Wnt1 exógeno previene la lesión renal aguda y su posterior progresión a enfermedad renal crónica
Mar 12, 2022
Contacto: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Correo electrónico:audrey.hu@wecistanche.com
Xue Hong1†, Yanni Zhou2†, DedongWang3†, Fuping Lyu4, Tianjun Guan3, Youhua Liu1,5y Liang Xiang Xiao3*
1State Key Laboratory of Organ Failure Research, National Clinical Research Center of Kidney Disease, Divisionof Nephrology, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou, China,2Departamento de Nefrología, XiamenHospital Afiliado a la Universidad de Medicina China de Beijing, Xiamen, China,3Departamento de Nefrología, ZhongshanHospital Afiliado a la Universidad de Xiamen, Xiamen, China,4Departamento de Endocrinología y Diabetes, El Primer Hospital Afiliado de la Universidad de Xiamen, Xiamen, China,5Departamento de Patología, Facultad de Medicina de la Universidad de Pittsburgh, Pittsburgh, PA, Estados Unidos
Los estudios sugieren que los agonistas de Wnt/ -catenina son beneficiosos en el tratamiento deLesión renal aguda(IRA); sin embargo, sigue sin conocerse su papel en la prevención de la LRA y su progresión a enfermedad renal crónica (ERC). En este estudio, la señalización renal de Wnt/ -catenina se activó mediante la sobreexpresión de Wnt1 exógeno o se inhibió mediante la administración de ICG-001, un inhibidor de molécula pequeña de la señalización de -catenina, antes de que los ratones se sometieran a lesión por isquemia/reperfusión (IRI) para inducir AKI y posteriorCKD. Nuestros resultados mostraron que la expresión in vivo de Wnt1 exógeno antes de la IR protegió a los ratones contra la LRA e impidió la progresión de la LRA a la ERC en ratones, como lo demuestran los análisis bioquímicos de la sangre y los análisis histológicos renales. Por el contrario, el pretratamiento de ICG-001 antes de la RI no tuvo efecto sobre la señalización renal de Wnt/ -catenina o la progresión de AKI a CKD. Mecánicamente, la expresión in vivo de Wnt1 exógeno antes de IR suprimió la expresión de proteínas proapoptóticas en ratones AKI y redujo las respuestas inflamatorias tanto en ratones AKI como CKD. Además, la Wnt1 exógena inhibió la apoptosis de las células tubulares inducida por el tratamiento de hipoxia-reoxigenación (H/R) in vitro. En conclusión, el presente estudio proporciona evidencia para apoyar el efecto preventivo de la activación de Wnt/-catenina en la LRA relacionada con IR y su posterior progresión a ERC.
Palabras clave: lesión renal aguda, enfermedad renal crónica, Wnt1, -catenina, lesión por isquemia-reperfusión
el tratamiento deLesión renal aguda(IRA): cistanche
INTRODUCCIÓN
Lesión renal aguda (LRA)es una condición clínica debida a una pérdida rápida de la función renal por diversas lesiones, como fármacos, isquemia, sepsis y toxinas (Chawla and Kimmel, 2012; Scholz et al., 2021). La IRA se asocia con una alta incidencia de morbilidad y mortalidad, responsable de aproximadamente 2 millones de muertes cada año en todo el mundo (Belayev y Palevsky, 2014). En particular, AKI es un predictor independiente bien reconocido para el desarrollo de enfermedad renal crónica (ERC) o enfermedad renal en etapa terminal (ESRD), que han impuesto una enorme carga económica al sistema de atención médica (Leung et al., 2013; Belayev y Palevsky, 2014; Kurzhagenet al., 2020). Lamentablemente, no existen fármacos eficaces para la prevención y el tratamiento de la LRA.
