Variación en la expresión génica entre dos líneas bicolores de sorgo que difieren en la respuesta de inmunidad innata

Abstracto:

La inmunidad activada por patrones moleculares asociados a microbios (MAMP) (MTI) es un componente clave de la respuesta inmunitaria innata de la planta al reconocimiento microbiano. Sin embargo, la mayor parte de nuestro conocimiento actual de MTI proviene de plantas modelo (es decir, Arabidopsis thaliana) con comparativamente menos trabajo realizado con plantas de cultivo. En este trabajo, estudiamos el estallido oxidativo desencadenado por MAMP (ROS) y la respuesta transcripcional en dos genotipos de Sorghum bicolor, BTx623 y SC155-14E. SC155-14E es una línea que muestra alta resistencia a la antracnosis y la línea BTx623 es susceptible a la antracnosis. Nuestros resultados revelaron una clara variación en la expresión génica y ROS en respuesta a la provocación de flagelina (flg22) o quitina entre las dos líneas. Si bien la respuesta transcripcional a cada MAMP y en cada línea fue única, hubo un grado considerable de superposición, y pudimos definir un conjunto central de genes asociados con la respuesta transcripcional de MAMP de sorgo. El término GO y el análisis de enriquecimiento de la ruta KEGG descubrieron más DEG relacionados con la inmunidad y la resistencia a patógenos en muestras SC155-14E tratadas con MAMP que en BTx623 con el mismo tratamiento. Los resultados proporcionan una línea de base para futuros estudios para investigar las vías de inmunidad innata en el sorgo, incluidos los esfuerzos para mejorar la resistencia a las enfermedades.

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Palabras clave:

sorgo bicolor; ROS; inmunidad innata; MAMP; secuencia de ARN; la expresion genica

1. Introducción

Las plantas están naturalmente expuestas a una variedad de estreses, incluidos numerosos patógenos bacterianos, fúngicos y virales [1]. Las plantas se protegen de los patógenos utilizando estructuras y productos químicos preformados, y respuestas del sistema inmunitario inducidas por infecciones. El sistema inmunológico de la planta emplea un sistema de percepción de dos niveles con dos capas de receptores interconectados.

El primer nivel es activado por receptores de reconocimiento de patrones localizados en la superficie (PRR), que detectan moléculas fuera de la célula al reconocer el patógeno invasor a través de la detección de motivos estructurales conservados, denominados patrones moleculares asociados a microbios (MAMP), que desencadenan un moderado, pero amplia, respuesta de defensa [2]. La flagelina, la quitina, los lipopolisacáridos, los peptidoglucanos (PGN) y el factor de elongación Tu son ejemplos de MAMP bien estudiados [3–5]. Esta respuesta de defensa se denomina inmunidad activada por MAMP (MTI) [6]. El segundo nivel de defensa conocido como Inmunidad Activada por Efectores (ETI, por sus siglas en inglés) ocurre en respuesta a proteínas efectoras derivadas de patógenos específicos que son reconocidas por la planta a través de la acción de proteínas de resistencia, lo que resulta en una respuesta inmune fuerte pero altamente específica. La ETI a menudo se puede reconocer por la inducción de muerte celular localizada denominada respuesta hipersensible (HR) [7]. Tanto el sistema MTI como el ETI detectan los patógenos y responden activando las defensas antimicrobianas en la célula infectada y en las células vecinas [3,8]. Las plantas también portan receptores inmunes que reconocen efectores de patógenos altamente variables, estos incluyen la clase de proteínas NBS-LRR [9].

Además, la resistencia sistémica adquirida (SAR) es una respuesta de resistencia de "toda la planta" que ocurre después de una exposición localizada anterior a un patógeno. SAR está asociado con la inducción de una amplia gama de genes (genes relacionados con la patogénesis), y la activación de SAR requiere la acumulación de ácido salicílico endógeno (SA) [10].

Los estudios realizados principalmente con Arabidopsis han demostrado que MTI puede causar una variedad de respuestas que incluyen cambios en la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), producción de especies reactivas de nitrógeno como el óxido nítrico (NO), depósito de calosa, niveles de calcio intracelular, flujo de iones a través del plasma membrana, inducción o represión de la expresión de varios genes relacionados con las defensas de las plantas, alteraciones en la pared celular vegetal, inducción de compuestos antimicrobianos y la síntesis de proteínas relacionadas con la patogénesis (PR) [3,11].

Aunque varias de estas respuestas MTI pueden considerarse respuestas generales de la planta, su magnitud puede ser específica de la especie de la planta e incluso específica del cultivo [12–17]. Se han desarrollado métodos para cuantificar la respuesta MTI de la planta. Estos métodos incluyen la medición de la producción de ROS o NO, la fosforilación de la proteína quinasa activada por mitógenos, la expresión génica específica inducida por MAMP, la inhibición del crecimiento de las plántulas, la lignina y los fenoles unidos a la pared celular, y la resistencia inducida por MAMP a patógenos bacterianos y fúngicos [18-20].

Sorghum bicolor (L.) Moench es un cultivo de cereales clave a nivel mundial que se ha adaptado a una variedad de hábitats y se ha mejorado para diversos propósitos [21]. Se espera que el cultivo de sorgo aumente sustancialmente en todo el mundo como uno de los principales cultivos para la producción de alimentos y biomasa [22].

A medida que aumentan las prácticas y áreas geográficas de cultivo de sorgo, es inevitable que aumente la presión de la enfermedad. El sorgo se distingue entre otros cereales por su variedad inusualmente amplia de enfermedades, que es una de las limitaciones más importantes para su producción. A nivel mundial, las enfermedades fúngicas generalizadas son las enfermedades del sorgo más destructivas que provocan enormes pérdidas en el rendimiento, tanto en términos de cantidad como de calidad de los granos [23]. La antracnosis es una de las enfermedades fúngicas más severas que afectan el rendimiento del grano de sorgo y la producción de biomasa. Las pérdidas de rendimiento debidas a este patógeno pueden ser del 50 al 70 por ciento en cultivares susceptibles [24,25]. Las plantas han desarrollado varias estrategias de defensa para luchar contra la invasión de patógenos. En el sorgo, estas estrategias incluyen la activación de proteínas PR [26], la acumulación de peróxido de hidrógeno [27] y la biosíntesis de fitoalexinas flavonoides [28]. Se han utilizado diferentes enfoques para estudiar las respuestas de resistencia del sorgo, identificar compuestos de defensa e identificar barreras físicas contra la antracnosis (consulte la referencia [29,30] para una revisión). Los estudios de expresión génica se utilizaron ampliamente para identificar genes de resistencia candidatos en plantas en función de la expresión diferencial entre cultivares resistentes y susceptibles o plantas no inoculadas y plantas inoculadas con patógenos (p. ej., referencias [31–37]). Wang et al., [37] realizaron análisis transcriptómicos para estudiar la respuesta del cultivar de sorgo BTx623 a C. subline-ola. Informaron que los genes involucrados en el metabolismo del fenilpropanoide y la biosíntesis de metabolitos secundarios se identificaron como expresados ​​diferencialmente en respuesta a la infección con el patógeno en relación con las plantas de control no inoculadas.

