Abstracto:La quercetina se ha estudiado ampliamente por sus efectos contra la enfermedad de Alzheimer (EA) y contra el envejecimiento. Nuestros estudios previos han encontrado que la quercetina y en su forma de glucósido, la rutina, pueden modular la función del proteasoma en las células de neuroblastoma. Nuestro objetivo fue explorar los efectos de la quercetina y la rutina en la homeostasis redox intracelular del cerebro (glutatión reducido/glutatión oxidado, GSH/GSSG), su correlación con la actividad de la enzima 1 de escisión de APP en el sitio (BACE1) y la proteína precursora de amiloide (APP) expresión en ratones TgAPP transgénicos (que portan el transgén APP de mutación sueca humana, APPswe). Sobre la base de que la proteína BACE1 y el procesamiento de APP están regulados por la vía ubiquitina-proteasoma y que la suplementación con GSH protege a las neuronas de la inhibición del proteasoma, investigamos si una dieta que contiene quercetina o rutina (30 mg/kg/día, 4 semanas) disminuye varios signos tempranos de EA. Los análisis de genotipado de los animales se llevaron a cabo mediante PCR. Para determinar la homeostasis redox intracelular, se adoptaron métodos espectrofluorométricos para cuantificar los niveles de GSH y GSSG usando o-ftalaldehído, y se determinó la relación GSH/GSSG. Los niveles de TBARS se determinaron como marcador de peroxidación lipídica. Se determinaron las actividades enzimáticas de SOD, CAT, GR y GPx en la corteza y el hipocampo. La actividad de BACE1 se midió mediante un sustrato específico de secretasa conjugado con dos moléculas indicadoras (EDANS y DABCYL). Mediante RT-PCR se determinó la expresión génica de las principales enzimas antioxidantes: APP, BACE1, una disintegrina y la proteína 10 que contiene el dominio metaloproteinasa (ADAM10), caspasa-3, caspasa-6 y citocinas inflamatorias. En primer lugar, la sobreexpresión de APPswe en ratones TgAPP disminuyó la relación GSH/GSSG, aumentó los niveles de malonaldehído (MDA) y, en general, disminuyó las principales actividades de las enzimas antioxidantes en comparación con los ratones de tipo salvaje (WT). El tratamiento de ratones TgAPP con quercetina o rutina aumentó GSH/GSSG, disminuyó los niveles de MDA y favoreció la capacidad antioxidante de la enzima, particularmente con rutina. En segundo lugar, tanto la expresión de APP como la actividad de BACE1 disminuyeron con quercetina o rutina en ratones TgAPP. En cuanto a ADAM10, tendió a aumentar en ratones TgAPP con tratamiento de rutina. En cuanto a la expresión de caspasa-3, TgAPP mostró un aumento que fue opuesto con la rutina. Finalmente, tanto la quercetina como la rutina redujeron el aumento en la expresión de los marcadores inflamatorios IL-1 e IFN- en ratones TgAPP. En conjunto, estos hallazgos sugieren que, de los dos flavonoides, la rutina puede incluirse en la dieta diaria como una forma de terapia adyuvante en la EA.

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Palabras clave:quercetina; rutina; glutatión; APPswe; BACE1; enfermedad de alzheimer

1. Introducción

La disminución de la función cognitiva es un síntoma clínico fundamental de la neurodegeneración estrictamente relacionado con la edad [1]. El impacto de la nutrición en el deterioro cognitivo asociado con la edad es un tema cada vez más creciente, ya que es un factor vital que se puede modificar fácilmente. Los cambios patológicos en el cerebro observados durante el deterioro cognitivo tienen lugar mucho antes de cualquier manifestación clínica, que ocurre principalmente en la vejez. Esto proporciona un período más largo para establecer estrategias de prevención relacionadas con el deterioro cognitivo relacionado con la edad y la demencia, que es un importante problema de salud pública [2]. Durante muchos años, se ha llevado a cabo una intensa investigación sobre los compuestos de origen natural, que se encuentran en la dieta diaria, en la terapia de mejora cognitiva [3].