La señalización de Wnt/ -catenina juega un papel fundamental en la organogénesis, la homeostasis tisular y el desarrollo de diversas enfermedades, incluidas las renales (Soni, 2021). -La catenina tiene funciones duales al actuar como proteína estructural y como regulador de la transcripción (MacDonald et al., 2009). La -catenina unida a la membrana es parte del complejo de unión adherente y contribuye a la interacción célula-célula, mientras que la -catenina citosólica es fosforilada por la glucógeno sintasa quinasa-3 (GSK-3 ) y está dirigida a la ubiquitinación y degradación proteasomal. Sin embargo, tal degradación de -catenina podría ser rescatada por los ligandos Wnt, una familia de glicoproteínas secretadas con diversas actividades biológicas. La unión de Wnt estabiliza la -catenina, que se traslada al núcleo y actúa como un factor de transcripción para la regulación génica. En particular, la señalización de Wnt/ -catenina está relativamente silenciada en los riñones adultos no lesionados, pero se reactiva durante la lesión renal aguda y crónica (Huffstater et al., 2020). La activación de Wnt/ -catenina en la etapa temprana de la LRA reduce la lesión renal y favorece la recuperación. de la función renal, mientras que la activación sostenida de Wnt/-catenina podría impulsar la progresión de AKI a CKD (Xiao et al., 2016; Huffstater et al., 2020). Por lo tanto, la señalización de Wnt/ -catenina es un arma de doble filo en la lesión renal y amerita una mejor comprensión. En particular, sigue siendo esquivo sobre el papel de la inactivación de Wnt/ -catenina en la prevención de la LRA y su posterior progresión de la LRA-ERC.
La lesión por isquemia-reperfusión renal (RII) se considera la principal causa de LRA. Por lo tanto, el modelo animal de IRI renal se ha utilizado comúnmente para la investigación de la progresión de AKI y AKI-CKD (Bonventre y Yang, 2011). Se han utilizado enfoques tanto farmacológicos como genéticos para dilucidar el papel de la activación de Wnt/-catenina en modelos IRI de AKI y CKD, respectivamente. Los inhibidores de litio y GSK-3 se utilizan comúnmente para activar farmacológicamente la señalización de Wnt/ -catenina en modelos preclínicos de LRA, pero se debe tener en cuenta sus efectos independientes de la -catenina (Bao et al., 2014). Modificaciones genéticas de GSK{{9 }} , -catenina o ligandos Wnt (Wnt1 y Wnt9a) se han utilizado para dilucidar el papel de la activación de Wnt/ -catenina en la LRA y la ERC (Bonventre y Yang, 2011; Bao et al., 2014; Zhou et al., 2013, 2018; Liue et al., 2020). No obstante, los estudios sobre el papel de la señalización de Wnt/ -catenina en la prevención de la LRA son bastante limitados. El presente estudio tuvo como objetivo dilucidar el papel de la señalización de Wnt/-catenina en la prevención de AKI y su posterior progresión a ERC.
FIGURA 1|La expresión in vivo de Wnt1 exógeno antes de la RI previene la LRA y activa la -catenina renal en ratones
(A)Grupos de tratamiento de ratones. Los ratones se trataron con plásmido pcDNA3 (IRI más pcDNA3) o PHA-Wnt1 (IRI más PHA-Wnt1) mediante inyección hidrodinámica en la vena de la cola 2 días antes de BIRI. Niveles de creatinina sérica(B)y niveles de nitrógeno ureico en sangre (BUN)(C) se midieron. (D) Micrografías representativas de la morfología renal 1 día después de BIRI. Las secciones de riñón se sometieron a tinción con ácido peryódico de Schiff. Las áreas encuadradas se amplían. Las flechas indican los túbulos renales. Barra de escala, 200 µm.(E, F)Análisis de transferencia Western de -catenina activa en riñones de ratones. *P < 0.05="" frente="" a="" los="" controles="" sham="" (n="5)." †p="">< 0,05="" frente="" a="" iri="" inyectado="" con="" plásmido="" pcdna3="" (n="">
Cistanche mejora la función renal
MATERIALES Y MÉTODOS
Estudio de animales
Se compraron ratones macho C57BL/6 que pesaban aproximadamente entre 22 y 25 g de Vital River Laboratory Animal Technology (Beijing, China) y se mantuvieron en las instalaciones para animales (temperatura: 22 ± 2 °C, humedad: 60 ± 5 %, 12 horas de oscuridad/ciclo de luz). ) en Southern Medical University (Guangzhou, China) con agua y comida ad libitum. Los estudios con animales fueron aprobados por el Comité de Ética y Bienestar Animal de la Southern Medical University. Todos los animales fueron tratados de acuerdo con la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio.
