¿Cuál es la relación entre el extracto de Cistanche Tubulosa y los niveles de hormonas sexuales?

Tian Wang1, Chen Chen2, Man Yang1,2, Taiwan Deng2, Gordon Michael Kirby3 y Xiaoying Zhang1

Resumen

Contexto: Plantas del géneroCistancheHoffmann. et Link (Orobanchaceae) se utilizan generalmente como etnomedicina en el este de Asia. Estudios farmacológicos han demostrado queCistancheposee un efecto similar al de los andrógenos; sin embargo, el mecanismo exacto no está claro.

Objetivo: El presente estudio determina el efecto del extracto etanólico deCistanchetubulosa(Schenk) R. Wight vástago (CTE) enhormonanivelesy enzimas esteroidogénicas testiculares en ratas. Materiales y métodos: El contenido de glicósido feniletanoide de CTE se detectó por espectrofotometría UV. Las ratas fueron alimentadas con diferentes dosis de CTE ({{0}}.2, 0.4 y 0.8 g/kg) por administración intragástrica durante 20 d. Los parámetros espermáticos se midieron por el método de tinción y conteo. El nivel de progesterona y testosterona en suero se cuantificó mediante radioinmunoensayo. Los niveles de expresión de la enzima de escisión de la cadena lateral del colesterol (CYP11A1), 17a-hidroxilasa/17, 20-liasa (CYP17A1) y una enzima metabólica hepática (CYP3A4) en el microsoma se evaluaron mediante tinción inmunohistoquímica o Western análisis de manchas

Resultados: El estudio ilustra que la administración de CTE ({{0}}.4 y 0.8 g/kg) aumentó el conteo de espermatozoides (2.3- y 2.{{ 7}}pliegues) y la motilidad de los espermatozoides (1.3- y 1.4-pliegues) y disminuyó los espermatozoides anormales (0.76- y 0.{{15} }pliegues). El nivel sérico de progesterona y testosterona en ratas también aumentó con la administración de CTE (p50.05). Los resultados de la inmunohistoquímica y el análisis de transferencia Western confirmaron que la expresión de CYP11A1, CYP17A1 y CYP3A4 mejoró con CTE (p50.05). También se encontró que altas dosis de CTE pueden causar edema hepático leve.

Conclusión: Nuestros resultados sugieren que el aumento en el sexohormona nivelespodría estar mediada por la inducción de enzimas esteroidogénicas testiculares.

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Introducción

CistancheHoffmann. et Link (Orobanchaceae) es un género de planta medicinal que se ha utilizado en China y otros países de Asia oriental desde el siglo XV para el tratamiento de enfermedades (en la teoría de la medicina tradicional china) como impotencia, emisión seminal, infertilidad, debilidad general con laxitud de los lomos y las rodillas, y estreñimiento crónico (Wang et al., 2012). C.deserticolaYC Ma yCistanchetubulosa(Schenk) R. Wight tienen componentes químicos y actividades farmacológicas similares, y han sido documentados en la Farmacopea China (Comité Editorial de la Farmacopea China, 2010). El efecto de c.deserticolaen términos de aumento de los índices de órganos del sistema reproductivo masculino se evaluó en ratas sanas (He et al., 1996a,b). El testículo es el principal tejido responsable de la secreción de andrógenos; el sistema reproductivo de las ratas castradas fue mejorado por C.deserticolaadministración (He et al., 1996a,b). enzimas (CYP11A1 y CYP17A1) y enzima metabólica (CYP3A4) en ratas macho.

Los resultados anteriores indican que C.deserticolapuede contribuir al desarrollo del sistema reproductivo masculino a través de un efecto de regulación similar a los andrógenos oa las hormonas sexuales (He et al., 1996a,b). Estudios previos también han indicado que C.deserticolapuede contribuir a la formación de hueso en los osteoblastos (Li et al., 2012). Los andrógenos son bien conocidos por su influencia beneficiosa en el desarrollo y mantenimiento del esqueleto tanto en mujeres como en hombres (Hofbauer & Khosla, 1999).Cistanchetubulosase está considerando como una alternativa a C.deserticola, ya que se encuentra al borde de la extinción debido a la sobreexplotación desde hace décadas. Por lo tanto, el efecto de C.tubulosasobre los niveles de hormonas sexuales y su evaluación de seguridad son indispensables. sobre las dos enzimas esteroidogénicas clave (CYP11A1 y CYP17A1) y la enzima metabólica (CYP3A4) (Hanukoglu, 1992).

