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La expresión de CD30 y OX40 es indispensable para la proliferación de células T CD4 plus mediadoras de enfermedades CD90.2 Las células CD30OX40 mostraron una disminución significativa en la proliferación (Figura 4p y q) y activación (Figura 4r y s). La proliferación de células T CD30OX40- CD4 más estimuladas con concanavalina A (Figura 6a yb) o fitohemaglutinina (datos no mostrados) se redujo igualmente en un 50 por ciento en comparación con las células T CD4 más de ratones WT, aunque esta diferencia no alcanzar significación estadística debido a algunos valores atípicos. La positividad para la caspasa3 escindida en los ganglios linfáticos fue comparable en células T CD4 más de ratones WT y CD30OX40~ sanos y nefríticos (Figura 6c). Ki-67 fue escaso en ratones T CD4 más; sin embargo, sus células sanas WT y CD30OX40-r se pronunciaron con positividad Ki-67 en los ganglios linfáticos de ratones nefríticos WT (Figura 6d). Los ganglios linfáticos de los ratones nefríticos CD30OX40-/ tenían un patrón de tinción comparable al de los ratones sanos (Figura 6d). Los ratones nefríticos CD30OX40-/- mostraron porcentajes más bajos de proliferación de Ki-67 más células de memoria central, células T efectoras y Tregs (Figura 6e) en el ganglio linfático.

Cistanche puede ayudar a tratar la enfermedad renal

El tratamiento con anticuerpos CD30LcOX40L mejora los índices NTS

El potencial terapéutico de dirigirse a CD30 y OX40 se evaluó mediante el tratamiento de ratones con anticuerpos aCD30LxOX40L, aCD30L o aOX40L comenzando 3 días antes de la inducción de NTS. Hubo una reducción en la albuminuria (Figura 7a), puntajes PAS, puntajes de media luna y cilindros tubulares (Figura 7b, c y e) en ratones tratados con anticuerpos xCD30LaOX40L en comparación con ratones tratados con isotipo (Figura 7a y b). Encontramos una disminución significativa de la puntuación de trombos intraluminales (Figura 7d) y la puntuación de lesión tubular aguda (Figura 7f) en ratones tratados de forma preventiva con anticuerpos xCD30LaOX40L en comparación con ratones tratados con isotipo, mientras que no se observó ningún efecto después de un bloqueo único de los ligandos.Riñón- Las células T CD4 plus infiltrantes y los neutrófilos (Figura 7g, hyj) se redujeron significativamente en los ratones tratados con anticuerpos aCD30LxOX40L. Sin cambios en el número deriñón- Se detectaron células T CD8 plus infiltrantes y macrófagos CD68 plus (Figura 7i yk).

Si el tratamiento con anticuerpos xCD30LxOX40L se iniciaba 3 días después de la enfermedad establecida, las puntuaciones de albuminuria y PAS glomerular tendían a disminuir, pero no se detectaban diferencias en el BUN sérico (Figura complementaria 7A-C). En este documento, la infiltración de células T renales CD4 plus y neutrófilos también disminuyó significativamente (Figura complementaria S7F). No hubo diferencias en el número total de células T CD4 más en la sangre periférica de ratones tratados con anticuerpos de control de isotipo o anticuerpos aCD30LaOX40L (Figura 7G complementaria) o en la expresión de CD44 y CD62L en células T CD4 más en los ganglios linfáticos (Figura 7G complementaria). Figura 6H). Además, se encontraron Tregs en números comparables en ambos grupos (datos no mostrados). Los marcadores Th1, Th17 y Treg en el nivel de ARNm fueron comparables en los ganglios linfáticos de ratones tratados con anticuerpos de control de isotipo o anticuerpos xCD30LaOX40L (Figura complementaria S7I). Sin embargo, cuando las células esplénicas de ratones nefríticos tratados con anticuerpos aCD30LxOX40L se reestimularon con IgG de conejo, se encontró una capacidad de proliferación significativamente reducida de células T CD4 plus en comparación con los ratones tratados con isotipo, sin que se afectara la apoptosis (Figura 7). No se detectaron diferencias en los títulos de C3 enriñóndiapositivas, y no se detectó ninguna diferencia en la IgG anti-conejo de ratón en el suero de ratones tratados con xCD30LoOX4OL a partir de 3 días después de la inducción de NTS en comparación con ratones tratados con control de isotipo (Figura complementaria S7D y E).

DISCUSIÓN

En este estudio, demostramos una contribución significativa de la señalización coestimuladora a través de los miembros de la superfamilia TNF CD30 y OX40 a CD4 más glomerulonefritis por complejos inmunes murino dependiente de células T. Mostramos que el bloqueo preventivo de los ligandos CD30 y OX40 mejora significativamente la enfermedad mediante la inducción de tolerancia periférica a través de una reducción importante de la proliferación de células T CD4 más efectoras y una migración defectuosa mediada por CCR6-de células Th17 a lariñón.