La inducción de AKI y CKD en ratones se describió en nuestros estudios previos (Xiao et al., 2016; Zhou et al., 2018). La lesión por isquemia/reperfusión renal bilateral (BIRI) se ha utilizado ampliamente para inducir LRA en ratones, mientras que aumenta la mortalidad durante la progresión de LRA a ERC. Por lo tanto, la lesión por isquemia/reperfusión renal unilateral (IURI, por sus siglas en inglés) se utiliza para la investigación sobre la progresión de la LRA a la ERC. Brevemente, se realizó una incisión abdominal en la línea media del ratón bajo anestesia general, y se recortaron los pedículos renales bilaterales o izquierdos durante 30 min utilizando pinzas para microaneurismas (artículo n.º 18051-35; Fine ScienceTools, Cambridge, Reino Unido). Durante la cirugía, la temperatura corporal se mantuvo entre 37 y 38 ◦C aproximadamente mediante un sistema de calefacción de temperatura controlada.
Para evaluar el efecto preventivo de la activación de Wnt/-catenina en AKI, a los ratones se les inyectó 1 mg/kg de vector de expresión de Wnt1 marcado con hemaglutinina (HA) (PHA-Wnt1, UpstateBiotechnology) o vector vacío (pcDNA3) 2 días antes de BIRI usando el método hidrodinámico- basada en la técnica de transferencia de genes como se informó anteriormente (Xiao et al., 2016). Se recogieron sangre y tejidos renales 1 día después de la BIRI renal.
Para evaluar el efecto de la activación temprana de Wnt/-catenina en la progresión de LRA a ERC, los ratones se sometieron a una inyección hidrodinámica diaria en la vena de la cola de plásmidos de expresión Wnt1 a 1 mg/kg o a una inyección intraperitoneal diaria de ICG-001({{4 }}, Chembest, Shanghái, China) a 5 mg/kg durante 3 días antes de la IURI. Se recogieron sangre y tejidos renales 11 días después de la UIRI. En nuestro estudio preliminar, 2 días de inyección de Wnt1 podrían inducir la expresión de Wnt1 en ratones AKI (datos no mostrados). Cabe señalar que se eligieron 3 días de inyección de Wnt1 para asegurar y alargar la expresión de Wnt1 durante la progresión de AKI a CKD.
La lesión renal aguda (IRA) es una condición clínica debida a una pérdida rápida de la función renal
Cultivo celular y tratamiento
La línea celular epitelial tubular proximal humana (HKC-8) fue proporcionada por el Dr. L. Racusen en la Universidad Johns Hopkins (Baltimore, MD, Estados Unidos). Los cultivos celulares se realizaron como se describió anteriormente (Zhou et al., 2013). Las células HKC-8 se trataron con Wnt1 recombinante humano (SRP4754; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Estados Unidos) a 100 ng/mL o ICG-001 (847591-62-2, Chembest, Shanghai , China) a 10 µM durante 4 h. A continuación, las células se incubaron en una estación de trabajo de hipoxia (X3-CK, Biospherix) al 1 por ciento de pO2 durante 48 h. A continuación, las células se reoxigenaron durante 2 h antes de la recolección para varios análisis.
FIGURA 2|La expresión in vivo de Wnt1 exógeno antes de IR reduce la apoptosis de las células tubulares y la activación de NF-κB en ratones AKI
(A) Las micrografías representativas muestran células positivas para TUNEL en diferentes grupos, como se indica. Las flechas indican tinción positiva. Barra de escala, 100 µm.(B)La presentación gráfica muestra las células TUNEL-positivas por campo de alta potencia (HPF) en diferentes grupos como se indica.(C–F)Los análisis de transferencia Western representativos muestran la expresión renal de FasL, p53 y Bax en diferentes grupos como se indica. *P < 0.05="" frente="" a="" controles="" sham;="" †p="">< 0,05="" frente="" a="" iri="" inyectado="" con="" plásmidos="" pcdna="" (n="">(G) Western blot representativo de proteínas p65 yp-p65 en diferentes grupos como se indica.
Ensayo de apoptosis
Las células se tripsinizaron, recogieron y lavaron con PBS.PE La tinción con anexina V se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante. El análisis citométrico se realizó con un citómetro de flujo (BD FACSCanto II, San José, CA, Estados Unidos) para medir las tasas de apoptosis mediante la detección de la cantidad relativa de células PE Anexina V positivas y 7-AAD negativas. Cada ensayo se realizó por triplicado.
Ensayo de creatinina y nitrógeno ureico en sangre
Los niveles de creatinina en suero y orina, así como los niveles de ureanitrógeno en sangre (BUN) se midieron utilizando un analizador bioquímico automático (AU480, Beckman-Coulter Inc., Brea, CA, Estados Unidos).
