Abstracto:El objetivo principal del presente estudio es estimar, mediante análisis diferencial, diversas actividades biológicas del contenido de fenoles totales en extractos alcohólicos de tres variedades de palmera datilera sensibles o resistentes a Fusarium oxysporum. sp Albidinis. Aquí, se evidenciaron productos de estilbeno con capacidades antioxidantes y bioactivas en la variedad resistente Taabdount (TAAR). Además, la fracción metanólica de la variedad de palmera datilera resistente a TAAR contiene un producto significativo, determinado por LCMS/MS y 1H, 13C NMR, perteneciente a la familia de los hidroxiestilbenos, que presenta capacidades antioxidantes, inhibe la actividad tirosinasa del hongo y activa y ejerce un efecto protector sobre el daño inducido por hipoclorito en el proteasoma 20S de células envejecidas de fibroblastos dérmicos humanos. En conjunto, los presentes resultados indican que el hidroxitolueno presente en Phoenix dactylifera L. resistente debe estudiarse para comprender la forma en que el estilbeno podría ejercer la capacidad antienvejecimiento.

El glucósido de cistanche también puede aumentar la actividad de SOD en los tejidos del corazón y el hígado, y reducir significativamente el contenido de lipofuscina y MDA en cada tejido, eliminando de manera efectiva varios radicales de oxígeno reactivos (OH-, H₂O₂, etc.) y protegiendo contra el daño causado en el ADN. por radicales OH. Los glucósidos de feniletanoide de Cistanche tienen una fuerte capacidad de eliminación de radicales libres, una mayor capacidad reductora que la vitamina C, mejoran la actividad de SOD en la suspensión de esperma, reducen el contenido de MDA y tienen un cierto efecto protector sobre la función de la membrana del esperma. Los polisacáridos de cistanche pueden mejorar la actividad de SOD y GSH-Px en eritrocitos y tejidos pulmonares de ratones experimentalmente senescentes causados ​​por D-galactosa, así como reducir el contenido de MDA y colágeno en pulmón y plasma, y ​​aumentar el contenido de elastina, han un buen efecto de eliminación de DPPH, prolonga el tiempo de hipoxia en ratones senescentes, mejora la actividad de SOD en suero y retrasa la degeneración fisiológica del pulmón en ratones experimentalmente senescentes Con degeneración morfológica celular, los experimentos han demostrado que Cistanche tiene una buena capacidad antioxidante y tiene el potencial de ser un fármaco para prevenir y tratar las enfermedades del envejecimiento de la piel. Al mismo tiempo, el echinacósido en Cistanche tiene una capacidad significativa para eliminar los radicales libres DPPH y tiene la capacidad de eliminar las especies reactivas de oxígeno y prevenir la degradación del colágeno inducida por los radicales libres, y también tiene un buen efecto de reparación en el daño del anión de radicales libres de timina.

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Palabras clave:Phoenix dactylifera L.; Fusarium oxysporum. sp. Albidinis (FoA); actividades antioxidantes; actividad anti-tirosinasa; activación del proteasoma; análisis LC-MS/MS; derivados de estilbeno

1. Introducción

La palmera datilera (Phoenix dactylifera L.) es una monocotiledónea perenne de la familia Arecaceae. Este árbol es de suma importancia en la vida de las poblaciones saharauis del sur y sureste de Marruecos, tanto económica como socialmente. La enfermedad de Bayoud, provocada por el hongo del suelo Fusarium oxysporum f. sp Albidinis (FoA) [1], ha reducido significativamente el rendimiento de las palmeras datileras marroquíes en los últimos años [2]. Se estima que FoA desapareció de dos tercios del patrimonio phoenicicole marroquí, pero continúa destruyendo entre el 4,5 y el 12 por ciento de los cultivares comerciales de palmeras datileras de la más alta calidad [2]. Se han realizado muchos esfuerzos para combatir esta enfermedad y exponer algunos mecanismos de defensa de las palmeras datileras [3]. Los primeros estudios sobre los posibles mecanismos de defensa de la palmera datilera han destacado el papel de los compuestos fenólicos y la capacidad antioxidante en la tolerancia a FoA [4,5]. El análisis bioquímico de cultivares de compuestos fenólicos de raíces resistentes y sensibles fue el primer estudio bioquímico que dilucidó el beneficio de los mecanismos de defensa de la palmera datilera. De hecho, la literatura indica que los cultivares de raíces resistentes son más ricos en 5-ácido cafeoil shikímico y sus isómeros de posición que los cultivares de raíces sensibles [5]. Estos compuestos han mostrado de manera efectiva una potencial actividad antifúngica in vitro contra FoA [6].