Sin embargo, estos experimentos se realizaron con plántulas del cultivar susceptible BTx623. Serían valiosos estudios transcriptómicos adicionales para comparar la respuesta de la expresión génica a un patógeno en los cultivares de sorgo susceptibles y resistentes. Por lo tanto, es importante comprender la arquitectura genética que controla la resistencia a enfermedades basales del sorgo y su conexión con la resistencia cuantitativa a enfermedades.

Como un paso inicial en esta dirección, recientemente analizamos un conjunto de germoplasma diverso de sorgo para determinar la variación en su respuesta a flg22 y la obtención de quitina, así como la resistencia a enfermedades fúngicas [38]. En este caso, MTI se cuantificó midiendo la producción de ROS tras la obtención de MAMP. Entre los resultados de este estudio anterior, estuvo la identificación de genotipos de sorgo que mostraron una respuesta fuerte o débil a la provocación de MAMP.

La secuenciación de alto rendimiento de próxima generación y el estudio de los transcriptomas pueden ayudar a aclarar las respuestas a las infecciones fúngicas en las plantas y aumentar la comprensión de las respuestas del huésped. Los análisis de transcriptoma se utilizaron ampliamente para estudiar las respuestas de las plantas a la infección por hongos en muchas especies de plantas, incluidos los cultivos de cereales (p. ej., referencias [31–37]).

Sin embargo, los datos publicados sobre análisis transcriptómicos comparativos de cultivos de cereales se han centrado principalmente en la respuesta a varios patógenos. En sorgo, varias publicaciones se centraron en las comparaciones de transcriptomas de plantas tratadas con varios patógenos, incluida la antracnosis [35,37]. Algunas publicaciones anteriores sugirieron que no existe una correlación significativa entre la respuesta a los MAMP y la enfermedad fúngica. Por ejemplo, Zhang et al. [17] informaron una fuerte correlación entre la respuesta a dos MAMP flg22 y la quitina en una población de mapeo de maíz, pero no hubo correspondencia con la respuesta a la enfermedad fúngica. Kimball et al. [38] también informaron una baja correlación entre las puntuaciones de respuesta de ROS inducidas por flg22-y las puntuaciones de resistencia a la mancha foliar objetivo en dos poblaciones RIL de sorgo, incluida una población BTx623/SC155-14E. Por lo tanto, dada la escasez de datos, consideramos importante perfilar transcripcionalmente la respuesta del sorgo a los tratamientos con MAMP.

En este informe actual, ampliamos nuestro análisis anterior al medir la respuesta transcripcional global a la obtención de MAMP. Utilizamos el análisis de secuenciación de ARN basado en Illumina para examinar los cambios transcripcionales en respuesta al tratamiento con flg22 o quitina en los genotipos de sorgo BTx623 y SC155-14E, que previamente caracterizamos como respondedores MTI débiles y fuertes, respectivamente. BTx623 es la línea de referencia del genoma de Sorghum bicolor [22] y SC155-14E es una línea que muestra una resistencia elevada a la antracnosis [39]. Patil et al. [39] informó que SC155-14E mostró un alto nivel de resistencia estable (casi libre de enfermedad) a la enfermedad de antracnosis en todos los entornos probados, mientras que BTx623 es susceptible a esta enfermedad fúngica. Nuestro análisis de RNA-seq identificó 5252 y 8085 genes expresados ​​diferencialmente (DEG) en BTx623 tratados con flg22 y quitina, respectivamente, y 3849 y 5786 DEG en flg22 y SC tratado con quitina155-14E, respectivamente, en comparación con controles simulados no tratados de estos dos genotipos.

Además, una comparación de DEG seleccionados utilizando dos procesos bioinformáticos diferentes mostró resultados muy similares. Los perfiles de expresión de los genes expresados ​​diferencialmente, el análisis de enriquecimiento de ontología génica (GO) y el análisis de enriquecimiento de la vía KEGG mostraron una clara variación basada en el genotipo en la expresión génica relacionada con MTI. Los resultados del enriquecimiento del término GO y la ruta KEGG revelaron más DEG relacionados con la inmunidad y la resistencia a patógenos (genes PR, genes de respuesta a la quitina, genes de respuesta al ácido salicílico, genes de respuesta al estrés, etc.) presentados en SC tratados con MAMP{{4} }E muestras relativas a BTx623 tratado con MAMP. Los resultados proporcionan una línea de base para identificar los diversos componentes de la respuesta MTI del sorgo.

2. Resultados y Discusión

2.1. Variación del estallido oxidativo en diferentes hojas de sorgo

Nuestro análisis previo de la respuesta MTI de diversos genotipos de sorgo reveló una variación significativa en el estallido oxidativo desencadenado por MAMP entre los genotipos BTx623 y SC155-14E [38]. Además, SC155-14E es una línea que muestra una alta resistencia a la antracnosis, mientras que la línea BTx623 es susceptible a la antracnosis [39]. Fue por estas razones que estos dos genotipos se eligieron para la comparación usando RNA-seq.

Al realizar las mediciones anteriores de ROS, encontramos una variación significativa incluso dentro de la misma planta, lo que nos llevó a investigar la fuente de esta variación con más cuidado. Específicamente, probamos la producción de ROS utilizando tres conjuntos de hojas, desde la parte inferior hasta la parte superior de plantas BTx623 y SC155-14E de quince días de edad. Las hojas se marcaron como #1, #2 y #3, de abajo hacia arriba, como se muestra en la Figura 1A. Los resultados del ensayo de ROS (Figura 1B) revelaron que: (1) el nivel de producción de ROS fue más bajo en las hojas más viejas (hoja n.º 1), mientras que los niveles más altos de producción de ROS en respuesta a flg22 o quitina fueron de las hojas más jóvenes ( hoja #3). (2) Tanto el BTx623 2 tratado con MAMP como el no tratado y las hojas más jóvenes (hoja n.º 2) produjeron niveles comparativamente bajos de producción de ROS.

Por el contrario, las segundas hojas más jóvenes de SC155-14E tratadas con MAMP produjeron niveles significativamente más altos (en un nivel 0.01) de producción de ROS que el simulacro no tratado, así como el tratado o simulado de BTx{ {5}} y hojas más jóvenes. (3) El estallido oxidativo desencadenado por las aplicaciones de flg22, o quitina, se detectó en los discos foliares de las hojas más jóvenes (hoja n.° 3) de ambos genotipos, aunque, como se observó anteriormente, los niveles de producción de ROS fueron más altos en SC tratadas con MAMP 155-14E en relación con BTx623. El transcurso del tiempo de la producción de ROS desencadenada por flg22-y desencadenada por quitina en la segunda hoja más joven de SC155-14E reveló que la producción de ROS desencadenada por quitina ocurrió antes que la producción de ROS desencadenada por flg22- (Figura 1C ). Resultados similares fueron informados por Zhang et al. [17] donde la producción de ROS desencadenada por quitina apareció antes que la producción de ROS desencadenada por flg22-en flg22 y plántulas de maíz tratadas con quitina. Se informó [40] que la producción de ROS en respuesta a flg22 mostró la producción más alta de ROS alrededor de los 12 min y la más baja a los 30 min en Arabidopsis. Los resultados de nuestro ensayo de ROS en sorgo mostraron la producción más alta de ROS alrededor de los 13 min y la más baja a los 30 min después del tratamiento con flg22, que es muy similar a los resultados en Arabidopsis. Dado que nuestro objetivo era encontrar las condiciones óptimas para comparar la respuesta MTI de los dos genotipos, elegimos las segundas hojas más jóvenes de plantas de 15-días para la extracción de ARN y el posterior análisis transcriptómico. La variación entre las hojas de plantas individuales de sorgo es un recordatorio de que los resultados pueden variar entre experimentos según la fuente, el momento y otras características de un experimento determinado y, por lo tanto, que los parámetros experimentales deben controlarse cuidadosamente.