El presente estudio investiga los efectos directos de C.tubulosa(CTE) sobre los niveles de progesterona y testosterona, así como sobre la expresión de dos enzimas esteroidogénicas (CYP11A1 y CYP17A1) y enzima metabólica (CYP3A4) en ratas macho.

materiales y métodos

animales

En el estudio se utilizaron un total de 60 ratas macho Sprague-Dawley que pesaban entre 100 y 120 g. Los animales se mantuvieron a temperatura constante (23 ± 1 ○C) con un ciclo de luz-oscuridad de 12 h en jaulas de polipropileno y se les permitió el libre acceso a agua y alimento. Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con las pautas universitarias para el cuidado y uso de animales de laboratorio.

Preparación de extracto de C. tubulosa

los tallos deC. tubulosafueron proporcionados amablemente y confirmados por el Prof. Asociado Jian-Jun Hu (Universidad de Tarim, Xinjiang, China). losC. tubulosase recolectó durante la fluorescencia (en mayo) del área desértica en el sur de la Región Autónoma de Xinjiang. Los tallos secos se trituraron hasta convertirlos en polvo y se tamizaron a través de un tamiz de malla 200-. El polvo de Cistanche tubulosa (50 g) se extrajo dos veces con 250 ml de etanol al 70 por ciento y se concentró, luego se congeló a 80 °C y se liofilizó a sequedad. El polvo se almacenó a 4 ○C hasta su uso posterior.

Los glucósidos feniletanoides (PhG) son los principales compuestos activos deC. tubulosay el contenido fue detectado por espectrofotometría ultravioleta (Wang et al., 20{{20}}8). Se utilizó echinacósido (111670-200503, Institutos Nacionales para el Control de Alimentos y Medicamentos, China) como compuesto estándar de PhG en la detección (Comité Editorial de la Farmacopea China, 2010). El extracto de C. tubulosa (2 g) se disolvió en 100 ml de agua destilada y se sometió a resina macroporosa D101 para producir agua destilada (200 ml), etanol al 20 % (200 ml) y etanol al 70 % (200 ml). La parte de etanol al 70 por ciento luego se concentró a 50 mL y se congeló a 80 ○C y se secó hasta polvo a 60 ○C. El polvo se disolvió en 50 ml de metanol hasta su uso posterior (solución madre). La solución en 40- veces la dilución se midió a 330 nm con un espectrofotómetro. Las soluciones estándar se prepararon agregando volúmenes conocidos de equinacósido (0,04, 0,08, 0,16, 0,32 y 0,64 mg) a 5 ml de metanol.

Tratamiento de animales

Las ratas se dividieron aleatoriamente en cuatro grupos: (1) grupo de control (tratado con solución salina normal), (2) grupos de dosis baja, (3) media y (4) de CTE alta (tratados con 0 .2, 0.4 y 0.8 g/kg de CTE, respectivamente). Los materiales se alimentaron a ratas mediante administración intragástrica durante 20 días. Al día siguiente de la última administración, las ratas se anestesiaron con pentobarbital y se extrajo sangre mediante punción cardíaca. Se extrajeron y pesaron los órganos, tejidos y glándulas, incluidos el hígado, los testículos, el epidídimo, las vesículas seminales, la próstata y la glándula prepucial. Los índices de órganos se calcularon utilizando la siguiente ecuación:

Índice de órganos (porcentaje) ¼ 100 × (peso de órganos/peso corporal)

Los testículos unilaterales se fijaron en fijador de Bouin a temperatura ambiente para tinción inmunohistoquímica y H&E, y otros testículos se almacenaron a 80 ○C para la preparación de microsomas. Los hígados se fijaron en formalina para la tinción con H&E.

Las muestras de sangre se recogieron y se incubaron en posición vertical a temperatura ambiente durante 30 min para permitir la coagulación y luego se centrifugaron durante 15 min a 2000 rpm. El suero se almacenó a -20 ○C hasta su uso posterior.