Con base en el conocimiento actual sobre la participación de CD30 y OX40 en la autoinmunidad, examinamos si estos receptores están involucrados en la patogénesis de NTS. CD30 y OX40 aumentan en las células T en el encuentro con el antígeno. La expresión tanto de CD30 como de OX40, así como de CD30L y OX40L, aumentó en las células T CD4 plus en nuestro modelo NTS, que también se había encontrado previamente en pacientes con LES.16-20 CD30 y OX40 aumentaron de manera más marcada en las células Th17 y Tregs, mientras que CD30L aumentó en Tregs y OX40L mostró una mayor expresión en ambos. Curiosamente, los ligandos CD30L y OX40L se regularon a la baja en células dendríticas, neutrófilos y monocitos durante el curso posterior de NTS. Presumimos que esta regulación a la baja ocurre de manera contraria después de una activación prolongada.

Se encontró que CD30OX40-/ratones estaban completamente protegidos de la enfermedad, mientras que el fenotipo NTS en CD30~ y OX40 era comparable a los controles WT. Ni los ratones sanos CD30OX40-/- ni los ratones knockout individuales mostraron cambios en el fenotipo de leucocitos o cambios en el número relativo de células en los órganos linfoides secundarios.

Se ha demostrado que distintas subpoblaciones de células T CD4 plus, como las células Th1 y Th17, afectan de manera crítica a los NTS a través del reclutamiento de macrófagos y neutrófilos.28,5

Figura 4| CD30OX40-/ratones muestran un defecto de tráfico de células Thelper 17 (Th17). Después de la transferencia adoptiva de células T CD4* de ratones CD90.1 de tipo salvaje (W) y ratones CD90.2 CD30OX407 en una proporción de 1:1 en ratones Rag1 (n =5 ratones), los ratones se sometieron a nefritis sérica nefrotóxica y se les dio seguimiento durante 4 días. (ac) Porcentajes de células Thelper 1 (Th1), (df) células auxiliares T 2 (Th2) y (g - Se evaluaron células iTh17 de CD90.1 WT o CD90.2 CD30OX40-/ratones en (a,b,de,g,h) bazos (c,f,i) yriñones. Expresión de receptores de quimiocinas (k) Quimiocina CXC (continuación)

Figura 5|La deficiencia de CD30OX40 no afecta la diferenciación de las células T CD4 plus. ( a ) Gráficas de puntos representativas y ( b ) proporciones de células T CD4 más con fenotipo de células T auxiliares 17 (Th17) después de la estimulación de células T CD4 * de ratones de tipo salvaje (WT) y CD30OX40 ~ 7 en condiciones de polarización Th17 ( n { {13}} ratones por grupo). (c) Gráficas de puntos representativas y (d) proporciones de células T CD4* con el fenotipo de célula auxiliar T 1 (Th1) después de la estimulación de células T CD4 más de ratones WT y CD30OX40~ en condiciones de polarización Th1 (n {{22 }} ratones por grupo). Todos los datos muestran la media ± SEM de 2 experimentos independientes. Ifn, interferón; Il, interleucina.

Demostramos que la protección contra la enfermedad depende de las células T CD4 más mediante la inducción de NTS en Rag1-/ratones reconstituidos con células T CD4 más. Números comparables de células CD4+ en los bazos de ambos grupos poco después de la transferencia de células T excluyeron la reconstitución defectuosa de las células CD30OX40--. Durante la enfermedad, el número de células T CD4 plus se redujo significativamente en los bazos de ratones Rag1- que recibieron células T CD4 plus de ratones CD30OX40~. Rag1-/ratones mostraron una enfermedad significativamente más leve después de 14 días cuando se reconstituyeron con CD30OX40~- CD4 más células T en comparación con WT CD4 más células T. Se descubrió que las células T CD30OX40-/- CD4 más (es decir, células de memoria, células T efectoras CD4 más y Tregs) tenían una capacidad proliferativa reducida tanto in vitro como in vivo en los ganglios linfáticos.

Las respuestas inmunitarias adecuadas al encontrar un antígeno requieren una rápida proliferación, diferenciación y migración de las células T. La proliferación de células T en órganos linfoides secundarios no solo se asocia con respuestas dirigidas contra un antígeno, sino que también podría favorecer la autoinmunidad cuando tiene lugar una proliferación homeostática7.riñón- Las células T infiltrantes, los macrófagos y los neutrófilos se redujeron en CD30OX40-/ratones sometidos a NTS, la celularidad total en los ganglios linfáticos se mantuvo estable. Sin embargo, la proliferación de células T en los ganglios linfáticos de los ratones nefríticos CD30OX40- se redujo al nivel de los ratones WT sanos, lo que sugiere una reducción potencial de los clones de células T patógenas mientras se mantienen las condiciones de estado estacionario. Por lo tanto, un defecto en el repertorio de células T como causa de reducciónriñónse excluyeron las células CD4 plus infiltrantes.