El estallido oxidativo, una producción rápida y transitoria de especies reactivas de oxígeno (ROS), es uno de los primeros aspectos observables de la respuesta de defensa de una planta [41]. Teniendo en cuenta que el estallido de ROS es una respuesta inmediata, se espera una respuesta transcripcional ligeramente más tardía de genes relacionados con MTI. Recolectamos muestras 60 minutos después del tratamiento con MAMP para el análisis de RNA-Seq.

2.2. Genes expresados ​​diferencialmente (DEG) de BTx623 y SC155-14E en respuesta a tratamientos con MAMP

Para evaluar el nivel de expresión de los genes que codifican la proteína Sorghum bicolor anotados para cada muestra, se calculó el número de lecturas limpias de RNA-seq que mapearon a cada gen y luego se normalizaron en FPKM (fragmentos por modelo de exón kb por millón de fragmentos mapeados). Se investigaron los cambios de expresión de cada gen en discos de hojas tratados con MAMP de BTx623 y SC155-14E en comparación con tratamientos simulados (agua). El total de genes expresados ​​fue similar en todos los tratamientos de ambos genotipos: 27 171, 27 283, 27 161, 27 182, 27 512 y 27 175 genes expresados ​​en simulacro de BTx623, BTx623 tratado con flg22-, BTx623 tratado con quitina, simulacro de SC{ {22}}E, flg22-SC155-14E tratado y SC155-14E tratado con quitina, respectivamente. Usamos el genoma de referencia BTx623 para el mapeo de lectura en ambas líneas, ya que la referencia específica para SC155-14E no está disponible. Los números de genes expresados ​​recuperados de BTx623 y SC{{30}}E con todas las condiciones anteriores revelaron que ambas líneas compartían números similares de genes expresados. Las tasas generales de mapeo de lectura de muestras de SC155- 14E simulado (3 repeticiones), SC155-14E tratado con flg22 (3 repeticiones), SC155-14E tratado con quitina (3 repeticiones) , BTx623 simulado (3 repeticiones), BTx623 tratado con flg22 (3 repeticiones), BTx623 tratado con quitina (3 repeticiones) fueron: 93,6 % , 93,9 % , 93,9 % , 93,8 % , 93,9 % , 93,6 % , 93,5 % , 93,5 % , 93.1 por ciento , 96.9 por ciento , 97.0 por ciento , 97.0 por ciento , 97.2 por ciento , 96.8 por ciento , 97.0 por ciento , 96.9 por ciento , 97.0 por ciento, 97.0 por ciento, respectivamente. Estos resultados sugirieron que los diferentes efectos del tratamiento con MAMP en los transcriptomas de BTx623 y SC155-14E no se debían a las diferencias en la secuencia genómica entre los dos genotipos.

El gráfico PCA de expresión génica proporciona información sobre la asociación entre muestras. Para explorar la similitud de nuestras muestras, realizamos un análisis PCA. El trazado de muestras en PC1 y PC2 (Figura 2) mostró que cuatro condiciones experimentales (BTX623_flg22; SC155-14E_flg22 flg22; BTX623_quitina y SC{ {10}}E_quitina) estaban muy separados. Por el contrario, las tres réplicas biológicas de cada línea de sorgo y cada tratamiento MAMP, así como el tratamiento simulado, se agruparon muy juntas, respectivamente, lo que indica una buena reproducibilidad entre las réplicas biológicas (Figura 2).

Los gráficos de volcanes en la Figura 3 muestran la expresión génica en las dos líneas de sorgo tratadas con flg22 o quitina. Un diagrama de volcán es un tipo de diagrama de dispersión que muestra la significación estadística (valor p) frente a la magnitud del cambio (cambio). Permite la identificación visual rápida de genes con grandes cambios que también son estadísticamente significativos. Estos pueden ser los genes biológicamente más significativos. En la Figura 3, los genes con −log10 (valor p) igual o superior a 3 se consideran DEG. Los puntos de color rojo representan DEG y los puntos de color negro representan los que no son DEG. En cada gráfico, los genes con log2 (veces_cambio) mayores que 0 son genes regulados al alza; de lo contrario, genes regulados a la baja. Los genes más regulados hacia arriba están hacia la derecha, los genes más regulados hacia abajo están hacia la izquierda y los genes estadísticamente más significativos están hacia arriba.

Los genes expresados ​​diferencialmente (DEG) se seleccionaron de cada tratamiento de acuerdo con su significado de expresión (valor de p 0.001). Cabe señalar que usamos un valor p de 0.001 como nuestro umbral pero no FDR (valores q) para seleccionar DEG en este informe. Los FDR (valores q) también fueron significativos en este nivel (Tablas S2–S5). Con un valor p de 0.001, las FDR fueron 0.0039, 0.0051, 0.0025 y 0.0035 para BTx623 con tratamiento con flg22, SC155-14E con tratamiento con flg22, BTx623 con tratamiento con quitina y SC{{ 26}}E con tratamiento de quitina, respectivamente. Los valores p y q de los genes de BTx623 y SC155-14E en todas las condiciones se enumeran en las tablas S2–S5. Al analizar los patrones de expresión de estos genes en hojas tratadas con MAMP de BTx623 y SC155-14E, observamos una gran cantidad de genes (14 a 30 por ciento del total de genes expresados) que mostraron grandes diferencias después de flg22 o quitina. tratamiento en ambas líneas de sorgo. El número total de DEG de BTx623 tratado con quitina (8085) fue muy similar al informado en un estudio previo de transcriptoma en BTx623 infectado por el patógeno de antracnosis C. subline-ola (8078) [37]. El número de DEG fue mayor en flg22 (19 por ciento) o quitina (30 por ciento) hojas tratadas con BTx623 en relación con SC155-14E (14 por ciento y 21 por ciento, respectivamente).

Aunque el mayor número de DEG en el BTx623 tratado con MAMP en relación con SC155-14E fue opuesto a la respuesta de ROS de estos dos genotipos, esto quizás no sea sorprendente ya que la respuesta de ROS y la respuesta de expresión génica al tratamiento con MAMP ocurren en diferentes momentos, son en gran parte independientes y están mediados por diferentes mecanismos [42,43]. El término GO y el enriquecimiento de la ruta KEGG revelaron más DEG relacionados con la inmunidad y la resistencia a patógenos presentados en muestras SC155-14E tratadas con MAMP. Además, el hecho de que los números de DEG fueran más altos en las muestras tratadas con quitina en relación con las tratadas con flg22 coincidía bien con los ensayos de respuesta de ROS (Figura 1B) donde vimos una respuesta de ROS más fuerte con el tratamiento con quitina.