Histología y tinción inmunohistoquímica
Se realizaron cortes de riñón y tinción inmunohistoquímica como se describió previamente (Liu et al., 2020). Los anticuerpos primarios incluyeron anti-Wnt1 policlonal de conejo (ab15251; Abcam, Inc.), anti- -catenina policlonal de conejo (ab15180; Abcam, Inc. .), y antifibronectina policlonal de conejo (F3648; Sigma-Aldrich).
Análisis de Western Blot
El análisis de transferencia Western se realizó como se describió anteriormente (Zhou et al., 2019). Los anticuerpos primarios incluyeron antifibronectina policlonal de conejo (F3648; Sigma-Aldrich), anticuerpo monoclonal de ratón anti- -catenina (610154; BD TransductionLaboratories), anticuerpo monoclonal de ratón anti- -SMA (A2547; Sigma-Aldrich), anticuerpo de conejo policlonal anti-Wnt1 (ab15251; Abcam), anti- -tubulina de ratón (T9026; Sigma-Aldrich), anticuerpo anti PAI-1 de ratón (AF3828;R&D Systems), catenina antiactiva (#05 –665; EMD Millipore), ligando anti-Fas (FasL) (SC -6237;Santa Cruz, CA, Estados Unidos), p53 (#2524S; CST), Bax (SC 20067; Santa Cruz), p65 ( #8242S; CST), p-p65 (#3033S; CST), PCNA (#2586S; CST).
Extracción de ARN y análisis qPCR
El aislamiento de ARN total y qPCR se llevaron a cabo como se describió anteriormente. Los niveles de ARNm de varios genes se normalizaron con -actina. Las secuencias de los cebadores de los genes se enumeran en la Tabla complementaria 1.
FIGURA 3|La expresión in vivo de Wnt1 exógeno antes de la IR previene la progresión de AKI a CKD en ratones
(A)Grupos de tratamiento de ratones. Los ratones se sometieron a una inyección hidrodinámica en la vena de la cola de 1 mg/kg de plásmido pcDNA3 (IRI más pcDNA3) o PHA-Wnt1 (IRI más PHA-Wnt1), o una inyección intraperitoneal de 5 mg/kg de ICG-001 3 días antes de la UIRI. . Se recogieron sangre y tejidos 11 días después de la UIRI. Niveles de creatinina sérica(B) y niveles de nitrógeno ureico en sangre (BUN)(C) se midieron.(D) Micrografías representativas de la morfología renal 11 días después de la IURI. Las secciones de riñón se sometieron a tinción con ácido peryódico de Schiff. Las áreas encuadradas se agrandan. Las flechas indican los túbulos renales. Barra de escala, 100 µm. *P < 0,05;="" **="" p="">< 0,01.="" norte="">
Análisis estadístico
Todos los datos se expresaron como media ± SEM. Los datos fueron analizados estadísticamente utilizando el software Sigma Stat (Jandel ScientificSoftware, San Rafael, CA, Estados Unidos). La comparación entre los grupos se realizó mediante ANOVA de una vía, seguido de la prueba de Student-Newman-Keuls. P < 0.05="" fue="" considerado="">
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RESULTADOS
La expresión in vivo de Wnt1 exógena antes de la IR previene la lesión renal aguda y activa la catenina renal en ratones
Para determinar el papel de la activación de Wnt/-catenina en la prevención de AKI, a los ratones se les administró un vector de expresión Wnt1 etiquetado con HA (PHA-Wnt1) o un vector vacío (pcDNA3) a través de una inyección hidrodinámica en la vena de la cola 2 días antes de la BIRI.(Figura 1A). Los niveles séricos de creatinina y BUN, dos biomarcadores de daño renal, aumentaron significativamente en ratones 1 día después de BIRI, lo que sugiere la existencia de AKI (Figuras 1B, C). observado en ratones AKI(Figura 1D). En particular, estas alteraciones en los biomarcadores de lesión renal sérica y las lesiones morfológicas en ratones AKI fueron atenuadas notablemente por Wnt1 exógeno. Los análisis de transferencia Western revelaron que Wnt1 exógeno promovió la expresión de -catenina renal en ratones AKI(Figuras 1E, F). En conjunto, estos hallazgos sugieren que el pretratamiento de Wnt1 exógeno activa la -catenina renal y previene la LRA en ratones.