Una de las enfermedades neurodegenerativas más comunes relacionadas con la edad es la enfermedad de Alzheimer (EA), que se caracteriza por dos características neuropatológicas: placas de amiloide (A) y ovillos neurofibrilares. En términos de investigación en animales, los modelos animales pueden simular la fase asintomática de la EA modificando la proteína precursora A (APP), por ejemplo [4,5].

Sorprendentemente, varios fitoquímicos bioactivos derivados de plantas asociados con varios beneficios para la salud y disminución del riesgo de muchas enfermedades han sido examinados para formar complejos no covalentes con el péptido amiloide (A) [3].

Aunque numerosas medicinas tradicionales y productos dietéticos naturales han mostrado un gran progreso hacia la mitigación de la patología de la DA, somos plenamente conscientes de las limitaciones de los modelos animales de EA, ya que los efectos prometedores de esas sustancias no siempre son replicables en estudios con humanos [6]. Sin embargo, debido a la dificultad de analizar el tejido cerebral en humanos, especialmente en etapas muy tempranas de progresión, son necesarios estudios en modelos de roedores. Como resultado, estos modelos experimentales pueden apoyar el desarrollo de agentes de uso de medicamentos tradicionales y compuestos naturales seguros para retrasar la progresión de enfermedades neurodegenerativas. Por lo tanto, probar compuestos naturales, que se encuentran en las dietas diarias, para la prevención de enfermedades y la protección contra el riesgo de DA, debería ser una prioridad.

Entre estos importantes agentes dietéticos naturales se encuentra la quercetina, que es el principal flavonoide polifenólico presente en varias frutas y verduras [7]. La quercetina está presente principalmente en su forma de glucósido, es decir, rutina. Por su parte, la rutina (quercetina-3-O-rutinósido) ha mostrado efectos profundos en las diversas funciones celulares que sustentan varias condiciones patológicas, a saber, antimicrobiana, anticancerígena, antitrombótica, cardioprotectora y neuroprotectora. Estos efectos farmacológicos se asocian principalmente con las actividades antiinflamatorias y antioxidantes de la rutina. Debido a su capacidad para atravesar la barrera hematoencefálica y/o sus metabolitos, se ha demostrado que la rutina puede alterar los síntomas cognitivos y conductuales de las enfermedades neurodegenerativas [8].

Nuestros estudios previos han encontrado que tanto los flavonoides, la quercetina y la rutina, afectan varias vías de señalización y redes moleculares asociadas con la modulación de las funciones del proteasoma en las células de neuroblastoma [9]. Además, se ha demostrado que la expresión de BACE1 y el procesamiento de APP están regulados por la vía ubiquitina-proteasoma [10] y que la suplementación con glutatión reducido (GSH) protege a las neuronas de la inhibición del proteasoma [11]. El agotamiento de GSH en el cerebro es un hallazgo común en pacientes con enfermedades neurodegenerativas, como la EA, y puede causar neurodegeneración antes del inicio de la enfermedad [12]. La ubiquitinación de BACE1 y el bloqueo de la vía ubiquitina-proteosoma inhibe la degradación de BACE1 y, en consecuencia, conduce a una mayor producción de actividad enzimática de BACE1 [10].

Con base en estos hallazgos, y que los hábitos dietéticos y la suplementación pueden afectar el estado redox celular, nuestro objetivo fue explorar los efectos de una dieta que contiene quercetina o rutina en la homeostasis redox intracelular del cerebro (GSH/GSSG), su correlación con la actividad BACE1, y expresión de APP en modelos de ratones de EA (transgén de APP de proteína precursora de amiloide con mutación sueca humana, APPswe).

Finalmente, dado que existe evidencia convincente del efecto de los suplementos de flavonoides en la mejora de dominios cognitivos específicos y/o hallazgos de IRM [13], intentamos imitar, en animales, una intervención mediante la administración de una dieta saludable que contenga cantidades moderadas de un activo potencial particular. (quercetina o rutina) como estrategia eficaz para prevenir la expresión de marcadores de EA.

2. Resultados

2.1. Genotipado de ratones

La colonia de ratones TgAPP se desarrolló en nuestro laboratorio a partir de machos heterocigotos Tg2576 y hembras de tipo salvaje. Se realizó el genotipado de ratones para detectar individuos transgénicos. De todos los ratones probados, se encontró que aproximadamente el 40 por ciento eran transgénicos (TgAPP).