Para investigar hasta qué punto los genes y los procesos biológicos se comparten entre los tratamientos flg22 y quitina en BTx623 y SC155-14E, comparamos sus DEG con más detalle. Los diagramas de Venn en la Figura 4A muestran la superposición en DEG en el total, los conjuntos de genes regulados hacia arriba y hacia abajo en un valor p de 0.001. Del total de 10 535 DEG, un conjunto básico de 2272 genes respondió tanto al tratamiento con flg22 como con quitina en ambas líneas de sorgo. Del mismo modo, del total de 5410 genes regulados al alza, un conjunto central de 1778 genes se reguló al alza en ambos genotipos, mientras que, de un total de 5125 genes regulados a la baja, un conjunto central de 474 se reguló a la baja en ambos genotipos. genotipos.

Los datos de secuenciación de ARN presentados aquí se analizaron mediante la canalización bioinformática con las herramientas Bowtie2 2.3.4.3, TopHat 2.1.1 y Cufflinks 2.2.1 (Cuffmerge, Cuffdiff) con parámetros predeterminados (canalización n.º 1). Para confirmar aún más los resultados del ensayo, utilizamos otra tubería (tubería n.º 2) con HiSat2, HTSeq y edgeR para realizar el análisis. HiSat2 es el próximo desarrollo de TopHat2. Comparamos los DEG de cada condición (es decir, dos genotipos tratados con flg22 o quitina, todos, DEG regulados hacia arriba o hacia abajo) seleccionados usando ambas tuberías. Los resultados (Figura 5) mostraron que los números DEG seleccionados usando ambas canalizaciones estaban muy cerca.

Los DEG totales seleccionados con la canalización n.º 1 frente a la canalización n.º 2 fueron BTx623_flg22: 5241 frente a 5413; SC155-14E_flg22: 3849 frente a 3476; BTx623_quitina: 8085 frente a 8320; SC155-14E_quitina: 5786 frente a 5383. Los DEG regulados al alza seleccionados con la tubería n.º 1 frente a la tubería n.º 2 fueron BTx623_flg22: 3074 frente a 3076; SC155-14E_flg22: 2591 frente a 2483; BTx623_quitina: 4156 frente a 4583; SC155-14E_quitina: 3486 frente a 3346. Los DEG regulados a la baja seleccionados con la canalización n.º 1 frente a la canalización n.º 2 fueron BTx623_flg22: 2152 frente a 2237; SC155-14E_flg22: 1257 frente a 993; BTx623_quitina: 3919 frente a 3757; SC155-14E_quitina: 2296 vs. 2037. Además, los resultados en la Figura 5 también revelaron que un alto porcentaje de DEG seleccionados usando las dos canalizaciones se superpusieron en todas las condiciones. El porcentaje de números DEG superpuestos/números DEG seleccionados mediante la canalización n.º 1 fue del 79,6 % y del 73,7 %. 80,8 por ciento y 74,4 por ciento de los DEG totales de BTx623_flg22, SC155-14E_flg22, BTx623_quitina y SC155-14E{{73} }quitina, respectivamente; 83 por ciento, 80,6 por ciento, 85,3 por ciento y 81,1 por ciento de DEG regulados al alza de BTx623_flg22, SC155-14E_flg22, BTx623_quitina y SC{{ 88}}E_quitina, respectivamente; 75,1 %, 59,5 %, 75,8 % y 67,4 % de DEG regulados a la baja de BTx623_flg22, SC155-14E_flg22, BTx623_quitina y SC{{ 105}}E_quitina, respectivamente. Por lo tanto, estos resultados comparativos demostraron que los datos de RNA seq presentados son correctos independientemente de cuál de los dos métodos se utilice para el análisis.

El mapa de calor de los perfiles de expresión agrupados de los DEG de BTx623 y SC155-14E tratados con flg22 o quitina para las tres réplicas biológicas se muestra en la Figura 6. Los valores de expresión génica se normalizaron como puntuaciones z. El color cambia de púrpura a rojo a medida que aumenta el valor, lo que indica que la expresión del gen va de menor a mayor. Este mapa de calor muestra claramente la regulación diferencial de los genes en BTx623 y SC155-14E en respuesta al tratamiento con flg22 o quitina. Además, los resultados también muestran que los mapas de calor de tres réplicas biológicas en cada condición eran muy parecidos, lo que indica una buena reproducibilidad entre réplicas biológicas.

Además, las comparaciones por pares (Figura 7A) entre los DEG regulados hacia arriba y hacia abajo de los tratamientos con flg22 y quitina mostraron que había una gran superposición entre BTx623 y SC155-14E. Entre los 3074 genes inducidos por flg22-en BTx623, el 83,8 % también se indujeron en BTx623 en respuesta al tratamiento con quitina, mientras que de los 2591 genes inducidos por flg22-en SC155-14E, {{ 16}}.6 por ciento también respondieron a SC155-14E tratado con quitina. Esto quizás no sea sorprendente ya que trabajos previos en Arabidopsis thaliana mostraron una superposición significativa en los genes que responden a una variedad de MAMP distintos, que definen las vías generales de MTI [44-46].

Además, Zhang et al. [17] también informaron una correlación significativa entre flg22 y la respuesta de quitina en el maíz. Se observó menos superposición entre los discos de hojas BTx623 y SC155-14E tratados con el mismo MAMP (Figura 7A). El 64,3 % de los genes inducidos por flg22-en BTx623 se indujeron en SC155-14E tratado con flg22-y el 68,3 % de los genes inducidos por quitina en BTx623 se indujeron en SC tratado con quitina155-14 MI. De manera similar, de los 2152 genes regulados a la baja con el tratamiento con flg22 de BTx623, un alto porcentaje (75,9 por ciento) también estaba regulado a la baja por la quitina en BTx623. De 1257 genes regulados a la baja por flg22 en SC155-14E, el 70,8 por ciento también estaban regulados a la baja por quitina en SC155-14E. Sin embargo, solo el 29 por ciento de los genes regulados a la baja flg22 en BTx623 también estaban regulados a la baja en flg22-SC155-14E tratado y el 45 por ciento de los genes regulados a la baja por quitina en BTx623 estaban regulados a la baja en SC155-14E tratada con quitina (Figura 7A). Por lo tanto, si bien hubo una convergencia significativa en las vías de MTI hacia flg22 y quitina en los dos genotipos comparados, los datos también sugieren una complejidad interesante sobre cómo estos dos genotipos responden a diferentes MAMP.

