Constituyentes volátiles de Cistanche tubulosa y sus potenciales antioxidantes y antimicrobianos

Contacto: Tinatina.xiang@wecistanche.com

Arafa Musa 1.2*, Khaled F.El-Massry3.4, Ahmed H.ElL-Ghorab34, Amr

Farouk◎4, Hazim M.Ali3, Mohamed A Abdelgawad⑤5.6,

Ibrahim A.Naguib◎7 y Ehab M. Mostafa◎1,2

Departamento de Farmacognosia, Facultad de Farmacia, Universidad de Jouf, Sakaka, Aljouf72341, Arabia Saudita

Departamento de Farmacognosia, Facultad de Farmacia, Universidad Al-Azhar, El Cairo, 1137I, Egipto Departamento de Química, Facultad de Ciencias, Universidad Jouf, Sakaka, Aljouf 72341, Arabia Saudita Departamento de Sabor y Aroma, Centro Nacional de Investigación, Dokki, Giza, Egipto

Departamento de Química Farmacéutica, Facultad de Farmacia, Universidad de Jouf, Sakaka, Aljouf 72341, Arabia Saudita

Departamento de Química Orgánica Farmacéutica, Facultad de Farmacia, Universidad de Beni-Suef, Beni-Surf 62514, Egipto

Departamento de Química Farmacéutica, Facultad de Farmacia, Universidad de Taif, POBox 11099, Taif 21944, Arabia Saudita

(Recibido el 2 de noviembre de 2020; Revisado el 13 de diciembre de 2020; Aceptado el 19 de diciembre de 2020)

Resumen: Los componentes volátiles hidrodestilados deCistanche tubulosa(comúnmente conocido como Desert Ginseng) han sido investigados química y biológicamente. Según los tiempos de retención y la fragmentación de masas del cromatograma GC-MS obtenido, se han identificado 106 componentes individuales que representan ≈ 99,29 por ciento de los constituyentes volátiles totales. Los compuestos principales (66,57 por ciento de la composición total) se identificaron como hexanal (15,98 por ciento), trans-sabinilacetato (12,22 por ciento), aloaromadendreno (9,30 por ciento), ácido nonanoico (6,66 por ciento), 3Z-hexeny-2-metil butanoato (6,09 por ciento), valeranona (5,25 por ciento), (E,E)- -farneseno (3,18 por ciento), -pineno (3,06 por ciento), isovalerato de linalol (3,03 por ciento) y -humuleno (1,8 por ciento). Estimación de laactividad antioxidantede EO mostró un efecto prometedor a una concentración de 80 ug/mL, ejerció una inhibición de 62.40,863.29 y 62.72 por ciento en comparación con TBHO que mostró 78.62. 77,56 y 79,23 por ciento de inhibición usando DPPH, ABTS y -caroteno/ácido linoleico, respectivamente. losactividad antioxidantese pronunció a 80 ug/mL que otras concentraciones. Los componentes volátiles mostraron una actividad inhibitoria contra las bacterias grampositivas en un rango de 2,23 mg/1{{10}}0 mL (para Staphylococcus aureus) y 15,68 mg/100 mL (para Bacillus cereus) en comparación con ciprofloxacina que mostró una actividad inhibitoria de 0,185 y 0,182 mg/100 ml, respectivamente. Además, la CMI de los volátiles hacia las bacterias gramnegativas oscila entre 18,35 (Escherichia coli) y 31,61 mg/100 ml (Klebsiella pneumonia) en comparación con la ciprofloxacina con 0,184 y 0,188 mg/ml, respectivamente. Además, la actividad antifúngica contra Candida Albicans fue bastante prometedora (4,36 mg/mL).