Aunque la señalización a través de CD30 y OX40 se ha relacionado con la diferenciación de células T,8 la pérdida de CD30 y OX40, en nuestras manos, no afectó negativamente el potencial de las células T CD4 más para diferenciarse hacia un fenotipo Th1 o Th17 en condiciones de polarización en vitro. Sin embargo,

los datos sobre el papel de OX40 para la promoción Th17 parecen ser dicotómicos.38,40

De acuerdo con nuestros datos in vitro, las células CD90.2 CD30OX40-- transferidas adoptivamente mostraron mayores porcentajes de células Th1, Th2 y Th17 en los bazos en comparación con las células CD90.1 WT. Nuestro hallazgo podría explicarse por la regulación ascendente compensatoria de la señalización de CD28 en condiciones de transferencia adoptiva e in vitro no fisiológicas, en las que CD30 y OX40 no están disponibles en las células CD4 plus. En consecuencia, se encontraron linfocitos T CD4 plus que expresan CD28 en cantidades significativamente mayores en los ganglios linfáticos de ratones nefríticos CD30OX407/- en comparación con ratones WT. Las células/CD30OX40- cotransferidas habían aumentado los porcentajes de células Th1 y Th2 enriñonesen comparación con las células WT, imitando el aumento del fenotipo Th1 y Th2 de las células CD4 CD30OX40~ en el bazo. Estos hallazgos concuerdan con el aumento de la expresión de CXCR3 en las células CD30OX40-- del bazo porque se sabe que CXCR3 media la migración de Th1 al riñón.1 CCR6 media la migración de Th17 al riñón.riñón.2 Aquí, la disminución significativa de la expresión de CCR6 en células CD30OX40-- da como resultado una migración reducida de células CD30OX40- Th17 al riñón y, finalmente, reduce la lesión tisular. Aún así, debemos tener en cuenta que los números absolutos de células T CD4 más infiltrantes en elriñónse redujeron masivamente cuando se transfirieron células CD30OX40~/-, lo que explica la protección de esos ratones incluso

Figura 7|El tratamiento preventivo con anticuerpos aCD30LoOX40L reduce el daño histológico y los índices de enfermedad en la nefritis sérica nefrotóxica (NTS). El tratamiento con anticuerpos xCD30LaOX40L se inició 3 días antes de la inducción de NTS. (a) La albuminuria se evaluó en ratones tratados con isotipo, aCD30LxOX40L, CD30L o xOX40L después de 14 días de NTS (n =5 ratones por grupo), (b) puntuación de ácido peryódico de Schiff glomerular (PAS), (c ) puntuación de media luna, (d) puntuación de trombos intraluminales capilares, (e) cilindros tubulares y (f) puntuación de lesión tubular aguda. Se evaluaron los números de (g, h) CD4 más células T, (i) CD8 más células T, (i) neutrófilos y (k) CD68 más macrófagos.() Esplenocitos de ratones nefríticos tratados con anticuerpos aCD30L y aOX40L (n { {18}} ratones por grupo) o anticuerpo de isotipo (n =4) a partir de 3 días después de que la enfermedad establecida se expuso a IgG de conejo durante 24 horas. Se dan los porcentajes de células CD4 plus apoptóticas tardías (anexina V, yoduro de propidio [PI) y células CD4* en proliferación (Ki-67). Los datos muestran (a, l) media ± SEM; (bg, ik) se indican las medianas por una línea horizontal. Los datos son representativos de 2 experimentos independientes.*P<><0.01. hpf,="" high-power="" field.="" to="" optimize="" viewing="" of="" this="" image,="" please="" see="" the="" online="" version="" of="" this="" article="" at="">riñón-internacional.org.

aunque las pocas células infiltrantes mostraron un fenotipo Th1 prominente.

Tregs limitan NTS en los ganglios linfáticos regionales de drenaje,7,30 pero también dentro delriñónen la fase prolongada de la enfermedad. Odobasic et al. postuló que OX40L mejora la función Treg en NTS. Sin embargo, los datos anteriores han demostrado además que incluso en ausencia de Tregs, la anulación combinada de las señales de CD30 y OX40 salvó a los ratones de una enfermedad autoinmune letal. En nuestras manos, no se encontraron alteraciones en los porcentajes de Tregs en ratones nefríticos CD30OX40 en comparación con ratones WT, pero las células T efectoras y de memoria, así como Tregs, proliferaron menos en ratones CD30OX40--. Por lo tanto, la tolerancia periférica, inducida por el bloqueo de la señalización de CD30 y OX40, parece ser inducida por el bloqueo de clones efectores de células T patogénicas en lugar de aumentar el número de Treg. Aún así, se necesitan más experimentos para examinar si la función Treg está influenciada en nuestro entorno.