Detección de parámetros seminales

Para obtener la suspensión de esperma, se recolectó el epidídimo de las ratas y se picó en solución salina normal, y luego se cultivó durante 15 min a 37 ○C. La suspensión de esperma se recolectó para la detección de los parámetros del semen.

Para el ensayo del recuento de espermatozoides, se añadieron un total de 450 ml de fijador de formalina al 10 por ciento a 50 ml de suspensión de esperma. A continuación, se añadieron 10 ml de la solución a una cámara de recuento de sangre, se contaron las cabezas de los espermatozoides y se expresaron como millones/ml de suspensión.

La viabilidad de los espermatozoides se detectó por el método de tinción, se agregaron 10 ml de suspensión de espermatozoides en un portaobjetos de vidrio. Luego, se agregaron 10 ml de la solución de tinción (eosina Y y nigrosina) y se incubó durante 2 min. Los portaobjetos se observaron mediante microscopio óptico (400 aumentos). Para cada muestra se evaluaron un total de 200 espermatozoides y se calcularon los porcentajes de viabilidad.

Se añadió un total de 10 ml de suspensión de esperma sobre el portaobjetos de vidrio, se observó la motilidad de los espermatozoides mediante microscopio óptico (400 aumentos). Se seleccionaron diez campos visuales de cada muestra y se evaluó la motilidad de 200 espermatozoides. El estándar de clasificación fue el siguiente: (1) motilidad progresiva (PR), buena capacidad atlética, movimiento en línea recta o curva, la velocidad puede ignorarse; (2) motilidad no progresiva (NP), mala capacidad atlética, dar vueltas o balancearse; (3) inmovilidad (IM), sin movimiento.

Se fijó un total de 50 ml de suspensión de esperma en un portaobjetos de vidrio y se tiñó con una solución de eosina al 1 por ciento durante 10 min. La morfología de los espermatozoides se observó mediante microscopio óptico (400 aumentos). Se evaluaron un total de 200 espermatozoides y se calculó la tasa de deformación espermática.

radioinmunoensayo

Los niveles de progesterona y testosterona se cuantificaron directamente del suero preparado utilizando kits de radioinmunoensayo (RIA) (Beijing Sino-UK Institute of Biological Technology, Beijing, China) de acuerdo con el protocolo del fabricante.

Tinción inmunohistoquímica

Los tejidos fijados se cortaron en secciones de parafina (5 mm) y se realizó inmunohistoquímica para evaluar la expresión de CYP11A1 y CYP17A1 utilizando un kit comercial (Fuzhou Maixin Biotechnology Co., Ltd., Fuzhou, China) según las instrucciones del fabricante. Los anticuerpos contra CYP11A1 y CYP17A1 se diluyeron en PBS (1:200) y el segundo anticuerpo estaba disponible en el kit. Se seleccionaron cuatro secciones de cada grupo, se seleccionaron 10 campos visuales de cada sección y un patólogo contó cualitativamente las células positivas.

Preparación de proteína microsomal testicular y hepática

La preparación microsómica se llevó a cabo esencialmente como describen Jiang et al. (2012). Las muestras de testículos o hígado se trituraron y homogeneizaron en cuatro volúmenes de tampón TMS enfriado con hielo (20 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl2 y 0,25 M sacarosa, pH 7,5). Los homogeneizados se centrifugaron a 9000g durante 20 min a 4 ○C. Se retiraron los sobrenadantes y se mezclaron con solución de CaCl2 88 mM (10:1, v/v), se centrifugaron a 27 000 g durante 20 min a 4 ○C. Los sedimentos que contenían fracciones de membrana crudas se suspendieron en tampón Tris 0,1 M con 20 por ciento de glicerol. Los microsomas se almacenaron a 80 ○C hasta su uso posterior. Las concentraciones de proteína se determinaron mediante tinción con azul brillante de Coomassie utilizando albúmina de suero bovino como estándar.

