Los resultados del estudio alemán sobre la enfermedad renal crónica (GCKD) respaldan la asociación de la longitud relativa de los telómeros con la mortalidad en una gran cohorte de pacientes con enfermedad renal crónica moderada
Mar 12, 2022
Contacto: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Correo electrónico:audrey.hu@wecistanche.com
Federica Fazzini1, Claudia Lamina1, Julia Raschenberger & et al.
Riñón Internacional (2020) 98, 488–497; https://doi.org/10.1016/j.kint.2020.02.034
Copyright ª 2020, Sociedad Internacional de Nefrología. Publicado por Elsevier Inc. Este es un artículo de acceso abierto bajo la licencia CC BY
Se sabe que la longitud de los telómeros está inversamente asociada con el envejecimiento y se ha propuesto como marcador de enfermedades relacionadas con el envejecimiento. El desgaste de los telómeros puede acelerarse por el estrés oxidativo y la inflamación, ambos comúnmente presentes en pacientes con enfermedad renal crónica. Aquí, investigamos si la longitud relativa de los telómeros está asociada con la mortalidad en una gran cohorte de pacientes con enfermedad renal crónica en estadio G3 y A1-3 o G1-2 con proteinuria manifiesta (A3) en el momento de la inscripción. La longitud relativa de los telómeros se cuantificó en sangre periférica mediante un método de PCR cuantitativo en 4955 pacientes del estudio GCKD, una cohorte observacional prospectiva en curso. Se dispuso de un seguimiento completo de cuatro años de 4.926 pacientes en los que registramos 354 muertes. La longitud relativa de los telómeros fue un predictor fuerte e independiente de mortalidad por todas las causas. Cada disminución de 0.1 unidad de longitud relativa de los telómeros estuvo altamente asociada con un aumento del 14 % en el riesgo de muerte (razón de riesgo 1.14 [intervalo de confianza del 95 % 1.06-1.22]) en un modelo ajustado para edad, sexo, FGe basal, cociente albúmina/creatinina en orina, diabetes mellitus, enfermedad cardiovascular prevalente, colesterol LDL, colesterol HDL, tabaquismo, índice de masa corporal, presión arterial sistólica y diastólica, proteína C reactiva y albúmina sérica. Esto se tradujo en un 75 por ciento más de riesgo para aquellos en el cuartil más bajo en comparación con el más alto de la longitud relativa de los telómeros. La asociación fue impulsada principalmente por 117 muertes cardiovasculares (1.20 [1.05-1.35]) así como 67 muertes por infecciones (1.27 [1.07-1.50]). Por lo tanto, nuestros hallazgos respaldan una asociación de longitud de telómero más corta con mortalidad por todas las causas, mortalidad cardiovascular y muerte por infecciones en pacientes con enfermedad renal crónica moderada.
PALABRAS CLAVE:enfermedad renal cronica; infecciones; mortalidad; longitud relativa de los telómeros
enfermedad renal cronica(ERC) es una enfermedad compleja, y se ha estimado que su heredabilidad es del 30 al 70 por ciento.9–12 En los últimos años, los estudios de asociación del genoma han identificado muchos loci genéticos asociados con la función renal y la ERC.13–17
Sin embargo, los polimorfismos de un solo nucleótido índice en los loci identificados explican solo una pequeña parte de la heredabilidad, y es posible que falten contribuyentes genéticos adicionales. Hasta la fecha, solo unos pocos estudios pequeños han investigado la asociación entre la LT y la enfermedad renal. Algunos estudios encontraron que la LT corta se correlaciona con el deterioro de la función renal en la población general,18,19 así como en pacientes con insuficiencia cardíaca.20 Recientemente describimos una TL relativa (RTL) significativamente más corta en pacientes con ERC moderadamente grave que tienen enfermedad cardiovascular prevalente ( ECV)21, así como una asociación con la duración22 y progresión de la ERC23. Los pacientes que han alcanzado insuficiencia renal tratados con hemodiálisis se describen con una LT reducida en comparación con controles sanos24–27, y la LT reducida se asocia inversamente con la mortalidad. 28 Solo se han realizado unas pocas investigaciones en pacientes renales no dependientes de diálisis.21–23,29,30 Hasta donde sabemos, el estudio actual es el primer estudio prospectivo que investiga la asociación entre el RTL leucocitario y las causas de mortalidad en un gran Cohorte de ERC no dependiente de diálisis.