2.3. Análisis de enriquecimiento funcional de genes que compara la respuesta MTI de BTx623 y SC155-14E

Para determinar las categorías funcionales de genes regulados en respuesta a flg22 o quitina y la respuesta diferencial de las dos líneas de sorgo probadas, utilizamos la plataforma PlantRegMap [47,48] para realizar un análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes basado en los DEG detectados en el biológico. categoría de proceso. Las figuras 8A y B muestran los principales términos GO de genes enriquecidos en procesos biológicos con DEG regulados al alza y DEG regulados a la baja de BTx623 y SC155-14E. La lista completa de DEG se proporciona en las tablas S6–S13. Muchos de estos genes están asociados con procesos que incluyen la respuesta al estrés, las respuestas de defensa de las plantas, la respuesta al estímulo, la respuesta al estímulo biótico, la respuesta a la bacteria, la respuesta a otro organismo, la comunicación celular, el proceso metabólico del fósforo y la fosforilación de proteínas.

Los resultados de la Figura 8A y B muestran claras diferencias en la expresión de genes normalmente asociados con la inmunidad innata entre los dos genotipos de sorgo. En esos términos GO enriquecidos, se encontraron algunos DEG únicos en cada condición con superposición. Por ejemplo, la respuesta de defensa del término GO (GO 0006952): 91 y 84 DEG regulados al alza se enriquecieron en BTx623 o SC155-14E tratados con flg22, respectivamente. Dentro de esos DEG, 24 DEG fueron únicos en BTx623 y 15 DEG solo se encontraron en SC155-14E, y los demás se presentaron en ambos genotipos de sorgo. Del mismo modo, 102 y 93 DEG regulados al alza se enriquecieron en BTx623 o SC155-14E tratados con quitina, respectivamente. Dentro de esos DEG, 20 DEG fueron únicos en BTx623 y 14 DEG fueron únicos en SC155-14E, y los demás se presentaron en ambos genotipos de sorgo.

En el término GO de "respuesta a la quitina (GO: 0010200)", observamos 18 DEG regulados al alza de un total de 779 genes en esta categoría enriquecidos en las muestras SC155-14E tratadas con quitina (Figura 8 ), mientras que ningún gen se enriqueció en las muestras de BTx623 tratadas con quitina. Además, 16 DEG regulados al alza se enriquecieron en muestras SC155-14E tratadas con flg22-, y 12 DEG regulados al alza se enriquecieron en muestras BTx623 tratadas con flg22- (Figura 8). La comparación de las listas de DEG del término GO "respuesta a la quitina" en flg22 y BTX623 y SC tratados con quitina155-14E (Tabla S9) reveló que los DEG se enriquecieron en flg22 o SC tratados con quitina155- 14 E eran iguales excepto que la quitina inducía dos DEG más que flg22. Por el contrario, los 12 DEG enriquecidos en BTX623 tratado con flg22-fueron diferentes de los DEG inducidos por MAMP en SC155-14E. Esos DEG inducidos por MAMP pueden contribuir a la respuesta de resistencia de la antracnosis en SC155-14E, ya que la quitina es una molécula típica de MAMP de las paredes celulares fúngicas que provoca respuestas inmunitarias en las plantas. Stringlis et al. [49] también informaron que un conjunto de DEG regulados al alza se enriquecieron en el término GO de "respuesta a la quitina" a partir de quitina, flg22 y una rizobacteria beneficiosa para plantas, Pseudomonas simiae WCS417, plantas tratadas de Arabidopsis. Matic et al. [33] informaron que 21 DEG se enriquecieron en el término GO de "respuesta a la quitina" del análisis de secuencia de ARN de la hoja de arroz de un cultivar resistente pero no de un cultivar susceptible después de la infección con el hongo patógeno Fusarium fujikuroi.

Los genes PR (relacionados con la patogénesis) están involucrados en la respuesta inmune de las plantas [50] y tienen actividad antifúngica contra muchos hongos fitopatógenos [51]. Las proteínas PR-10 son proteínas intracelulares pequeñas, principalmente ácidas, con propiedades antifúngicas que se han asociado con respuestas de defensa en especies de plantas, incluido el sorgo [52]. Los miembros de la familia de genes PR-10 fueron inducidos por ataques de patógenos en una amplia variedad de especies de plantas [53]. En sorgo, Lo et al. [26] informaron que la expresión de PR-10 se indujo como parte de la defensa activa del huésped del sorgo contra los hongos patógenos foliares C. heterostrophus y C. sublineolum. Katy et al. [54] informaron que varios cultivares de sorgo mostraron una inducción significativa de cantidades relativas normalizadas de PR-10 después de la inoculación con esporas de hongos de C. lunata y F. capsicum en pruebas de campo. En condiciones de invernadero, las glumas de las plantas inoculadas mostraron inducción de ARNm de PR-10, y la respuesta fue mayor en dos cultivares resistentes probados en relación con dos cultivares susceptibles.

Nuestros resultados revelaron que, entre los DEG identificados, se encontraron cuatro genes PR-10 (SORBI_3001G401300, SORBI_3001G401200, SORBI_3001G400800, SORBI_3001 G401000). En SC155-14E, los cuatro PR-10 DEG aumentaron mediante flg22 o tratamiento con quitina, por el contrario, en BTx623, SORBI_3001G401000 no se encontró en DEG y SORBI{{15} }G401300 (regulado al alza) solo se presentó en BTx623 con tratamiento con quitina pero no con tratamiento con flg22. Esto indicó que la expresión de genes PR podría emplearse en respuesta a niveles más altos de productos ROS después del tratamiento con MAMP y resistencia contra la antracnosis en SC155-14E.

El ácido salicílico (SA) es una señal inmunitaria vegetal esencial tanto para la respuesta de defensa local como para la resistencia sistémica adquirida. Desempeña un papel importante en la resistencia y defensa de las plantas contra los ataques de patógenos [55]. En sorgo, Tugizimana et al. [56] informaron cambios cuantitativos en los niveles de ácido jasmónico, conjugados de ácido salicílico y ácido abscísico en sorgo infectado con C. subline-ola. C. subline-ola es el agente causal de la antracnosis. Los genotipos de sorgo con niveles mejorados de aminoácidos (triptófano y tirosina), ácido jasmónico y conjugados salicílicos, y zeatina fueron más resistentes a la antracnosis. En este estudio, el término GO 'respuesta al ácido salicílico' (GO:0009751), que incluye 19 DEG regulados al alza, se enriqueció específicamente solo en SC155-14E tratada con quitina (Tabla S9). Por lo tanto, la vía de señalización salicílico podría desempeñar un papel importante en respuesta a niveles más altos de producción de ROS después del tratamiento con MAMP y la resistencia contra la antracnosis en SC155-14E.

Además, 169 DEG regulados al alza se enriquecieron en la respuesta del término GO al estrés únicamente en SC155-14E tratada con quitina (Tabla S9). Los otros términos GO que se encuentran únicamente en SC155-14E tratados con MAMP, pero no en BTx623 con el mismo tratamiento, son procesos metabólicos secundarios (GO:0019748), proceso biosintético de fosfatidilcolina (GO:0006656) y proceso biosintético de lípidos ( IR: 0008610).

Además, 169 DEG regulados al alza se enriquecieron en la respuesta del término GO al estrés únicamente en SC155-14E tratada con quitina (Tabla S9). Los otros términos GO que se encuentran únicamente en SC155-14E tratados con MAMP, pero no en BTx623 con el mismo tratamiento, son procesos metabólicos secundarios (GO:0019748), proceso biosintético de fosfatidilcolina (GO:0006656) y proceso biosintético de lípidos ( IR: 0008610).