Análisis de Western Blot

Las expresiones de CYP11A1, CYP17A1 y CYP3A4 se evaluaron mediante análisis de transferencia Western. Las proteínas microsomales testiculares o hepáticas se separaron mediante SDS-PAGE en un gel al 12 por ciento y se transfirieron a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF). Las membranas se bloquearon en leche descremada en polvo baja en grasa al 5 por ciento (p/v) en solución salina tamponada con Tris con 0.05 por ciento de Tween-20 (TBST) durante 2 h, y se incubaron más con conejo anticuerpos policlonales anti-rata CYP11A1 y CYP17A1 (Boster Biological Technology, Wuhan, China) y CYP3A4 (Beijing Biosíntesis Biotechnology Co., Ltd., Beijing, China) (1:200) en TBST a 4 ○C durante 8 h, seguido de anticuerpo secundario de peroxidasa anti-conejo de cabra (1:3000) (Tianjin Sungene Biotech Co., Ltd., Tianjin, China) diluido en TBST a 37 ○C durante 1 h. La detección quimioluminiscente se realizó utilizando el sistema de formación de imágenes Bio-Rad ChemiDocTM MP (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). El valor de gris de las bandas se analizó mediante el software Image J2 (Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MA).

Ensayos de hepatotoxicidad

Para detectar la hepatotoxicidad de CTE en ratas, se evaluaron el índice hepático, la histopatología hepática y los niveles de alanina aminotransferasa (ALT). Las secciones de parafina se prepararon según un procedimiento estándar y las características histológicas se observaron mediante un microscopio óptico después de la tinción con H&E. Las secciones fueron examinadas por un patólogo que desconocía la identificación de las muestras. Los niveles séricos de ALT se midieron utilizando un kit ALT/GPT (Biosino Biotechnology and Science Inc. Beijing, China) según el protocolo del fabricante.

análisis estadístico

Todos los datos se expresaron como medias ± SD y se analizaron con análisis de varianza (ANOVA) de medidas repetidas unidireccionales. Todos los parámetros estadísticos se calcularon utilizando el software SPSS versión 19.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). Las diferencias con un valor de p inferior a 0.05 se consideraron estadísticamente significativas.

Resultados

Contenido de glucósidos feniletanoides en extracto de C. tubulosa

La curva estándar mostró una buena relación lineal entre la absorbancia y la concentración de equinacósido de {{0}}.008 a 0,128 mg/ml (Y 14,39 x más 0,08125, R2 0,9982 )

(Figura 2). El contenido de PhGs en CTE fue 41,52 por ciento por cálculo.

Efecto del extracto de C. tubulosa en los índices de órganos

Las variaciones de los índices de los órganos reproductores masculinos entre el grupo de control y todos los grupos de tratamiento no fueron significativamente diferentes (Tabla 1). Se observó una diferencia significativa (p500,05) del índice hepático entre el grupo de control y los grupos de tratamiento con dosis altas (0,8 g/kg) de CTE.

Efecto del extracto de C. tubulosa en los parámetros del semen

Como se muestra en la Tabla 2, el conteo de espermatozoides de las ratas aumentó con el tratamiento de 0.4 y 0.8 g/kg CTE (p50.05), mientras que la viabilidad de los espermatozoides no mostró diferencias significativas entre cada grupo. La administración con CTE también mostró significativamente

Hepatotoxicidad del extracto de C. tubulosa

El índice hepático del grupo de tratamiento con altas dosis de CTE disminuyó y la ALT sérica aumentó en comparación con el grupo de control (Figura 7). Las dosis altas de CTE causaron edema hepático leve (Figura 8). La estructura del hígado del grupo de control era normal; los hepatocitos mantuvieron la morfología celular y se organizaron en cordones hepáticos visibles (Figura 8a). Por el contrario, los hepatocitos en el grupo de CTE de dosis alta (Figura 8b) estaban dispersos y más del 50 por ciento de los hepatocitos mostraban varios grados de edema. Unos pocos hepatocitos exhibieron degeneración grasa. Algunos hepatocitos mostraron muerte celular con núcleos picnóticos y otras evidencias de necrosis celular, incluyendo cariólisis y restos celulares difusos.