Palabras clave: Cistanche tubulosa; constituyentes volátiles; antioxidante; antimicrobiano; Orobanchaceae.,

1. Introducción

Cistanche tubulosa, familia Orobanchaceae, es una planta parásita perenne, que crece en zonas áridas de Asia y África, ha sido detectada en China, India, Japón, Arabia Saudita (desierto de Sakaka, Aljouf, KSA)[1]. Posee varios nombres comunes en la medicina china como Desert Hyacinth, Desert ginseng y Rou Cong Rong, el tallo es suculento y carnoso con alto contenido de agua [1-6]. Cistanche está familiarizado con los componentes volátiles y no volátiles que pueden incluir lignanos, glucósidos de feniletanoide, oligosacáridos y polisacáridos, alcaloides e iridoides. Debido a la gran diversidad del contenido fitoquímico y las actividades biológicas, Cistanche ha adquirido un alto valor medicinal en la medicina popular y tradicional china. En consecuencia, se ha utilizado como afrodisíaco en caso de impotencia e infertilidad, laxante en el estreñimiento senil, y se ha comprobado que tiene efectos neuroprotectores, especialmente en el caso del Alzheimer. Parkinson y depresión, antienvejecimiento, antineoplásico, antiagregación plaquetaria, antifúngico y antibacteriano, hepatoprotector, inmunoestimulante,antioxidante, apoyo renal y antitumoral en el carcinoma de esófago colorrectal [1, 7-13]. También se utiliza en el tratamiento de la psicoalgia de rodillas y espalda, mejora de la inmunidad y actividades cognitivas y como antidepresivo [14-17]. Se ha encontrado que tiene un efecto hipocolesterolémico según lo informado por Shimoda et al [18]. La encuesta de literatura declaró el uso seguro de Cistanche como una planta no tóxica a largo plazo [19]. Aunque C.tubulosa fue reputada por sus altos valores medicinales, particularmente en la medicina tradicional china, cuyos componentes volátiles han sido escasamente estudiados y sus composiciones químicas no han sido completamente caracterizadas. La investigación anterior reveló la caracterización de 38 componentes del aceite esencial de C. salsa, 25 compuestos del aceite de C. deserticola, con los tres componentes principales conocidos como metilo 14-pentadecanoato de metilo (13,60 por ciento) palmitato de etilo (12,40 por ciento), y 2,5,6-trimetiloletano (7,61 por ciento). La encuesta también reveló la identificación de 21 compuestos solo del aceite volátil C, tubulosa [1,20-22]. Además, la actividad biológica de los componentes volátiles no se ha investigado completamente. Por lo tanto, nuestro objetivo es identificar las composiciones químicas de los constituyentes volátiles de las flores de C. tubulosa y estimar suantioxidanteyantimicrobianoactividades.

2. Materiales y métodos

2.1.Material vegetal

Cistanche tubulosa(Schenk) Gancho. f.(Orobanchaceae) se recolectó en marzo de 2019 en el desierto de Sakaka, Aljouf, KSA. La identificación de la planta fue realizada por el Sr. Hamdan Al-Hassan, M.Sc. (Centro de investigación de camellos y praderas), Aljouf, KSA. Se archivó un espécimen de muestra (59-CPJU) en el herbario del Departamento de Farmacognosia, Facultad de Farmacia, Universidad de Jouf.

2.2. Extracción de los componentes volátiles

Las flores de C. tubulosa se recolectaron el 2019 de marzo, se lavaron cuidadosamente con agua corriente y los componentes volátiles se extrajeron por el método estándar de hidrodestilación con un aparato Clevenger. Se cortaron 500 g de flores frescas en pequeños trozos y se sometieron a hidrodestilación durante 5 horas hasta que no se produjo más rendimiento. los destilados se separaron de la fase acuosa mediante un embudo de separación de 500 ml de volumen. Se utilizó NaCl para expulsar el resto de los constituyentes volátiles de la capa acuosa mediante el mecanismo de salinización. La fase acuosa se agitó varias veces con CHC para obtener todos los destilados. Los extractos combinados luego se filtraron a través de un papel de filtro Whatman (No. 40) después de pasar sobre Na2SO anhidro, para deshidratación. El producto se calculó como 0,36 por ciento de volátiles totales. Los constituyentes obtenidos fueron líquidos de color amarillo pálido con un olor agradable. Se envasó en un frasco opaco, limpio en seco y bien cerrado, y se mantuvo en la oscuridad a 4 grados para su análisis.