La expresión in vivo de Wnt1 exógeno antes de IR reduce la apoptosis de células tubulares e inhibe la activación de NuclearFactor-Kappa B
Para explorar si la regulación de la apoptosis es el mecanismo subyacente al efecto protector de Wnt1 exógeno en AKI, se realizó la tinción de TUNEL para identificar la apoptosis en tejido renal de ratones AKI. En comparación con los ratones Sham, IRI aumentó notablemente la tasa de apoptosis, así como los niveles de proteínas relacionadas con la apoptosis, como FasL, p53 y Bax, en riñones de ratones.(Figuras 2A–F). Tales alteraciones en los riñones de los ratones AKI se redujeron notablemente por la expresión in vivo de Wnt1 exógeno antes de la IR. El factor nuclear kappa B (NF κB), en particular su forma heterodímera p65/p50, juega un papel fundamental en la regulación de la respuesta inflamatoria en los riñones de ratones AKI. El análisis de transferencia Western mostró que tanto p65 como su forma fosforilada (p-p65) aumentaron notablemente en los riñones de ratones después de la IRI, mientras que tales alteraciones fueron prevenidas por Wnt1 exógeno.(Figura 2G). Estos hallazgos sugieren que la expresión in vivo de Wnt1 exógeno antes de IR previene la apoptosis e inhibe la activación de NF-κB en los riñones de ratones AKI.
FIGURA 4|La expresión in vivo de Wnt1 exógeno antes de la IR regula a la baja Wnt1 endógeno y -catenina en riñones de ratones después de la progresión de AKI-CKD
(A)Las micrografías representativas muestran la expresión de la proteína Wnt y -catenina en diferentes grupos, como se indica. Barra de escala, 50 µm.(B–E)Análisis de transferencia Western representativos de los niveles de proteína Wnt1, -catenina y -catenina activa en diferentes grupos, como se indica.(F) expresión de ARNm de TGF- en diferentes grupos como se indica.*P < 0.05;="" **="" p="">< 0,01.="" norte="">
La expresión in vivo de Wnt1 exógena antes de que la IR prevenga la progresión de la lesión renal aguda a enfermedad renal crónica
A continuación, examinamos si la activación de Wnt/-catenina antes de la IR puede prevenir la progresión de AKI a CKD. Como se muestra enFigura 3A, los ratones se sometieron a una inyección hidrodinámica en la vena de la cola del plásmido de expresión Wnt1 (PHA-Wnt1) oa una inyección intraperitoneal de ICG-001 3 días antes de la UIRI. Tanto la creatinina sérica como los niveles de BUN aumentaron en ratones 11 días después de la IURI(Figuras 3B, C). Además, la tinción tricrómica de Masson reveló un depósito prominente de colágeno renal y lesiones fibróticas en ratones 11 días después de la IURI.(Figura 3D). Estas observaciones indican la progresión de AKI a CKD en ratones después de UIRI. En particular, las alteraciones observadas de los biomarcadores séricos de lesión renal y la fibrosis renal en ratones con ERC se previnieron casi por completo mediante el tratamiento previo con Wnt1 exógeno, pero no con ICG-001. Por lo tanto, la expresión in vivo de Wnt1 exógeno antes de la IR previene la progresión de AKI a CKD en ratones.
Expresión in vivo de Wnt1 exógeno antes de que IR regula a la baja Wnt1 endógeno y -catenina en riñones
Investigamos más a fondo el efecto de la señalización exógena de Wnt1 y Wnt/-catenina endógena en riñones de ratones con ERC. Sus niveles de proteína se redujeron en gran medida mediante el pretratamiento de Wnt1 exógeno, pero no de ICG-001. Los análisis de transferencia Western confirmaron el efecto inhibidor de Wnt1 exógeno, pero no de ICG-001, la expresión endógena de Wnt1, -catenina y -cateninina activa en los riñones de ratones con ERC (Figuras 4B-E). Las vías de señalización de Wnt/ -catenina y TGF- interfieren en la fibrosis renal. La expresión de ARNm de TGF- se indujo en riñones de ratones con ERC, y dicha inducción se vio disminuida por Wnt1 exógeno, pero no por ICG-001 (Figura 4F). Por lo tanto, el pretratamiento de Wnt1 exógeno inhibe la señalización de Wnt/-catenina renal endógena en ratones con ERC.