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RESULTADOS
Características basales de la población de estudio
RTL se cuantificó en sangre periférica por un método de reacción en cadena de polimerasa cuantitativa en 4955 pacientes del alemánEnfermedad Renal Crónicaestudiar. Se dispuso de un seguimiento completo de {{0} años de 4926 pacientes. Las características iniciales de estos 4926 pacientes según los cuartiles del RTL se proporcionan en la Tabla 1. El RTL varió desde un mínimo de {{10}}.40 a un máximo de 2.31 (Figura complementaria S1 ), con una media ± SD de 0.95 ±0.19 y una mediana de 0.92 (1er cuartil ¼ 0.82; 3er cuartil ¼ 1 .05). RTL se correlacionó negativamente con la edad (r ¼ –{{30}}.36, P < 0,001)="" y="" se="" correlacionó="" positivamente="" con="" la="" tasa="" de="" filtración="" glomerular="" estimada="" (tfge;="" r="" ¼="" 0,17,="" p="">< 0,001)="" y="" albúmina="" en="" orina–="" cociente="" de="" creatinina="" (r="" ¼="" 0,05,="" p="">< 0,001).="" cuando="" ajustamos="" rtl="" por="" edad="" y="" sexo,="" ya="" no="" observamos="" una="" correlación="" significativa="" con="" egfr="" y="" la="" relación="" albúmina-creatinina="" en="">
Seguimiento prospectivo y mortalidad
Se produjeron un total de 354 muertes durante una mediana de seguimiento de 4 años (1483 días). Las causas de muerte fueron ECV, incluidos infarto de miocardio, enfermedad coronaria, muerte súbita cardíaca, insuficiencia cardíaca congestiva, embolia pulmonar, enfermedad de las válvulas cardíacas y accidente cerebrovascular isquémico (117 pacientes, 33,1 por ciento), infecciones (67 pacientes, 18,9 por ciento), enfermedad cerebrovascular no isquémica. causas (9 pacientes, 2,5 por ciento), enfermedad vascular periférica (7 pacientes, 2.0 por ciento), insuficiencia renal (8 pacientes, 2,3 por ciento), varias otras causas (103 pacientes, 29,1 por ciento) y causas desconocidas ( 43 pacientes, 12,1 por ciento).
Los gráficos de incidencia acumulada muestran que la incidencia de mortalidad por todas las causas (Figura 1a) aumenta con RTL más cortos, con la incidencia más alta con el cuartil de RTL más bajo. En las curvas de función de incidencia acumulada de mortalidad cardiovascular (Figura 1b) e infecciosa (Figura 1c), la diferencia entre cuartiles fue menos pronunciada, pero el orden de los cuartiles fue el mismo.
Figura 1|Función de incidencia acumulada para (a) mortalidad por todas las causas, (b) mortalidad por enfermedad cardiovascular (ECV) y (c) muerte por infecciones, por cuartiles (Q) de longitud relativa de los telómeros (RTL). Q1 es el cuartil que incluye a los pacientes con el RTL más corto.
Los resultados de los modelos de regresión de Cox aplicando diferentes ajustes se proporcionan en la Tabla 2 y mostraron una asociación significativa entre RTL más corto y el riesgo de mortalidad por todas las causas. Evaluado continuamente, cada disminución de 0.1 unidades RTL se asoció con un aumento del 16 % en el riesgo de muerte en un modelo ajustado por edad y sexo (cociente de riesgos instantáneos [HR], 1,16; intervalo de confianza [IC] del 95 %, 1.08–1,24; P ¼ 1,7e-05). La asociación siguió siendo significativa después de un ajuste prolongado para eGFR, cociente albúmina-creatinina en orina, diabetes mellitus y enfermedad cardiovascular prevalente (modelo 2: HR, 1,16; IC del 95 %, 1,08–1,24), así como los factores de riesgo de ECV adicionales de baja densidad. colesterol de lipoproteínas, colesterol de lipoproteínas de alta densidad, tabaquismo, índice de masa corporal, presión arterial sistólica, presión arterial diastólica, proteína C reactiva y albúmina sérica al inicio (modelo 3: HR, 1,14; IC del 95 %, 1,06–1,22; P ¼ 3.5e-04). Los análisis spline P no lineales se muestran en la Figura 2 y revelaron una asociación casi lineal de RTL con la mortalidad por todas las causas. Los pacientes con el RTL más corto (primer cuartil) tenían un riesgo 75 % mayor de mortalidad por todas las causas en comparación con los del cuartil con el RTL más largo (Tabla complementaria S1, modelo completamente ajustado: HR, 1,75; IC del 95 %, 1,22–2,50 ;P=0,0024).