También examinamos la composición de genes que están co-regulados entre los dos genotipos después del tratamiento con flg22 o quitina, así como los conjuntos centrales de DEG en todos los tratamientos y dos genotipos mediante análisis de enriquecimiento GO (Figuras 4B y 7B). La lista completa de DEG se proporciona en las tablas S14 y S15. La Figura 4B mostró los términos GO enriquecidos de los conjuntos básicos de DEG totales, regulados hacia arriba y hacia abajo en BTx623 y SC155-14E con todos los tratamientos. Los términos GO relacionados con la respuesta de MAMP y la defensa de la planta (p. ej., unión de quitina, respuesta de defensa, actividad de proteína quinasa, fosforilación de proteína, actividad de proteína serina/treonina quinasa) se enriquecieron significativamente en DEG regulados al alza, mientras que los términos GO del proceso biosintético de metabolitos secundarios, La unión de iones de hierro, la actividad de oxidorreductasa solo se enriquecieron en DEG regulados a la baja. Este resultado fue similar a los resultados en Arabidopsis, donde los términos GO relacionados con la respuesta a los inductores (péptidos flg22 de P. simile WCS417 y P. aeruginosa PAO1, quitina y células bacterianas de P. simile WCS417) se enriquecieron más significativamente en la regulación al alza. conjunto básico de DEG [49].

La Figura 7B mostró los términos GO significativamente enriquecidos de conjuntos de DEG co-regulados (es decir, regulados hacia arriba o hacia abajo en ambos genotipos) entre BTx623 y SC155-14E después del tratamiento con flg22 o quitina. Los resultados revelaron que los términos GO relacionados con la respuesta de MAMP y la defensa de la planta (p. ej., respuesta de defensa, actividad de proteína quinasa, fosforilación de proteína, actividad de proteína serina/treonina quinasa) se enriquecieron solo en flg22 o DEG regulados al alza por quitina en ambos genotipos, mientras que los términos GO del proceso biosintético del metabolito secundario, la unión de hemo, la unión de iones de hierro, la actividad oxidorreductasa de un átomo de oxígeno y el proceso biosintético de fosfatidilcolina se enriquecieron únicamente en conjuntos de DEG regulados a la baja.

2.4. Análisis de enriquecimiento de la ruta KEGG de la respuesta MTI de BTx623 y SC155-14E

La Figura 9 muestra el análisis de enriquecimiento de la vía KEGG de los DEG regulados al alza que se encuentran en las muestras de BTx623 y SC155-14E tratadas con MAMP utilizando la herramienta en línea DAVID [57]. La lista completa de DEG se proporciona en las tablas S16–S20. Los resultados identifican las principales rutas KEGG específicas enriquecidas como resultado de la activación de MTI en los dos genotipos de sorgo. En la vía KEGG "interacción planta-patógeno", observamos que 24 DEG regulados al alza se enriquecieron en las muestras SC155-14E tratadas con quitina, mientras que ninguno de los DEG se enriqueció en las muestras BTx623 tratadas con quitina. La mayor respuesta de quitina del genotipo SC155-14E se correlaciona con la mayor resistencia de este genotipo a la enfermedad fúngica antracnosis [39]. Además, el enriquecimiento de la vía KEGG reveló 28 genes implicados en la biosíntesis de fenilpropanoides a término en SC155-14E tratada con flg22. La vía de biosíntesis de los fenilpropanoides comienza con la fenilalanina, que se puede convertir en compuestos aromáticos como flavonoides, bencenoides, cumarina, hidroxicinamatos y lignina [58,59]. Muchos fenilpropanoides y flavonoides estuvieron involucrados en la respuesta de resistencia a la enfermedad [28,60]. La producción de fitoalexinas es una importante respuesta de defensa contra el patógeno de la antracnosis C. subline-ola [28] en el sorgo. Las 3- desoxiantocianidinas son un grupo inusual de flavonoides reconocidos como fitoalexinas en el sorgo. Las fitoalexinas son moléculas pequeñas con actividad antimicrobiana producidas después de la infección por patógenos [61]. Wang et al. [37] también encontraron que la biosíntesis de fenilpropanoide del término KEGG se enriqueció significativamente en DEG de plantas infectadas con C. subline-ola en su estudio transcriptómico del sorgo. Debemos tener en cuenta que los resultados del enriquecimiento de la vía KEGG (Figura 9) también mostraron una mayor respuesta de BTx623 después del tratamiento con MAMP en algunas vías que podrían desempeñar un papel en las interacciones planta-patógeno (p. ej., en las vías de biosíntesis de fenilalanina y triptófano, biosíntesis de antibióticos).

Además, los resultados del análisis de enriquecimiento de la vía KEGG de los DEG regulados a la baja revelaron que diez DEG regulados a la baja se anotaron como 'proteínas de antena de fotosíntesis' y 84 DEG se anotaron como participantes en la 'biosíntesis de metabolitos secundarios' se enriquecieron en flg22 tratado BTx623. Sin embargo, tales estudios de expresión génica pueden identificar genes expresados ​​diferencialmente en respuesta al tratamiento con MAMP o infección por patógenos, pero no demuestra necesariamente que estos genes sean críticos para la resistencia contra un patógeno específico. Por lo tanto, se necesitaría más investigación para comprender las relaciones causales entre la resistencia fúngica y la activación de esas vías KEGG en ambos genotipos, como lo revela el análisis de RNA-Seq.

También realizamos un análisis de enriquecimiento de la vía KEGG para los conjuntos básicos de DEG en todas las condiciones (Figura 4C), así como los DEG co-regulados entre los dos genotipos después del tratamiento con flg22 o quitina (Figura 7C). Los resultados revelaron que seis vías importantes, incluida la vía de interacción planta-patógeno, se enriquecieron solo en conjuntos centrales de DEG regulados al alza, pero no en conjuntos centrales de DEG regulados a la baja. Del mismo modo, siete y tres vías, incluida la vía de interacción planta-patógeno, se enriquecieron significativamente en DEG regulados por incremento de quitina y DEG regulados por incremento de flg22 en BTx623 y SC155-14E, respectivamente. Por el contrario, solo la biogénesis de los ribosomas en la vía de los eucariotas se enriqueció en DEG regulados por disminución de quitina en ambos genotipos.

2.5. Validación de los datos de RNA-Seq mediante RT-PCR cuantitativa de genes seleccionados

Para confirmar los datos del perfil de expresión génica obtenidos por RNA-seq, realizamos un análisis qRT-PCR para evaluar la expresión de nueve genes candidatos seleccionados. Esos nueve genes se seleccionaron en función de la expresión observada por RNA-seq en tres categorías: (a) expresados ​​de manera similar en BTx623 y SC155-14E con flg22 o tratamiento con quitina; (b) expresado solo en SC155-14E tratado con MAMP pero con una expresión extremadamente baja en BTx623 tratado y (c) expresado 2–21-veces más alto en SC155-14E tratado con MAMP en relación con BTx623 . Los resultados del análisis de qRT-PCR (Tabla 1) revelaron una concordancia total con los niveles de expresión determinados por el análisis de RNA-seq para cada uno de los nueve genes evaluados. Estos resultados nos dan confianza de que las mediciones realizadas por RNA-seq reflejan la respuesta transcripcional de las líneas de sorgo al tratamiento con MAMP.