2.3.Cromatografía de gases y Cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS)

El modelo 6890 de un cromatógrafo de gases Agilent suministrado con una columna capilar de sílice pegada HP-5MS de fase cementada de 120 m × 0,25 mm id(df=0,25 um) (Agilent, Folsom , CA) y se aplicó un detector de ionización de llama (FID) para el análisis del extracto volátil. La temperatura del horno se ajustó de 60 a 240 grados C a 3 grados C/min y se mantuvo durante 50 min. La relación de alimentación del gas portador de helio lineal fue de 20 cm/seg. La temperatura del inyector y del detector era de 250 grados.

Los componentes volátiles se analizaron con el GC modelo 7890B de Agilent Technologies conectado al detector de masas (GC/MS) Agilent 7000D GC/TQ y al inyector automático Agilent 7693A. Ionización a 70 eV, HP-5columna MS (120m x0.25 mm id). Todo el proceso se realizó a velocidades constantes de la fase móvil (He) de 30 cm/s y temperatura constante de 250 °C tanto para el inyector como para el detector. La temperatura del horno se programó de 60 a 240 grados a 3 grados/min y se mantuvo durante 50 min.

Se realizó una inyección concomitante de la muestra con una solución de la serie de n-hidrocarburos homólogos (Cg-C26) en las mismas condiciones para determinar los valores de los índices de Kovats. La identificación de los volátiles aislados se realizó mediante la comparación con los datos de la biblioteca de espectros de masas del NIST, la comparación de los índices de Kovats con los de los componentes auténticos y con los datos publicados. La determinación cuantitativa se llevó a cabo de acuerdo con la integración del área del pico.

2.4.Actividad antioxidante

2.4.1. Ensayo de eliminación de radicales DPPH

El potencialactividad antioxidantede los constituyentes volátiles obtenidos se evaluó mediante el método estándar DPPH, se aplicó la terc-butil hidroquinona (TBHQ) como fármaco antioxidante estándar. La medición de la absorción se realizó a λmax 517 nm en un espectrofotómetro UV (HP 8452, UV-VIS), todas las pruebas se realizaron por triplicado y se calculó el promedio de los resultados [23, 24].

2.4.2. -Ensayo de blanqueo de caroteno

Se aplicó el método estándar de -caroteno/ácido linoleico para la determinación de la actividad antioxidante de los componentes volátiles de C. tubulosa como se describió anteriormente, en relación con el antioxidante estándar terc-butil hidroquinona (TBHQ). Todas las pruebas se midieron por triplicado a λmax470 nm durante 60 minutos a partir del minuto O, y se calculó el promedio de los resultados [23,24].

2.4.3. Ensayo de radicales libres ABTS

El ABTS [2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfónico), se aplicó para la determinación antioxidante de los constituyentes volátiles de C. tubulosa como se describe en la literatura [25], en comparación al antioxidante estándar terc-butil hidroquinona (TBHQ). Todas las pruebas se midieron por triplicado a λax734 nm durante 60 minutos a partir de los 0 minutos, y se calculó el promedio de los resultados [26]. Se aplicó la siguiente ecuación para calcular el efecto de eliminación de radicales libres en todos los métodos porcentaje de inhibición=A (control)-A (prueba o estándar)/ A (control) × 100, Donde, A=Absorbancia

2.5. Ensayo antimicrobiano

2.5.1. Preparación de suspensiones microbianas

Se seleccionaron nueve cepas de microorganismos patógenos que se consideran la principal fuente de varias enfermedades e intoxicaciones alimentarias.antimicrobianoSe emplearon ensayos que incluían S. aureus, B. cereus, E. fecalis y L. monocytogenes como bacterias G plus ve, E. coli, P. aeruginosa, K. pneumonia y Salmonella Typhimurium como bacterias G-ve. Además, se empleó C. albicans como una cepa fúngica. Se aplicó el método de concentración inhibitoria mínima cuantitativa (MIC) para laantimicrobianoestimación de los constituyentes volátiles de C. tubulosa. Las suspensiones bacterianas y fúngicas se prepararon en los medios adecuados

medio de caldo para cada uno (Muller Hinton Sabaroud Dextrose para bacterias y hongos, respectivamente). La incubación de cada cepa con los medios adecuados se realizó durante 24 h a 37 °C para bacterias y 28 °C para hongos. Después del período de incubación y las diluciones en serie de las suspensiones preparadas, se seleccionaron ciertas diluciones de acuerdo con los estándares 0.5 Mc-Farlandscale para el ensayo. La ciprofloxacina y el fluconazol estándar se prepararon en 100 ug/mL y se aplicaron como fármacos antimicrobianos y antifúngicos, respectivamente [28-30].