A continuación, analizamos qué está impulsando la asociación de RTL con la mortalidad por todas las causas (Tabla 2). Evaluamos las 2 causas específicas de muerte más frecuentes y observamos que cada disminución de 0,1 unidades RTL se asoció con un aumento del 20 por ciento en el riesgo de muerte por ECV en el modelo totalmente ajustado (HR, 1,2 0; IC del 95 por ciento, 1.05–1.35; P ¼ 0.0052). La RTL reducida también se asoció inversamente de manera significativa con la muerte por infecciones. Cada disminución de 0,1 unidades de RTL se asoció con un riesgo 1.27-veces mayor de muerte por infecciones (HR, 1,27; IC del 95 %, 1,07–1,50; P ¼ 0,0051). Al observar las estimaciones para los diversos cuartiles en la Tabla complementaria S1, se reveló que, para la muerte por infecciones, las estimaciones para cada uno de los cuartiles 1, 2 y 3 fueron igualmente elevadas en comparación con las del cuartil 4. El análisis con otras causas de muerte como así como las causas desconocidas de muerte obviamente eran demasiado heterogéneas y no revelaron ninguna asociación con RTL (datos no mostrados).
El gráfico de los residuos de Schoenfeld escalados y la prueba sobre los supuestos de riesgo proporcional no sugirieron ningún efecto variable en el tiempo para RTL en ninguno de los resultados investigados. Los HR de subdistribución para la muerte cardiovascular y por infección, informados en la Tabla complementaria S2, solo están ligeramente atenuados en comparación con los HR específicos de la causa.
We also evaluated whether the effect of RTL on the 3 different outcomes differed between men and women and for patients with and without diabetes mellitus, but we did not detect a significant interaction for these variables, or for age (all P values of interaction >0.1 en los modelos completamente ajustados). Dado que recientemente observamos una asociación en forma de U entre la duración de la ERC y RTL,22 realizamos un análisis de sensibilidad ajustando adicionalmente la duración de la ERC al inicio definida como menos de 6 meses, entre 6 meses y 5 años, y más de 5 años. Este ajuste adicional resultó en solo cambios marginales de los HR obtenidos para los 3 criterios de valoración (Tabla complementaria S3).
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DISCUSIÓN
Los resultados de este estudio mostraron una asociación significativa de RTL con la mortalidad por todas las causas en una cohorte de ERC no dependiente de diálisis. Un RTL más corto se asoció con un mayor riesgo de mortalidad independientemente de la función renal y los factores de riesgo de ECV tradicionales. Esta asociación fue impulsada por la muerte por ECV, así como por la muerte por infecciones.
Asociación con mortalidad por todas las causas
Estudios previos,5,6,31–35con pocas excepciones,36,37 han demostrado una asociación negativa entre RTL y la mortalidad por todas las causas en la población general. El estudio más grande hasta el momento (n=64.637) fue realizado por Rode et al., con un HR ajustado para la mortalidad de 1,40 para el decil con el RTL más corto frente al decil con el RTL más largo.35De acuerdo con estos resultados, nuestro estudio mostró con cada disminución de 0.1 unidades RTL un 14 % más de riesgo de mortalidad por todas las causas, lo que se traduce en un 75 % más de riesgo para quienes se encuentran en el nivel más bajo en comparación con el más alto. cuartil de RTL. Hasta donde sabemos, solo Carrero et al.28han investigado la relación entre RTL y el riesgo de mortalidad en pacientes con ERC. Estudiaron a 175 pacientes con enfermedad renal terminal tratados con hemodiálisis, de los cuales 70 fallecieron durante una mediana de 31 meses de observación. Los autores observaron que TL predijo de forma independiente la supervivencia del paciente después de un ajuste adicional por edad, sexo e inflamación. El estudio actual extiende estas observaciones al grupo mucho más grande de personas con CKD que no requieren diálisis.