2.6. Conclusiones

En este estudio, primero encontramos las condiciones óptimas para la comparación de la respuesta MTI de los dos genotipos al probar la producción de ROS usando tres juegos de hojas y elegimos las segundas hojas más jóvenes de plantas de quince días para la extracción de ARN y posterior análisis transcriptómico. Un curso temporal de la producción de ROS desencadenada por flg22-y desencadenada por quitina en la línea de sorgo SC155-14E (Figura 1C) reveló que la producción de ROS desencadenada por quitina ocurrió antes que la desencadenada por el tratamiento con flg22. Obtuvimos los perfiles de expresión del genotipo SC155-14E de Sorghum bicolor resistente a la antracnosis con alta respuesta al tratamiento con MAMPs en la producción de ROS y el genotipo susceptible BTx623 con baja respuesta al producto de ROS al tratamiento con MAMP durante las primeras etapas. de la respuesta de la inmunidad innata.

Los resultados demuestran una clara variación de la expresión génica en los genotipos de sorgo BTx623 y SC155-14E en respuesta al tratamiento con MAMP. Si bien las respuestas a los dos MAMP mostraron una superposición considerable dentro de cada línea (86.6–70.8 por ciento), fueron distintas. También se observó cierta superposición, aunque menor (68,3–29 por ciento), entre las respuestas de las dos líneas al mismo MAMP. Se identificó un número considerable de DEG, 2272 de 10 535 DEG, en las cuatro condiciones y define tentativamente la respuesta central de MAMP. Esta lista de genes debería ser útil para aquellos laboratorios que deseen perfilar la respuesta de la expresión génica al tratamiento con MAMP. El análisis de RNA-seq identificó grandes conjuntos de genes expresados ​​diferencialmente en BTx623 y SC155-14E tratados con flg22 o quitina en comparación con los controles simulados no tratados de esas dos líneas. Además, una comparación de DEG seleccionados utilizando dos procesos bioinformáticos diferentes mostró resultados muy similares. El análisis detallado del perfil de expresión de estos DEG, el análisis de enriquecimiento GO y el análisis de la ruta KEGG revelaron una clara variación en la respuesta de expresión génica de los dos genotipos. El término GO y el enriquecimiento de la ruta KEGG descubrieron más DEG relacionados con la inmunidad y la resistencia a patógenos (genes PR, genes de respuesta a la quitina, genes de respuesta al ácido salicílico, respuesta al estrés, biosíntesis de fenilpropanoide, etc.) en SC tratados con MAMP{{18} }E muestras relativas a BTx623 con el mismo tratamiento. Esta información proporciona información de referencia importante sobre cómo el sistema inmunitario innato de esta planta de cultivo clave responde a la obtención de MAMP. Dada la falta general de información sobre la respuesta inmunitaria innata de las plantas de cultivo, en relación con el modelo de Arabidopsis, las listas de genes y los métodos descritos brindan un recurso para una mayor exploración de la respuesta del sorgo a los patógenos y deberían facilitar los esfuerzos para mejorar la resistencia a las enfermedades en última instancia. este importante alimento y cultivo de biomasa.

3. Materiales y Métodos

3.1. Materiales vegetales

En este estudio se utilizaron dos líneas de sorgo proporcionadas por el Dr. William Rooney (Texas A&M University, College Station, EE. UU.) y el Dr. Stephen Kresovich (Universidad de Clemson, Clemson, EE. UU.). BTx623 es una línea de sorgo estándar con una secuencia de genoma completo disponible [22], y SC155-14E es una línea desarrollada para la resistencia a la antracnosis [39].

3.2. Ensayos de ROS

Las semillas de sorgo de BTx623 y SC155-14E se esterilizaron superficialmente (70 % de etanol durante 1 min y luego 10 % de lejía durante 10 min, se enjuagaron con autoclave ddH2O) y se plantaron en autoclave Sunshine potting mix, y germinaron en cámaras de crecimiento ( 16 h/8 h luz/oscuridad, 28/26 ◦C, 60–70 por ciento de humedad). Para los experimentos se utilizaron plantas de quince días de edad.

En este estudio se utilizaron dos MAMP, flg22 (n.º de catálogo de Genscript RP19986) y quitina de caparazón de cangrejo (Sigma-Aldrich, n.º de catálogo C3641). Flg22 es un péptido derivado de la flagelina N-terminal de bacterias patógenas de plantas y es bien conocido por provocar una respuesta inmune innata específica en plantas [62]. La quitina es una molécula MAMP típica derivada de las paredes celulares fúngicas, que provoca respuestas inmunitarias en las plantas [3]. Los ensayos de ROS se realizaron de acuerdo con Kimball et al. [38]. Para evaluar la variación en la respuesta de MAMP dentro de genotipos individuales, así como la posición de las hojas, se evaluaron individualmente las tres hojas completamente expandidas de las plantas de cada genotipo. Las hojas desde la base hasta la parte superior de las plantas de sorgo de quince días de edad de cada genotipo se marcaron como hoja #1, #2 y #3. Usamos solo la parte media de la hoja para el muestreo para medir la producción de ROS. Inmediatamente después de los tratamientos, se registró la señal quimioluminiscente de cada muestra durante 30 min utilizando una cámara Photek CCD (Photek Ltd., East Sussex, Reino Unido). Ocho pozos consistieron en un tratamiento simulado (sin MAMP) y ocho pozos consistieron en un tratamiento (con MAMP). En todos los casos se compararon tres réplicas biológicas con un total de 8 muestras para cada tratamiento.

3.3. Tratamiento de muestras con MAMP

Para los experimentos se utilizaron plantas de quince días de edad. Los tratamientos con MAMP se realizaron como se describe en Valdes-Lopez et al. [12] con modificaciones menores. Brevemente, se desprendió la segunda hoja (desde la parte superior, es decir, la segunda hoja más joven) de cinco plantas para cada línea de sorgo y luego se infiltró al vacío con ddH2O esterilizada en autoclave durante 2 min. Se cortaron aproximadamente cincuenta discos de hojas de 1 cm de diámetro de las hojas infiltradas con agua de cada genotipo y se agruparon. Cuarenta y cinco discos de hojas de cada genotipo se transfirieron a tres placas de Petri diferentes (15 discos de hojas en cada placa de Petri) y luego se dejaron flotar durante la noche a temperatura ambiente en ddH2O esterilizada en autoclave con las placas cubiertas con papel de aluminio. Al día siguiente, se eliminó el agua de todas las placas de Petri y se reemplazó con 10 ml de ddH2O (simulado), 10 ml de flg22 1 µM o 10 ml de solución de quitina de 20 mg/ml. Después de un tratamiento de 60-min, se recolectaron rodajas de hojas tratadas con MAMP y simuladas en diferentes tubos y se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido. Las muestras de rebanadas de hoja (para inmunidad BTx623 y SC155-14E con tratamientos simulados, flg22 o quitina, tres réplicas biológicas) se almacenaron a −80 ◦C para la extracción de ARN. Los procedimientos descritos anteriormente se realizaron en condiciones de oscuridad para eliminar cualquier posible efecto de fotosíntesis.