Se demostró que Cistanche tubulosa posee un efecto hipocolesterolémico (Shimoda et al., 2009; Xiong et al., 2013). El nivel de ARNm de CYP11A1 fue regulado al alza por CTE (400 mg/kg) (Shimoda et al., 2009), de acuerdo con informes anteriores; sin embargo, el mecanismo de regulación transcripcional no estaba claro. Al igual que con los otros P450 esteroidogénicos, la regulación de CYP11A1 y CYP17A1 es relativamente compleja, y se sabe que su inducción es causada por la vía de señalización de cAMP (Guo et al., 2003; Kosˇir et al., 2012). Los promotores de CYP11A1 y CYP17A1 contienen secuencias que se unen al factor esteroidogénico (SF-1) que a su vez juega un papel importante en la expresión específica de tejido y regulada hormonalmente de genes esteroidogénicos (Ortiz de Montellano, 2005). Otros factores, incluida la unión al elemento de respuesta de cAMP (CREB), la proteína activadora 1 (AP-1), la proteína de especificidad (SP-1, SP-3), también están involucrados en la activación de CYP11A1. y transcripciones de CYP17A1. El ensamblaje de varios factores de transcripción que forman complejos proteína-ADN parece ser un paso clave en la transcripción de CYP11A1 y CYP17A1 (Ortiz de Montellano, 2005). La proteína objetivo de CTE para afectar la expresión de CYP11A1 y CYP17A1 debe investigarse más a fondo.

y carcinógenos. Los resultados mostraron que la principal enzima metabólica hormonal (CYP3A4) también fue inducida por CTE. En ratas sanas, existe una regulación por retroalimentación de las hormonas. Los autores plantearon la hipótesis de que la expresión de CYP3A4 aumentó en este estudio para metabolizar el exceso de hormonas. Esa podría ser la razón por la que el aumento de los niveles de progesterona y testosterona no fue significativo. Si se administrara CTE a ratas con niveles bajos de hormonas sexuales, el efecto podría ser más evidente.

Las evaluaciones de seguridad y toxicidad sistémica de CTE no se han investigado completamente, y nuestro presente estudio mostró que CTE en dosis altas causó edema hepático. Kim et al. (2012) encontraron que Cistanche herba inducía daño testicular incluyendo la disminución del número de espermatozoides y niveles de testosterona, dañando la estructura histológica del testículo; sin embargo, en nuestro trabajo, la estructura testicular fue normal en el examen histológico (datos no mostrados). Aunque las dosis utilizadas en este estudio fueron similares a las reportadas por Kim et al. (2012), la especie de planta herbaria fue diferente. Las condiciones de crecimiento, la temporada de cosecha y el método de procesamiento no estaban claros, lo que puede conducir a efectos farmacológicos clínicos o de calidad diferentes (Wang et al., 2012).

Conclusión

El tratamiento con CTE mostró una inducción significativa en el nivel de hormonas sexuales en ratas macho, a lo que probablemente contribuyó el efecto desencadenante de las expresiones de CYP11A1 y CYP17A1. Como medicina tradicional china y estimulante alimentario, C. tubulosa podría desarrollarse aún más en nuevos medicamentos, alimentos funcionales o suplementos dietéticos en el futuro; sin embargo, se debe evaluar la investigación sistemática de la seguridad de C. tubulosa y se debe tener en cuenta el posible riesgo de seguridad. consideración.

1Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad Northwest A&F, Yangling, China, 2Facultad de Ciencias Biológicas e Ingeniería, Universidad Tecnológica de Shaanxi, Hanzhong, China, y 3Departamento de Ciencias Biomédicas, Universidad de Guelph, Guelph, Ontario, Canadá

Expresiones de gratitud

Los autores agradecen al Prof. Jian-Jun Hu por su ayuda en la recolección y confirmación del tallo de Cistanche tubulosa.

Declaración de interés

El trabajo fue apoyado por el Programa de Proyecto Abierto del Laboratorio Estatal Clave de Medicinas Naturales, Universidad Farmacéutica de China (No. SKLNMKF201221), Ministerio de Educación y Administración Estatal de Asuntos de Expertos Extranjeros Proyecto ''Profesor Extranjero'' (No. MS2011XBNL057), China , el Programa de Reclutamiento de Expertos Extranjeros de Alto Nivel (GDW20146100228), China y con el apoyo del Programa de Construcción Clave de la Base de Cooperación Internacional en CyT, Provincia de Shaanxi (2015SD0018), China.

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