FIGURA 5|La expresión in vivo de Wnt1 exógeno antes de que IR regule a la baja los genes diana de Wnt/ -catenina renal en ratones después de la progresión de AKI-CKD
(A, B) Expresión de ARNm de PAI-1 y MMP-7 en diferentes grupos como se indica.(C–E)Análisis de Western blot representativos de PAI-1 y niveles de proteína Klotho.(F)Expresión del ARNm de Klotho. *P < {{0}}.05;="" **="" p="">< 0,01.="" norte="">
La expresión in vivo de Wnt1 exógeno antes de que IR regule negativamente los genes diana de Wnt/-catenina renal en ratones
En comparación con los ratones Sham, la expresión de ARNm de PAI-1y MMP-7, dos objetivos directos aguas abajo de la señalización de Wnt/-catenina, se reguló significativamente en los riñones de los ratones 11 días después de la UIRI.(Figuras 5A, B). El pretratamiento de Wnt1 exógeno, pero no de ICG-001, inhibió la expresión de ARNm de PAI-1 y MMP-7 en ratones con ERC. El análisis de transferencia Western mostró que los niveles de proteína PAI-1 aumentaron en los riñones de ratones con ERC, donde se abolieron mediante el pretratamiento de Wnt1 exógeno, pero no ICG-001(Figuras 5C, D). Klotho es un antagonista endógeno de Wnt al unirse y secuestrar ligandos de Wnt. En comparación con los ratones Sham, tanto el ARNm como los niveles de proteína de Klotho se redujeron en los riñones de los ratones 11 días después de la URI.(Figuras 5E, F). El pretratamiento de Wnt1 exógeno, pero no de ICG-001, restauró casi por completo la expresión de ARNm y proteínas de Klotho en riñones de ratones con ERC. Estos hallazgos sugieren además el efecto inhibidor de Wnt1 exógeno sobre Wnt/-catenina endógeno en los riñones de señalización de ratones con ERC.
La expresión in vivo de Wnt1 exógeno antes de la IR reduce la fibrosis renal en ratones después de la progresión de la enfermedad renal crónica con lesión renal aguda
A continuación, investigamos el efecto de la activación de Wnt/-catenina antes de la IR en los genes de la matriz renal y las lesiones fibróticas en ratones con ERC. riñones de ratones a los 11 días después de URI(Figuras 6A–D)Tales alteraciones se redujeron con el pretratamiento de Wnt1 exógeno, pero no con ICG-001. El análisis de transferencia Western mostró que los niveles de proteína de FN y -SMA aumentaron significativamente en los riñones de ratones con ERC, y dichas alteraciones se eliminaron mediante el tratamiento previo con Wnt1 exógeno, pero no con ICG-001(Figuras 6E–G). Los efectos de Wnt1 e ICG-001 exógenos sobre la expresión de la proteína FN en ratones con ERC se validaron mediante inmunotinción renal con un anticuerpo contra FN(Figura 6H). Estos hallazgos sugieren que el pretratamiento de Wnt1 exógeno previene la fibrogénesis renal en ratones con ERC inducida por IR.
FIGURA 6|La expresión in vivo de Wnt1 exógeno antes de la IR reduce la fibrosis renal en ratones después de la progresión de AKI-CKD
(A–D)Expresión de ARNm de fibronectina, colágeno I, colágeno III y -SMA.(E–G)Análisis de Western blot representativos de los niveles de proteína fibronectina y -SMA-SMA.(H)Inmunostinción de secciones de riñón con fibronectina. *P < {{0}}.05;="" **="" p="">< 0,01;="" †p="">< 0,05.="" norte="5." barra="" de="" escala,="" 50="">
La expresión in vivo de Wnt1 exógena antes de que la IR atenúe la inflamación renal después de la progresión de la enfermedad renal crónica y la lesión renal aguda
En comparación con los ratones simulados, la expresión del ARNm de los genes inflamatorios, como IL-1, IL-6 y TNF-, se reguló significativamente en los riñones de los ratones 11 días después de la URI.(Figuras 7A–C). Estas alteraciones se eliminaron casi por completo con el pretratamiento de Wnt1 exógeno, pero no con ICG-001. El análisis de transferencia Western mostró que los niveles de proteína tanto de P65 como de su forma fosforilada (p-p65) aumentaron notablemente en los riñones de los ratones a los 11 días. después de UIRI, lo que indica la activación de la señalización de NF-κB en ratones con ERC(Figuras 7D–F). En particular, el tratamiento previo con Wnt1 exógeno, pero no con ICG-001, redujo significativamente los niveles de proteína p65 y p-p65 en el riñón de ratones con ERC. Estos hallazgos indican que el tratamiento previo con Wnt1 exógeno previene las respuestas inflamatorias renales en ratones con ERC.