Figura 2|Splines no lineales ajustados (y bandas de confianza del 95 por ciento) para la asociación entre el aumento de la longitud relativa de los telómeros (RTL) y el cociente de riesgos instantáneos (HR) de (a) mortalidad por todas las causas, (b) muerte cardiovascular y (c) muerte por infecciones . HR se da como escala logarítmica en los impuestos. Grayline: modelo de ajuste 1 (ajustado por edad y sexo). Blueline: modelo de ajuste 3 (ajustado por edad, sexo, estimado [continuación]
Asociación con mortalidad por ECV
Ningún estudio ha investigado la asociación de RTL con la mortalidad por ECV en pacientes con ERC hasta el momento, aunque esta es la principal causa de muerte en estos pacientes. Dependiendo de la etnia investigada y de los modelos de ajuste de datos, algunos estudios en la población general, pero no todos, informaron una asociación entre RTL bajo y resultados de ECV.33,38–41Un fuerte apoyo para una asociación causal provino de un estudio de aleatorización mendeliana en el que se encontró que las variantes genéticas asociadas con RTL más corto estaban asociadas con la cardiopatía isquémica.40En el presente estudio, identificamos una asociación significativa de RTL con muertes cardiovasculares, con un riesgo 20 por ciento mayor con cada disminución de RTL en 0.1 unidades, o un riesgo 75 por ciento mayor para aquellos pacientes en el cuartil con los LT más cortos en comparación con el cuartil con los TL más largos. Este hallazgo está en línea con nuestro informe anterior de una asociación con eventos cardiovasculares prevalentes en esta población de pacientes: cada disminución de RTL en 0.1 unidades se asoció significativamente con un 6 por ciento más de probabilidades de CVD prevalente en un modelo ajustado por edad, sexo, estado actual. tabaquismo, hipertensión, diabetes, colesterol de lipoproteínas de baja densidad, colesterol de alta densidad
colesterol de lipoproteínas, proteína C reactiva, eGFR e índice de masa corporal.21El seguimiento prospectivo de estos pacientes en la presente investigación reveló que especialmente el cuartil más bajo de RTL se asoció con un riesgo notablemente mayor, mientras que los otros 3 cuartiles mostraron estimaciones muy similares (Figura 1b).
Asociación con muerte por infecciones
Aunque la evidencia experimental respalda el papel de la senescencia celular y la TL corta en la respuesta inmune alterada, los estudios epidemiológicos son escasos, especialmente en pacientes con ERC. Helby et al. llevó a cabo el estudio prospectivo basado en la población más grande (n=75 309) que investigó RTL y el riesgo de hospitalización por enfermedades infecciosas y el riesgo de muerte relacionada con infecciones. Durante 7 años de seguimiento, observaron un mayor riesgo de cualquier infección en el cuartil con el RTL más corto en comparación con el cuartil con el RTL más largo.42 Estudios previos con tamaños de muestra más pequeños informaron resultados contradictorios.32,43,44Nuestros hallazgos en pacientes con ERC describen por primera vez la asociación entre RTL corto y mayor riesgo de muerte por infecciones en esta población de alto riesgo.