Los productos de PCR obtenidos se separaron mediante electroforesis en geles de agarosa al 1,5 por ciento en tampón 0.5X TBE (Tris-Borate-EDTA) a 70 V (voltaje constante) y luego se tomaron imágenes mediante tinción con GelRed (Millipore). El perfil de amplificación para ratones transgénicos y WT se muestra en la Figura 1.

2.2. glutatión

Para evaluar la homeostasis redox intracelular en neuronas en ratones TgAPP, se cuantificaron los niveles de GSH y GSSG, y se determinó la relación GSH/GSSG como marcador del poder reductor celular tanto en machos como en hembras (Figura 2).

En la evaluación del efecto del transgén sobre el sistema del glutatión, se observó una disminución del poder reductor celular (GSH/GSSG) en los ratones TgAPP con respecto a los animales WT, tanto en machos como en hembras y en ambas áreas del cerebro (Figura 2C3, H3), especialmente en el hipocampo. Tanto en los ratones WT como en los TgAPP, la relación GSH/GSSG fue significativamente menor en los machos que en las hembras (Figura 2C3, H3; p < 0.05). Mientras que en las mujeres TgAPP esta disminución es el resultado de niveles más bajos de GSH (Figura 2C1, H1), en los hombres TgAPP se atribuye principalmente a un aumento en los niveles de GSSG (Figura 2C2, H2).

Los cambios en los niveles de GSH y GSSG de los ratones TgAPP, respectivamente, tras el tratamiento con quercetina o rutina, son más prominentes en los machos que en las hembras. Parece que la quercetina tiende a aumentar los niveles de GSH (Figura 2C1, H1; p < 0.05) y la rutina a niveles más bajos de GSSG (Figura 2C2, H2; p < 0,05).

Los tratamientos con quercetina y rutina, tanto en machos como en hembras, pudieron revertir la caída en la relación GSH/GSSG en el hipocampo (Figura 2H3), donde la recuperación del poder redox fue significativa en comparación con los ratones TgAPP no tratados. En los machos, este índice alcanzó valores similares a los de los ratones WT en el hipocampo (H3). En las hembras, aunque esta relación no se eleva a la de los ratones WT, el tratamiento con quercetina y rutina la mejoró significativamente en comparación con la de los ratones TgAPP en su hipocampo (H3: quercetina, p < 0.{{ 6}}01; rutina, p < 0,05).

2.3. Sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBAR)

Los niveles de TBAR se determinaron como marcador de peroxidación lipídica. Usando curvas de calibración, los resultados se expresaron como concentración de malondialdehído (MDA) (Figura 3).

Después de la sobreexpresión de APP, se observó un aumento significativo en los niveles de MDA en comparación con los ratones WT tanto en la corteza (Figura 3C) como en el hipocampo (Figura 3H), y tanto en machos como en hembras (p < 0.001) .

En las hembras TgAPP, los tratamientos con quercetina y rutina casi restauraron los niveles de MDA al mismo nivel que los de los ratones WT (Figura 3C, H). En los machos TgAPP, tanto los tratamientos con quercetina como con rutina restablecen los niveles de MDA al mismo nivel que los de los ratones WT en la corteza (Figura 3C) y se reducen aún más en el hipocampo (Figura 3H). Tanto en ratones WT como TgAPP, no tratados y tratados con dieta de flavonoides, los niveles de MDA dependían del sexo (Figura 3C, H; p <0.05), excepto para los ratones TgAPP tratados con quercetina en el hipocampo.

2.4. Actividad enzimática y expresión de enzimas antioxidantes

Para abordar si la regulación de la actividad enzimática o la expresión génica de las principales enzimas antioxidantes, o ambas, ocurre con una dieta de quercetina o rutina, se realizó la determinación de la actividad enzimática y los niveles de ARNm.

La Figura 4 muestra las actividades enzimáticas de SOD, CAT, GR y GPx, determinadas en ratones hembra y macho, en la corteza cerebral (Figura 4a) y el hipocampo (Figura 4b).