FIGURA 7|La expresión in vivo de Wnt1 exógeno antes de la IR atenúa la inflamación renal en ratones después de la progresión de AKI-CKD
(A–C) Expresión de ARNm de IL-1, IL-6 y TNF- en riñones de ratones. (D–F)Análisis de transferencia Western representativos de los niveles de proteína p65 y p-p65. *P < 0.05;="" **="" p="">< 0,01.="" norte="">
Wnt1 exógeno protege las células tubulares contra la apoptosis inducida por lesión por hipoxia-reoxigenación in vitro
Para precisar aún más el papel de Wnt1 en AKI, establecimos modelos de células tubulares HKC-8 de AKI usando tratamiento de hipoxia-reoxigenación (H/R). Se empleó citometría de flujo para detectar la apoptosis y reveló la elevación de la tasa de apoptosis en células HCK 8 después del tratamiento con H/R(Figuras 8A, B). Wnt1 exógeno redujo notablemente la apoptosis en células HCK-8 después del tratamiento con H/R. Los análisis de transferencia Western mostraron que el tratamiento con H/R aumentó significativamente los niveles de proteínas relacionadas con la apoptosis, como FasL, p54, Bax y Parp{{4} } en celdas HCK-8(Figuras 8C–G). Tales alteraciones fueron disminuidas por Wnt1 exógeno. Estos datos sugieren que la Wnt1 exógena protege contra la apoptosis inducida por H/R en células tubulares.
FIGURA 8|Wnt1 exógeno protege las células tubulares contra la apoptosis inducida por la lesión por hipoxia-reoxigenación (H/R) in vitro
(A)Los análisis FACS representativos muestran que Wnt1 inhibió la apoptosis celular inducida por hipoxia/reoxigenación (H/R). Las células HKC-8 se expresaron previamente con Wnt1 exógeno, seguido de incubación en condiciones hipóxicas durante 48 h y luego reoxigenación durante 2 h.(B) El gráficola presentación muestra el porcentaje de células apoptóticas en diferentes grupos como se indica. Las células positivas para anexina V marcadas con PE se contaron mediante citometría de flujo. *P < 0.05="" frente="" a="" los="" controles;="" †p="">< 0,05="" frente="" a="" h/r="" (n="">(C) Los análisis de transferencia Western representativos muestran la expresión de proteínas de FasL, p53, Bax y Parp-1 en células HKC-8.(D–G)Las presentaciones gráficas muestran las abundancias relativas de FasL, p53, Bax y Parp-1 en células HKC-8. *P < 0.05="" frente="" a="" los="" controles;="" †p="">< 0,05="" frente="" a="" h/r="" (n="">
DISCUSIÓN
Aunque la incidencia de LRA está aumentando y es el principal factor de riesgo de progresión a ERC, no existen terapias eficaces para la prevención y el tratamiento de la LRA. Una serie de situaciones, como la cirugía cardíaca, los depósitos intratubulares y la administración de fármacos nefrotóxicos, podrían conducir al desarrollo de LRA (Mas-Font et al., 2017). Esto destaca la necesidad de medidas preventivas de AKI.
Aunque numerosos estudios respaldan los efectos beneficiosos de la activación de Wnt/ -catenina en la patogenia de la LRA, sigue siendo evasivo acerca del efecto preventivo de los agonistas de Wnt/ -catenina en la LRA. Un hallazgo novedoso en el presente estudio es que la expresión in vivo de Wnt1 exógeno antes de la IR podría proteger a los ratones contra la LRA y prevenir la progresión de la LRA a la ERC. La expresión in vivo de Wnt1 exógeno 2 días antes de la IR bilateral renal fue capaz de activar la -catenina renal, lo que provocó una reducción de la apoptosis renal y la inflamación en ratones AKI (1 día después de la IR). Además, la expresión in vivo de Wnt1 exógena 3 días antes de la IR renal unilateral inhibió Wnt/-catenina endógena y previno el desarrollo de fibrosis renal en ratones CKD (11 días después de IR). Por el contrario, se demostró que la expresión in vivo de Wnt1 exógeno a los 5 días después de la IR renal induce la activación de -catenina y acelera la progresión de LRA a ERC (Xiao et al., 2016). Estos estudios sugieren que el momento de administración de los agonistas de Wnt/ -catenina es un factor importante cuando se utilizan para la prevención y el tratamiento de la LRA.