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Mecanismo potencial
El mecanismo biológico que subyace a la relación entre RTL y la mortalidad aún no está claro. La asociación identificada por nuestro estudio no aclara si el acortamiento de RTL está causalmente relacionado con enfermedades cardiovasculares e infecciones. Sin embargo, un estudio de asociación de todo el genoma seguido de un análisis de puntaje de riesgo genético que combinó variantes de plomo en 7 loci genéticos mostró una asociación de los alelos asociados con RTL más cortos con un mayor riesgo de enfermedad arterial coronaria. Este hallazgo proporciona un posible apoyo para un papel causal potencial de RTL en ECV.45,46Además, la senescencia celular inducida por el desgaste de los telómeros podría ser un desencadenante de la aterosclerosis y la arteriosclerosis. La acumulación de células senescentes en el vaso contribuye a la formación de placas ateroscleróticas y a las calcificaciones de los medios que dan como resultado un aumento de la rigidez arterial como característica dominante de la arteriopatía urémica.47La mayoría de los estudios han medido RTL en el ADN de leucocitos periféricos. Sin embargo, se ha demostrado una estrecha correlación entre los leucocitos y la LT del tejido de la pared aórtica.48Por lo tanto, la senescencia celular podría afectar a las células endoteliales provocando una disfunción en la pared vascular y promoviendo la adhesión de las células inmunitarias, un evento primario en la aterosclerosis. Además, los telómeros cortos activan la p53 y la autofagia en las células progenitoras cardíacas, lo que desestabiliza el equilibrio de inactividad y proliferación hacia la diferenciación y la senescencia, lo que lleva al agotamiento de las células progenitoras cardíacas.49Se ha demostrado que la disfunción de los telómeros induce una profunda represión p53-dependiente de los reguladores maestros de la biogénesis y la función mitocondrial, lo que conduce a un compromiso bioenergético debido a la alteración de la fosforilación oxidativa y la generación de trifosfato de adenosina.50,51
También hay varios vínculos entre RTL e infecciones. La pérdida de telómeros se ha observado durante la diferenciación de células T,52en infecciones virales crónicas,53y con la edad.54Además, se ha informado que la LT leucocitaria corta es un factor de riesgo en varias enfermedades relacionadas con el sistema inmunitario.55y diabetes56La TL más corta de los leucocitos provoca la senescencia celular seguida de una reducción de la capacidad proliferativa de las células inmunitarias. La TL también puede estar involucrada en la disminución de la función inmunológica relacionada con la edad relacionada con la respuesta insuficiente a las vacunas y las infecciones agudas.57–59El papel potencial de TL en las infecciones también está respaldado por un reciente estudio de asociación de todo el genoma en una población china. Dorjee y sus colegas observaron una asociación entre un alelo reductor de TL y la muerte por infección respiratoria.60El desgaste de RTL podría estar fuertemente desencadenado por la presencia de estrés oxidativo elevado, una condición común en la ERC.61 Varios estudios in vitro e in vivo mostraron que el estrés oxidativo acelera el desgaste de los telómeros.62,63De hecho, los telómeros, con su alto contenido en guanina, son muy susceptibles al daño oxidativo,64y las roturas de ADN monocatenario inducidas por el estrés oxidativo podrían ser un factor importante para el acortamiento de los telómeros durante la replicación del ADN.65
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Fortalezas y limitaciones
Las fortalezas de esta investigación incluyen el gran tamaño de muestra de una población bien definida con una mediana de seguimiento de 4 años casi sin pérdida de seguimiento, homogeneidad de la población de estudio y una evaluación centralizada de TL y medidas de resultado. La medición de RTL en especial es de suma importancia porque la estandarización entre laboratorios no es fácil de lograr y, por lo tanto, el proceso debe realizarse en el mismo laboratorio en exactamente las mismas condiciones en términos de protocolo, gen de referencia, instrumento, personal66 y ADN. procedimiento de extracción.67
Hay algunas limitaciones en este estudio. En primer lugar, se midió RTL en leucocitos periféricos. Se sabe que la tasa de progresión a la senescencia difiere entre los subconjuntos de linfocitos. 59Desafortunadamente, no había datos disponibles sobre la composición del tipo de células sanguíneas en el alemán.Enfermedad Renal Crónicaestudio y, por lo tanto, no fue posible investigar este aspecto. Sería interesante conocer el RTL de varios tipos de células renales, pero no es posible obtenerlo en un gran estudio epidemiológico ya que esto requeriría material tisular de las biopsias. La segunda limitación incluye el diseño observacional del estudio, que no permite aclarar la causalidad o el mecanismo biológico. En tercer lugar, el estudio reclutó principalmente a pacientes con ERC en estadio G3 o A3, y es posible que los hallazgos no se puedan generalizar a otros estadios de ERC. En cuarto lugar, la asociación con causas específicas de muerte podría haber estado limitada por el poder estadístico, pero aún estaba presente para las 2 causas principales de muerte específicas. Finalmente, aunque nuestros análisis se ajustaron a los factores de riesgo cardiovascular tradicionales, así como a los parámetros de la función renal, no podemos excluir la posibilidad de confusión residual por factores desconocidos o no medidos.
variables Sin embargo, fue muy interesante ver que las estimaciones de RTL ajustadas por edad y sexo para varios resultados fueron muy estables con ajustes adicionales para las otras variables, lo que indica que RTL es relativamente independiente de otras variables cuando los datos se ajustan por edad y sexo.