2.5.2.Método de concentración inhibitoria mínima (MIC)

Se aplicó un método cuantitativo de placa de dilución de microtitulación, donde se aplicó el método de concentración inhibitoria mínima (MIC) para la evaluación de la actividad antimicrobiana de los constituyentes volátiles de C. tubulosa, contra ciertos microorganismos como se mencionó. Se utilizó un pocillo de microplaca estéril {{0}}, donde se mezclaron por separado 100 μL de los respectivos microorganismos en concentraciones de （0,5 Mc-Farland, aproximadamente 1 × 108 ufc/mL) con el destilado obtenido en diferentes concentraciones ( 100 por ciento, seguido de diluciones seriadas dobles). Se aplicaron ciprofloxacina y fluconazol como estándares positivos antibacterianos y antifúngicos respectivamente, mientras que se aplicó DMSO como control negativo. La microplaca con los contenidos mezclados en cada pocillo se incubó durante 24 h a ≈37 °C para bacterias y 28 °C para hongos. Luego se visualizaron las placas para cualquier precipitación de crecimiento de los organismos probados. Todos los experimentos se realizaron por triplicado y la MIC se calculó como la concentración más baja que inhibió o dificultó el crecimiento de los microorganismos analizados [27].

3. Resultados y discusión

3.1.Análisis de componentes volátiles

En nuestro estudio, la hidrodestilación de flores de C. tubulosa produjo 0.36 por ciento de destilado amarillo pálido, con

un olor fragante aromático y 106 componentes volátiles (tabla 1) que representan el 99,29 por ciento del contenido volátil. Estos componentes se clasificaron como 5 monoterpenos, 15 sesquiterpenos, 62 compuestos oxigenados ligeros que representan los compuestos del grupo más grande y 24 compuestos oxigenados pesados. Los principales componentes de los constituyentes volátiles se identificaron como hexanal (15,98 por ciento), trans-sabinil acetato (12,22 por ciento), aloaromadendreno (9,30 por ciento), ácido nonanoico (6,66 por ciento), 3Z-hexenil-2-butanoato de metilo (6,09 por ciento) por ciento), valeranona (5,25 por ciento), (E,E)- -farneseno (3,18 por ciento o), -pineno (3,06 por ciento), isovalerato de linalol (3,03 por ciento), -humuleno (1,8 por ciento), jasminol (1,58 por ciento) por ciento),4-hidroxi benzaldehído (1,56 por ciento), Geosmina (1,44 por ciento), isobutanoato de 3Z-hexenilo (1,39 por ciento) y geranil acetona (1,38 por ciento). Pero en resultados de estudios de literatura anteriores, que fueron publicados por Jiang y Hasta 2009, solo se identificaron 21 componentes volátiles en el aceite esencial de C. tubulosa, también se caracterizaron 38 componentes en el aceite esencial de C. salsa, mientras que en el aceite de C. deserticola se identificaron 25 compuestos, con tres componentes mayoritarios (metil { {52}}pentadecanoato de metilo; 13,60 %, palmitato de etilo; 12,40 %, y 2,5,6-trimetiloleth ane;7.61 por ciento)[22,28]. La identificación de los volátiles aislados se realizó de forma tentativa mediante la comparación con los datos de la biblioteca de espectros de masas del NIST, y se confirmó además mediante la comparación de los índices de Kovats con los de los componentes auténticos, así como con los datos publicados [29-31]. Se encontró que el KI calculado de los compuestos identificados cae en el rango de KI de los publicados en la literatura. Por ejemplo, el KI calculado y publicado para trans acetato de sabinilo (1287& 1273-1289),aromadendreno (1444& 1430-1450),valeranona(1678,1668-1679),alo-aromadendreno(1459& {{74 }}), -farneseno (1508 y 1505-1520), hexenil-2-butanoato de metilo (1230 y 1210-1231), -humuleno (1455 y 1452-1570), -pineno (971 y {{86 }})[32-36]. De acuerdo con los valores de KI mencionados, los compuestos identificados fueron consistentes con los reportados en la literatura [37-40].