3.4. Extracción de ARN, secuenciación y construcción de bibliotecas

La extracción de ARN se realizó con el kit Direct-zol RNA Miniprep Plus de Zymoresearch (catálogo n.° R2071) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

La secuenciación de alto rendimiento se realizó en la instalación central de ADN de la Universidad de Missouri. Se construyeron dieciocho bibliotecas siguiendo el protocolo del fabricante con los reactivos suministrados en el kit de preparación de muestras de ARNm trenzado TruSeq de Illumina. La concentración de la muestra se determinó con un fluorómetro Qubit (Invitrogen) usando el kit de ensayo de ARN Qubit HS, y la integridad del ARN se verificó usando el sistema de electroforesis automatizado Fragment Analyzer. Brevemente, el ARNm que contenía poli-A se purificó a partir de ARN total (1 µg), el ARN se fragmentó, se generó ADNc de doble cadena a partir de ARN fragmentado, y los adaptadores que contenían índice se ligaron a los extremos. Las construcciones de ADNc amplificadas se purificaron mediante la adición de perlas de limpieza Axyprep Mag PCR. La construcción final de cada biblioteca purificada se evaluó mediante el sistema de electroforesis automatizado Fragment Analyzer, se cuantificó con el fluorómetro Qubit mediante el kit de ensayo Qubit HS dsDNA y se diluyó de acuerdo con el protocolo de secuenciación estándar de Illumina para la secuenciación en NextSeq 500. La duración de la secuenciación fue única leer a 75 bases.

3.5. Mapeo y procesamiento de lecturas de RNA-Seq

Los datos de secuencia representaron seis condiciones diferentes: BTx623 con tratamiento simulado, flg22 o quitina, y SC155-14E con tratamiento simulado, flg22 o quitina. Cada condición estuvo representada por tres réplicas biológicas, lo que resultó en 18 muestras totales. En primer lugar, los 30 extremos de las lecturas se "recortaron" para adaptadores de Illumina, para nucleótidos ambiguos (N) y (debido a la tecnología NextSeq) para poli-G artificial (representado como G{100}) usando cutadapt versión 1.15 (http://dx.doi.org/10.14806/ej.17.1.200, consultada el 21 de agosto de 2019) para lecturas cuyos 30 extremos se superponen con el adaptador para un mínimo de 3 bases con un 90 % de identidad. Si después de este recorte, una lectura contenía menos de diez bases, se descartaba (junto con su lectura emparejada, si correspondía). Las puntuaciones de calidad de los datos de secuenciación de ARN después del recorte se examinaron mediante FASTQC (versión 0.11.9) [63]. Para todas las posiciones en lecturas, la puntuación de calidad media es de alrededor de 34, lo que indica que la precisión de las llamadas base es superior al 99,9 por ciento. Las lecturas de cada muestra se alinearon con el genoma de referencia (Sorghum_bicolor_NCBIv3.dna. top-level. fa) con Tophat 2.1.1. Los archivos de alineación resultantes se proporcionaron a Cufflinks 2.2.1 para ensamblar las transcripciones de cada muestra. La versión de anotación utilizada en esta investigación fue Sorghum_bicolor_NCBIv3.38.gff3. Las muestras de la misma condición se fusionaron usando Cuffmerge. El propósito era proporcionar una base uniforme para calcular la expresión de genes y transcripciones en cada condición.

3.6. Análisis bioinformático de datos de RNA-Seq

Los datos de secuenciación de ARN se analizaron con las herramientas bioinformáticas Bowtie{{0}}.3.4.3, TopHat 2.1.1 y Cufflinks 2.2.1 (Cuffmerge, Cuffdiff) con parámetros predeterminados. Usamos la misma tubería con estas herramientas como se describe en Trapnell et al. [64]. Para confirmar aún más los resultados del ensayo, utilizamos otra canalización con HiSat2 (versión 2.1.0), HTSeq (versión 0.12.4) y edgeR (versión 3.26.8) para realizar el análisis. HiSat2 es el próximo desarrollo de TopHat2. Primero, usamos HiSat2 para hacer la alineación usando el genoma de referencia de Sorghum. Luego usamos HTSeq para contar cuántas lecturas se asignaron a cada gen. Para esto, necesitamos los archivos bam generados en el paso anterior y la anotación del genoma (archivo gif). Tenga en cuenta que el genoma de referencia y los archivos de anotación son los mismos que usamos en la canalización original. Finalmente, usamos el paquete R edgeR para determinar los genes expresados ​​​​diferencialmente en cada condición

3.7. Identificación de genes expresados ​​​​diferencialmente
El ensamblaje fusionado se envió a Cuffdiff, que calcula los niveles de expresión y prueba la importancia estadística de los cambios observados entre dos condiciones. Comparamos las condiciones entre simulacro y flg22, y simulacro y quitina para BTx623 y SC155-14E, respectivamente. Los genes expresados ​​diferencialmente se extrajeron utilizando umbrales de valor de p 0.001. Los gráficos de volcanes se realizaron con el paquete R (ggplot2 V3.3.0) para mostrar la importancia del cambio de expresión génica en condiciones BTx623 tratadas con flg22 o quitina y SC155- 14E tratadas con flg22 o quitina, respectivamente. Los puntos del gen con −log10 (p-value) igual o mayor a tres fueron considerados DEG. En cada gráfico, los puntos de genes con log2 (veces_cambio) mayores que cero eran genes regulados al alza, de lo contrario, los genes regulados a la baja.

3.8. Parcela PCA

Para examinar la relación entre los valores de expresión génica de tres réplicas biológicas de cada línea de sorgo y cada tratamiento MAMP, se generaron gráficos de análisis de componentes principales (PCA) utilizando paquetes R (ggfortify V{{0}.4.10, ggplot2 V3 .3.0). Cada punto representa una condición después del mapeo del espacio de características original (expresión génica) a los dos primeros componentes principales. Los puntos que pertenecen a la misma condición tienden a agruparse

3.9. Mapa de calor de DEG

1 División de Ciencia y Tecnología Vegetal y Bioquímica, Centro de Ciencias de la Vida CS Bond, Universidad de Missouri, Columbia, MO 65211, EE. UU.; cuiy@missouri.edu (YC); chendq@cau.edu.cn (CC)

2 Departamento de Ingeniería Eléctrica y Ciencias de la Computación, CS Bond Life Sciences Center, Universidad de Missouri, Columbia, MO 65211, EE. UU.; yjm85@mail.missouri.edu (YJ); xudong@missouri.edu (DX)

3 Department of Entomology and Plant Pathology, NC State University, Raleigh, NC 27695, USA; pjbalint@ncsu.edu

4 Unidad de Investigación de Ciencias de las Plantas, USDA-ARS, Raleigh, NC 27695, EE. UU.

* Correspondence: staceyg@missouri.edu