Los estudios sugieren que la activación sostenida de la señalización de Wnt/ -catenina podría impulsar la progresión de AKI a CKD. ICG 001 inhibe selectivamente la señalización de la proteína de unión Wnt/ -catenina/CREB (CBP) y actualmente se encuentra en un ensayo clínico para varios tipos de cáncer. Anteriormente demostramos que la administración de ICG-011a los 5 días después de la RI restauró la función renal e impidió la progresión de AKI a CKD, como lo demuestra la reducción de la fibrosis renal (Xiao et al., 2016). Además, la administración de ICG-001 que comenzó 3 días después de la obstrucción ureteral unilateral (UUO) pudo atenuar las lesiones fibróticas renales en modelos de UUO de ratones con ERC (Hao et al., 2011). Sin embargo, el presente estudio mostró que el tratamiento previo con ICG-001 3 días antes de la IR no tuvo efecto sobre la señalización renal de Wnt/ -catenina o la progresión de la LRA a la ERC. Esto no es sorprendente porque la señalización de Wnt/-catenina se expresa a niveles muy bajos en riñones adultos ilesos (Tanet al., 2014). No obstante, nuestros hallazgos sugieren que el momento y la duración de la administración de ICG-001 son fundamentales para determinar su resultado terapéutico.
Los mecanismos subyacentes al efecto protector de Wnt/-catenina pueden implicar la modulación de la apoptosis y las vías de supervivencia. La ablación genética de la -catenina tubular promueve la apoptosis tubular después del tratamiento con IRI o ácido fólico, mientras que la activación de Wnt/-catenina suprime las proteínas proapoptóticas (Wang et al. ,2009; Zhou et al., 2012). En el presente estudio, Wnt1 exógeno inhibió notablemente la apoptosis de las células tubulares en modelos de ratón IRI de AKI y modelos celulares de AKI inducidos por H/R. Esto sugiere que la apoptosis podría ser un mecanismo potencial subyacente al efecto preventivo de Wnt1 exógeno en AKI y AKI a la progresión de la ERC. El presente estudio también demostró un efecto inhibidor de Wnt1 exógeno sobre la activación de NF-κB tanto en AKI como en CKD, lo que indica la supresión de la respuesta inflamatoria. Sin embargo, cabe señalar que queda por determinar si la reducción de la inflamación es un efecto secundario a la protección o los mecanismos de protección mediados por Wnt1 exógeno. Se necesitan más estudios para dilucidar el mecanismo exacto para la protección contra la LRA mediada por Wnt1- exógena y la prevención de la progresión de la LRA a la ERC.
Use moduladores de Wnt/ -catenina para prevenir y tratar AKI y CKD
CONCLUSIÓN
En conclusión, el presente estudio proporciona la evidencia para respaldar el efecto preventivo de la activación de Wnt/-catenina en la LRA y la ERC relacionadas con IR, aunque se necesita más trabajo para dilucidar los mecanismos exactos por los cuales la Wnt1 exógena protege contra la LRA y la ERC. Dada la doble función de la señalización de Wnt/ -catenina en la LRA y la ERC, el presente estudio destaca la importancia del momento cuando se utilizan moduladores de Wnt/-catenina para la prevención y el tratamiento de la LRA. Se justifican estudios futuros que utilicen enfoques más farmacológicos y genéticos, así como el momento y la duración óptimos del tratamiento, para investigar el efecto de los agonistas de Wnt/-catenina en la prevención y el tratamiento de la LRA.
DE: Wnt1 exógeno previene la lesión renal aguda y su posterior progresión a enfermedad renal crónica, Xue Hong1†, Yanni Zhou2†, DedongWang3†, Fuping Lyu4, Tianjun Guan3, Youhua Liu1,5y Liang Xiang Xiao3 *
Frente. Fisiol., 08 noviembre 2021|https://doi.org/10.3389/fphys.2021.745816