Conclusiones
La TL relativa corta cuantificada a partir de leucocitos de sangre periférica se asoció de forma independiente con la mortalidad por todas las causas durante los 4 años de seguimiento en pacientes con ERC moderadamente grave. Esta asociación fue impulsada por la muerte por ECV, así como por la muerte por infecciones.
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MÉTODOS
Población de estudio
El AlemánEnfermedad Renal Crónica study is an ongoing prospective multicenter observational cohort. A detailed description of the study has been published previously.68 Briefly, 5217 patients under regular care by nephrologists were enrolled. Inclusion criteria were moderately reduced kidney function defined as eGFR of 30–60 ml/min per 1.73 m2 (stage G3, A1–A3) or an eGFR >60 ml/min por 1,73 m2 en presencia de proteinuria manifiesta (estadio G1-G2, A3). Los criterios de exclusión fueron etnia no caucásica, trasplante de órgano sólido o médula ósea, malignidad activa dentro de los 24 meses anteriores a la selección, insuficiencia cardíaca en estadio IV de la New York Heart Association y asistencia legal o incapacidad para dar consentimiento. Todos los parámetros de laboratorio presentados se midieron a partir de muestras biológicas recolectadas en un laboratorio central, como se describió anteriormente.68 Personal capacitado obtuvo información sobre factores sociodemográficos, antecedentes médicos y familiares, medicamentos y calidad de vida relacionada con la salud a través de cuestionarios estandarizados. La enfermedad cardiovascular prevalente al inicio del estudio se definió como antecedentes de infarto de miocardio no mortal, injerto de derivación de la arteria coronaria, angioplastia coronaria transluminal percutánea, accidente cerebrovascular e intervenciones en las arterias carótidas (endarterectomía carotídea y/o angioplastia con balón carotídeo o implantación de stent).
Todos los participantes dieron su consentimiento informado por escrito y el estudio fue aprobado por los comités de ética de todas las instituciones participantes y registrado en el registro nacional de estudios clínicos (DRKS 00003971). Todos los métodos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices aprobadas y la Declaración de Helsinki. Los datos se recopilan y gestionan utilizando Askimed (https://www.askimed.com) como una plataforma web basada en la nube para la recopilación y gestión de formularios de informes de casos y datos de laboratorio.
Criterios de valoración clínicos durante el seguimiento prospectivo
Como se describió recientemente, 69 pacientes son seguidos anualmente por personal capacitado alternando visitas presenciales con visitas telefónicas. Durante estas visitas, los datos sobre hospitalizaciones, eventos de resultado e historial médico se actualizan como parte de una entrevista estructurada. Los informes de alta hospitalaria se recopilan de los médicos tratantes y/u hospitales. Los criterios de valoración se extraen continuamente de estos informes por un comité de criterios de valoración capacitado y supervisado compuesto por 3 médicos independientes de acuerdo con un catálogo de criterios de valoración preespecificado. La información sobre la causa de la muerte se obtiene de estos informes, así como de los certificados de defunción recopilados de las oficinas del registro civil cada vez que se informa al personal del estudio sobre la muerte de un participante del estudio.
El análisis actual incluye todos los puntos finales que ocurrieron hasta el 4-año de seguimiento. Si un paciente se perdió la visita de seguimiento de 4-años, incluimos todos los criterios de valoración hasta 4,5 años después de la visita inicial respectiva. Por lo tanto, el tiempo de censura fue el 4-año de la fecha de seguimiento o 4,5 años después de la línea de base. El resultado primario fue la mortalidad por todas las causas. Para evaluar si las asociaciones identificadas podrían atribuirse a una causa específica de muerte, la muerte por causas cardiovasculares y las enfermedades infecciosas se consideraron como resultados secundarios. El grupo de muerte por ECV incluyó infarto de miocardio, enfermedad coronaria, muerte súbita cardíaca, insuficiencia cardíaca congestiva, embolia pulmonar, enfermedad de las válvulas cardíacas y accidente cerebrovascular isquémico. También se registraron otras causas de muerte, pero estos subgrupos no fueron lo suficientemente grandes como para realizar más análisis de causas específicas.