Como consecuencia de la sobreexpresión de APP, solo se observó una disminución significativa en la actividad de CAT en ratones TgAPP en comparación con ratones WT tanto en la corteza (Figura 4a (C2); p < 0.0 5) como el hipocampo (Figura 4b(H2); p < 0,05).

El tratamiento con quercetina no produjo ninguna variación significativa en las actividades enzimáticas en comparación con los ratones TgAPP, en machos o hembras, en las áreas cerebrales estudiadas. Por el contrario, los animales tratados con rutina experimentaron un aumento en la actividad de CAT en la corteza (Figura 4a(C2)) y en la actividad de GR en el hipocampo (Figura 4b(H3)) tanto en machos como en hembras (p < 0 .05). Además, la rutina aumentó la actividad CAT del hipocampo en los machos TgAPP (Figura 4b (H2)) y la actividad GPx en las hembras (Figura 4b (H4)).

La Figura 5 muestra la expresión génica de las principales enzimas antioxidantes, SOD, CAT, GR y GPx, determinada en ratones machos y hembras, en la corteza cerebral (Figura 5a) y el hipocampo (Figura 5b).

No se observan diferencias en la expresión génica entre los ratones TgAPP y WT para las principales enzimas antioxidantes (Figura 5a,b). Los machos TgAPP tratados con rutina mostraron un aumento significativo en la expresión de CAT en el hipocampo (Figura 5b (H2)). En cuanto a la GPx del hipocampo, se observó un patrón similar al CAT, aunque el aumento no fue significativo (Figura 5b(H4)).

2.5. Procesamiento de aplicaciones: BACE1 y ADAM10

Los resultados de la actividad de la enzima BACE1 tanto en la corteza cerebral como en el hipocampo en machos y hembras se muestran en la Figura 6, expresados ​​como porcentajes de actividad con respecto a ratones TgAPP no tratados.

En la Figura 6, se encontró que la actividad de la enzima BACE1 en ratones TgAPP aumentó alrededor del 10 por ciento en comparación con los ratones WT, tanto en las áreas del cerebro bajo investigación como en ambos sexos, y se encontró que era estadísticamente significativa (p <0,05).

El aumento de actividad observado en los ratones transgénicos se redujo tanto con los tratamientos con quercetina como con rutina, tanto en la corteza como en el hipocampo. Sin embargo, todavía se pudo notar que el efecto de la rutina fue ligeramente mayor que el de la quercetina en los hombres.

Una vez conocida la actividad de BACE1, se decidió realizar el estudio de expresión génica de APP, principal característica del modelo animal transgénico, y de sus principales enzimas procesadoras: BACE1 y ADAM10. La figura 7 muestra los resultados obtenidos en ratones hembra y macho, tanto en la corteza como en el hipocampo.

En ambos sexos, se observó un aumento significativo en la expresión de APP superior al 85 por ciento con respecto a los ratones WT, lo que demuestra la sobreexpresión del gen tanto en la corteza cerebral (Figura 7C1; p < 0.05) y en el hipocampo (Figura 7H1; p < 0.05). Los tratamientos con quercetina y rutina fueron capaces de reducir esta expresión en más del 45 % (p < 0,05) tanto para ratones machos como hembras en ambas áreas del cerebro bajo investigación (Figura 7C1, H1), siendo los efectos más prominentes en el hipocampo ( Figura 7H1).

En cuanto a la expresión de la proteína BACE1, aunque se alteró la actividad de BACE1, no hubo diferencias significativas entre los ratones transgénicos y no transgénicos independientemente del sexo y el tratamiento con flavonoides examinado.

Por lo tanto, evaluamos la expresión de ADAM10 involucrada en el procesamiento no amiloidogénico de APP. Aunque los cambios en la expresión de ADAM10 en ratones TgAPP en comparación con ratones WT no fueron estadísticamente significativos, se observó una ligera disminución. Con respecto a los tratamientos con flavonoides, la rutina mostró una tendencia creciente en la expresión de ADAM10, tanto en hombres como en mujeres y en ambas áreas del cerebro (Figura 7C3, H3).

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