anteriormente demostramos que es común el desacuerdo entre los patólogos con respecto a la carga inflamatoria en las biopsias renales. Mostramos que cuando hay acuerdo entre los patólogos sobre la presencia o ausencia de inflamación, esto tiende a estar en los extremos de la puntuación tCRM. Parte de la utilidad de la puntuación tCRM puede residir aquí, en su capacidad para proporcionar una medida objetiva de la inflamación, pero también sirve como desempate en los casos en los que el diagnóstico no está claro, pero la puntuación tCRM apunta claramente en una dirección u otra. Por ejemplo, un patólogo que lee una biopsia que no está seguro de clasificarla como AR o BL, pero con una puntuación tCRM muy alta, podría ser más objetivo y preciso al hacer el diagnóstico de AR.

Además, este estudio indica que la puntuación tCRM puede usarse para predecir resultados clínicos a más largo plazo. Aunque la correlación entre los cambios en la TFG y las puntuaciones más altas de tCRM es débil, mostramos una correlación positiva estadísticamente significativa entre ellos, con una correlación aún mayor cuando filtramos las puntuaciones de tCRM superiores a 2, lo que sugiere que las puntuaciones más elevadas sugieren un mayor grado de aloinjerto. lesión que puede predecir la reducción de la función del injerto a largo plazo (GFR delta mayor). Curiosamente, no encontramos una correlación entre los niveles de DSA de los pacientes y las puntuaciones de tCRM. Esto puede deberse en parte al hecho de que muchos pacientes con DSA no necesariamente desarrollan ABMR, además de saber que diferentes DSA pueden conferir diferentes riesgos de desarrollar ABMR. Además, mediante el seguimiento de pacientes con biopsias en serie y puntajes de tCRM, mostramos que la mayoría de los pacientes con puntajes elevados de tCRM y AR tuvieron una disminución posterior en sus puntajes, junto con una mejoría en la inflamación del injerto en biopsias posteriores (la histología posterior pasó de AR a estable). ). En particular, hubo 2 casos en los que las puntuaciones de tCRM estaban marcadamente elevadas, pero el diagnóstico patológico se mantuvo estable en la biopsia. Ambos casos dieron como resultado una puntuación de tCRM aún más elevada en la biopsia posterior, con el correspondiente diagnóstico patológico de RA. Esto sugiere la posibilidad de un diagnóstico erróneo debido a la naturaleza subjetiva de la clasificación histológica, o que la expresión elevada de los genes tCRM que se correlacionan con la inflamación del injerto, puede ser anterior a los hallazgos patológicos reales que darían lugar a un diagnóstico de RA. Independientemente, esto sugiere la utilidad de la puntuación tCRM más objetiva para ayudar a hacer el diagnóstico de AR.

Es importante establecer la cuantificación molecular de la carga inflamatoria general en el aloinjerto renal en el momento de una biopsia invasiva (5, 6, 9). Nuestro método facilita el uso de especímenes de biopsia ya disponibles de una manera eficiente (los tiempos generales del experimento son de 4 a 6 h para los ensayos que se muestran). Si bien se están proponiendo pruebas no invasivas, como el ADN libre de células derivado de donantes (dd-cfDNA), para el diagnóstico temprano de AR (19–23), un inconveniente de estas pruebas es que no interrogan directamente el tejido objetivo de interés, incluso si el dd-cfDNA se libera del aloinjerto. Con tCRM, el tejido de la biopsia que ya se está obteniendo se puede procesar utilizando tejido mínimo de biopsias frescas o bloques FFPE archivados, conservando la mayor parte del bloque FFPE original para análisis histológicos adicionales.

Nuestro estudio está parcialmente limitado por la naturaleza invasiva de tCRM. Las biopsias siguen siendo el estándar de oro y se obtienen con frecuencia, lo que permite el perfil molecular con tCRM, pero en última instancia, una transición a pruebas no invasivas en sangre u orina sería lo más ideal para los pacientes. Nuestro laboratorio está trabajando actualmente en el uso de los genes CRM en la orina para ayudar en el diagnóstico del rechazo del injerto (14). Además, aunque este estudio fue un ensayo prospectivo, la aplicación de tCRM no se utilizó para la toma de decisiones clínicas y, en cambio, fue un análisis exploratorio. Nuestro trabajo futuro se beneficiaría al considerar la puntuación tCRM como un posible criterio de valoración, o al tener en cuenta la puntuación al decidir el diagnóstico patológico final para una muestra de biopsia. Además, aunque las muestras de nuestro estudio incluían diagnósticos de TCMR, la mayoría de las muestras disponibles para el análisis eran muestras de ABMR. Si bien mostramos que la puntuación de tCRM es elevada independientemente del tipo de AR presente, el trabajo futuro deberá utilizar una mayor cantidad de especímenes dentro de cada categoría de tipo de AR específico.

Mostramos que la puntuación tCRM es capaz de discriminar entre diagnósticos patológicos, utilizando muestras FFPE ya disponibles. Es importante destacar que existe variabilidad entre diferentes patólogos, lo que se demostró en nuestros datos basados ​​en dos patólogos ciegos que realizan diagnósticos. Como tal, demostramos que el tCRM no solo puede ayudar en el diagnóstico patológico, sino que especialmente cuando existe desacuerdo o incertidumbre, la puntuación se puede utilizar para llegar a una conclusión final más sólida.

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DECLARACIÓN DE DISPONIBILIDAD DE DATOS

Los datos sin procesar que respaldan las conclusiones de este artículo serán puestos a disposición por los autores, sin reservas indebidas.

DECLARACIÓN DE ÉTICA

Los estudios con participantes humanos fueron revisados ​​y aprobados por UCSF IRB. Los pacientes/participantes dieron su consentimiento informado por escrito para participar en este estudio.

CONTRIBUCIONES DE AUTOR

AZ contribuyó al diseño del análisis, el análisis de datos, la interpretación, la redacción del manuscrito y la edición del manuscrito. JG contribuyó al diseño del estudio, la recopilación de datos y la revisión del manuscrito. TS contribuido al análisis de datos y edición del manuscrito. ID contribuyó al procesamiento de la muestra. RS y GS contribuyeron al procesamiento de muestras. CC contribuyó al procesamiento y revisión de la muestra. JF, XC, CSR, LM y CR contribuyeron a la recopilación de muestras y bases de datos. MV contribuyó a la inscripción y el trasplante de pacientes. LB contribuyó a la inscripción de pacientes. JA contribuyó al diseño del estudio, la recopilación de datos y la revisión del manuscrito. MS contribuyó al diseño del estudio, la recopilación de datos, el diseño del análisis y la revisión del manuscrito. Todos los autores contribuyeron al artículo y aprobaron la versión enviada.

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REFERENCIAS

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