Medición de RTL
El ADN genómico se extrajo de sangre total en un laboratorio central con el módulo I de separación magnética Chemagic (PerkinElmer chromagen Technologie GmbH, Baesweiler, Alemania). El análisis actual se basó en 4926 pacientes para quienes se disponía de mediciones de RTL en muestras de sangre de referencia y datos sobre mortalidad. RTL se midió por cuadruplicado utilizando un ensayo cuantitativo basado en la reacción en cadena de la polimerasa desarrollado por Cawthon70 y modificado como se describió anteriormente. (Qiagen, Hilden, Alemania), 10 ng de ADN, 1 mM de cebador de telómero o 250 nm de cebador del gen de limpieza 36B4. Determinamos la relación relativa entre el número de copias repetidas de telómeros (T) y el número de copias de genes de una sola copia (gen 36B4, que codifica la fosfoproteína ribosómica PO, ubicada en el cromosoma 12; S). Las relaciones T/S son proporcionales al RTL individual. La automatización de este procedimiento de alto rendimiento resultó en muy buenas medidas de control de calidad con un bajo coeficiente de variación entre ensayos de las relaciones T/S. Se utilizó un ADN comercialmente disponible incluido en todas las placas de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa para comprobar el rendimiento del ensayo durante todo el estudio. El coeficiente de variación entre ensayos de las relaciones T/S de esta muestra analizada en 112 experimentos independientes fue del 9,6 % antes de la normalización y disminuyó al 4,0 % después de la normalización (Figura complementaria S2).
análisis estadístico
Comparamos las características iniciales de los participantes (Tabla 1) utilizando la prueba de Kruskal-Wallis para variables continuas y pruebas de chi-cuadrado para variables categóricas. Se utilizaron curvas de función de incidencia acumulada para estimar la incidencia acumulada de las diferentes causas de muerte que representan el riesgo competitivo.72 Se realizaron modelos de regresión de riesgos proporcionales de Cox para evaluar las asociaciones de RTL con 3 resultados: (i) mortalidad por todas las causas, ( ii) muerte por ECV, y (iii) muerte por infecciones. Para ambos criterios de valoración específicos de la causa (ii y iii), los pacientes fueron censurados, si la muerte se produjo por cualquier otra causa. Además, las asociaciones con estos criterios de valoración específicos de la causa se examinaron mediante la regresión de supervivencia de riesgos competitivos, considerando todas las muertes por otras causas como eventos competitivos. Por lo tanto, tanto los HR de causa específica como los HR de subdivisión se notifican para las muertes por ECV o infecciones. Los modelos de riesgos proporcionales de Cox se ajustaron utilizando 3 niveles diferentes de ajuste: modelo 1 ajustado por edad y sexo; el modelo 2 se ajustó adicionalmente para la TFGe inicial, la proporción de albúmina-creatinina en orina, ECV prevalente y diabetes; el modelo 3 se ajustó aún más para los factores de riesgo de ECV tradicionales de colesterol de lipoproteínas de baja densidad, colesterol de lipoproteínas de alta densidad, índice de masa corporal, tabaquismo, presión arterial sistólica y diastólica, proteína C reactiva y albúmina. La selección de las variables ajustadas en los distintos modelos se basó en las diferencias de las características clínicas entre los cuartiles de RTL que se proporcionan en la tabla 1. En los modelos de regresión, RTL se analizó de forma continua y como predictor categórico (en cuartiles de RTL). Dado que los resultados iniciales indicaron un mayor riesgo, especialmente para valores bajos de RTL, el HR (por causa específica) también se informa para los cuartiles 1, 2 y 3 en comparación con el cuartil 4 como referencia (Tabla complementaria S1). El análisis posterior posterior se basó en la inspección visual de la P-spline para derivar la forma de la relación entre RTL y el riesgo de mortalidad. Utilizamos el coeficiente de correlación de rangos de Spearman para evaluar la asociación entre las variables del estudio. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando R 3.3.2 (https://www.r-project.org); valores p<0.05 were="" considered="" statistically="">
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