3.2.Resultados del ensayo de antioxidantes

Se aplicaron ensayos de DPPH, ABTS y -caroteno para investigar la actividad antioxidante de los componentes volátiles de C. tubulosa, los resultados mostraron una actividad antioxidante confiable de los volátiles probados (Tabla 2). El estudio actual indicó que la capacidad de eliminación de componentes volátiles de C. tubulosa en varias concentraciones (ug/mL) varió de 26,08 por ciento a 62,40 por ciento para el ensayo DPPH, mientras que de 25,71 a 63,29 por ciento y de 27,31 a 62,72 por ciento en ({{14 }}）ug/mL para los sistemas de prueba ABTS y -caroteno, respectivamente, en comparación con el fármaco antioxidante estándar TBHQ, que mostró 43,15 a 78,62 por ciento, 41,32 a 77,56 por ciento y 42,21 a 79,23 por ciento en (20-80)ug /mL para los sistemas de prueba DPPH, ABTS y -caroteno, respectivamente. La prometedora actividad antioxidante puede atribuirse a la presencia de una mezcla compleja altamente activa en el destilado como aloaromadendreno (9,3 por ciento), valeranona (5,25 por ciento), (E, E)- -farneseno (3,18 por ciento) y -pineno (3,06 por ciento) que se suponía que tenían un impacto pronunciado en la actividad antioxidante. De acuerdo con el estudio de la literatura, la actividad biológica objetivo de los componentes volátiles puede atribuirse a la mezcla existente de componentes terpenoides y fenólicos, que se sabe que tienen actividades antimicrobianas y antioxidantes y pueden mejorar o crear sinergias con las actividades objetivo [32].

3.3. Resultados del ensayo antimicrobiano

Se aplicó el método MIC (concentración mínima inhibitoria) para probar la actividad antimicrobiana de los constituyentes volátiles de C. tubulosa contra nueve microorganismos patógenos de origen animal. El destilado exhibió una fuerte actividad contra S. aureus con MIC 2.23 mg/100mL y efecto moderado contra C. Albicans (MIC=4.36 mg/100mL), tabla 3.

4. Conclusión

Los componentes volátiles de C. tubulosa o comúnmente conocido como Desert Ginseng se componen principalmente de hexanal (15,98 por ciento), acetato de trans-sabinilo (12,22 por ciento), alo-aromadendreno (9,30 por ciento), ácido nonanoico (6,66 por ciento), 3Z-hexenilo -2-butanoato de metilo (6,09 por ciento), valeranona (5,25 por ciento), (E, E)- -farneseno (3,18 por ciento), -pineno (3,06 por ciento), isovalerato de linalool (3,03 por ciento) y -humuleno (1,8 por ciento), que se caracterizaron por sus tiempos de retención y el patrón de fragmentación de cada uno, en el cromatograma GC-MS, así como la comparación con la literatura. Estos componentes mostraron efectos antioxidantes prometedores a concentraciones de 80 ug/mL y resultados comparativamente similares al usar tres métodos de ensayo. También exhibió fuertes actividades antimicrobianas y antifúngicas contra S. aureus L. monocytogenes y C. albicans en comparación con ciprofloxacina y fluconazol.

Expresiones de gratitud

Los autores extienden su agradecimiento al Decanato de Investigación Científica de la Universidad de Jouf por financiar este trabajo a través de la subvención de investigación No (DSR2020-04-453) y al Proyecto de Apoyo a los Investigadores de la Universidad de Taif número (TURSP-2020/56), Universidad de Taif, Taif, Arabia Saudita.

Conflicto de intereses

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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