La aplicación preventiva combinada de anticuerpos bloqueantes xCD30L y xOX40L en ratones con NTS demostró que el bloqueo de la vía coestimuladora de CD30 y OX40 reduce la excreción renal de albúmina y, lo que es más importante, los índices histopatológicos, así como la infiltración celular de células T CD4 más y neutrófilos en elriñón. Cuando se inició el bloqueo de anticuerpos combinados 3 días después del inicio de la enfermedad, los índices de enfermedad también se redujeron, aunque los efectos no fueron tan pronunciados. Los linfocitos T CD4 totales en sangre y ganglios linfáticos no difirieron en número, y las proporciones de linfocitos T efectores, linfocitos T de memoria central, linfocitos T de memoria efectores y linfocitos T vírgenes fueron comparables entre los ratones tratados y no tratados. Esto es importante para una posible aplicación clínica futura porque muestra que la respuesta inmune sistémica no se altera. Por lo tanto, el bloqueo coestimulador es una opción terapéutica atractiva en enfermedades autoinmunes mediadas por células T. Este enfoque terapéutico tiene la ventaja de bloquear selectivamente la expansión y migración de células T específicas de antígeno, lo que lleva a la tolerancia contra antígenos extraños y propios. 4-45"

El bloqueo separado de CD30L u OX40L usando anticuerpos de forma preventiva en el micrófono nefrítico no mostró una mejoría significativa, como se vio con el bloqueo doble de CD30L y OX40L. En cuanto al papel de OX40, se han encontrado resultados divergentes en modelos experimentales de nefritis. Aunque en línea con nuestros hallazgos, los anticuerpos monoclonales agonistas OX40 exacerbaron la enfermedad renal en un modelo de ratón con LES, recientemente se informó un efecto protector de OX40L en la glomerulonefritis semilunar. En analogía con los hallazgos anteriores, CD30 y OX40 parecen funcionar sinérgicamente en nuestro NTS Aún así, también la configuración experimental y la elección de modelos, como el huésped del antisuero, el momento y la cantidad de aplicación del anticuerpo, podrían contribuir a diferentes resultados.

Este estudio propone el potencial del bloqueo combinado de las vías coestimuladoras de CD30 y OX40 como una nueva estrategia terapéutica para lograr la tolerancia periférica en la autoinmunidad mediante la reducción de la hiperproliferación patógena en los órganos linfoides secundarios y la migración de células Th17 promotoras de la enfermedad. Además, es probable que el bloqueo combinado de CD30 y OX40 produzca menos infecciones potencialmente mortales que las terapias inmunosupresoras tradicionales.

DIVULGACIÓN

Todos los autores declararon no tener intereses en conflicto.

EXPRESIONES DE GRATITUD

Este trabajo fue financiado por Austrian Science Funds to PE (P27537-B26) y el Austrian National Bank OeNB (número 17212 de KE), así como los programas de doctorado MOL MED y MOLIN (W1241) de la Medical University of Graz, que cuentan con el apoyo de Austrian Science Funds. KS está financiado por una subvención de investigación iniciada por un investigador de Baxter. El resumen visual fue creado con BioRender.com.

CONTRIBUCIONES DE AUTOR

KA, AHK, PE, ARR, ALl, HY, JPL y KE diseñaron el estudio; KA, AHK, AAM, DJC, IA, CS, KAK, KS, MS y KE realizaron experimentos; KA, AHK, DJC y KE analizaron los datos; KA hizo las figuras; KA y KE redactaron y revisaron el artículo; todos los autores aprobaron la versión final del artículo.

MATERIAL COMPLEMENTARIO Archivo complementario (PDF)

Figura S1. Expresión de CD30, CD30L, OX40 y OX40L en bazo, ganglio linfático yriñones.

Figura S2. Fenotipo de leucocitos de CD30-/-, OX40-/ y CD30OX40-/- sanos

Figura S3. Tregs en ganglios linfáticos de WT y CD30OX40-/ratones. Figura S4. Pureza de las células T CD4 plus aisladas.

Figura S5. Los ratones Rag1- se reconstituyen de manera eficiente con células T CD4 más de ratones WT y CD30OX40-/-.

Figura S6. Estrategias de activación para citometría de flujo Th1 y Th17, Figura S7. El tratamiento comienza con anticuerpos xCD30LxOX40L después de que la enfermedad establecida mejora la infiltración de células renales en NTS. Métodos complementarios.

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