La gran capacidad de los antioxidantes naturales para eliminar los radicales libres es lo que está impulsando su creciente popularidad en los estudios médicos y de alimentos [7–10].

Por ejemplo, las especies reactivas del oxígeno son factores agravantes en los procesos de daño y envejecimiento celular [11] y, por lo tanto, están relacionadas con muchas enfermedades. Como resultado, las moléculas antioxidantes pueden ayudar a la salud humana al prevenir enfermedades degenerativas y retrasar las consecuencias del envejecimiento [12]. En este estudio, estamos interesados ​​en la capacidad de los antioxidantes para promover la activación del proteasoma 20S y proteger contra el daño oxidativo del mismo. De hecho, el proteasoma contribuye al mantenimiento de la homeostasis celular al permitir el proceso celular de eliminación de proteínas dañadas y la destrucción controlada de proteínas de vida corta [13]. Por lo tanto, la activación del proteasoma con antioxidantes puede resultar una nueva estrategia antienvejecimiento [14]. Además, este trabajo pretende explorar el potencial del contenido fenólico de raíces resistentes a FoA como compuestos biológicos activos.

2. Materiales y métodos

2.1. Muestra de planta

El estudio se realizó para cada muestra con material de 10 cultivares adultos de palmera datilera (Phoenix dactylifera L.) cultivados en parcelas contaminadas o no contaminadas ubicadas en Palmaria Figuig, sureste de Marruecos. Las raíces principales (incluidas sus raíces que respiran aire) tienen un diámetro de 0,5 a 2 cm de variedades susceptibles, como las charas Bouffegous infectadas (BI) o las no infectadas (BNI). Además, se recolectó el cultivar resistente a FoA de Taabdount (TAAR), y las hojas de dos plantas medicinales se usaron localmente como tratamiento filactico contra FoA. Además, el romero (R, Rosmarinus officinalis) y la granada (G, Punica granatum L.) [15] también se recolectaron en la misma parcela no contaminada, por lo que se analizaron y utilizaron como control. Las muestras se tomaron durante dos períodos del año, en septiembre y finales de enero (entre 2013 y 2015), y se almacenaron herméticamente a temperatura ambiente. Como las muestras fueron adquiridas de un palmero, están debidamente certificadas (identificación y clasificación) por el Ministerio de Agricultura de Marruecos [16].

2.2. Preparación de los Extractos

Después de un extenso lavado con agua, las raíces o las hojas se secaron a la sombra y luego se trituraron en una licuadora. Para cada muestra (BI, BNI, TAAR, R y G), se agregaron 10 mL de metanol a 1 g de material seco y luego se dejó en agitación durante 4 h a temperatura ambiente. Luego, se filtraron y evaporaron a 37 ◦C mediante un rotavapor. El extracto seco se colocó en solución de metanol a una concentración final de 10 mg/mL o 50 mg/mL (luego se usó para ensayar actividades biológicas in vitro). Se realizaron tres extracciones independientes para cada muestra para los ensayos de actividad biológica.

2.3. Actividades biológicas

2.3.1. Contenido fenólico y actividades antioxidantes

El procedimiento descrito por Nacoulma et al. se aplicó para evaluar el contenido de fenoles totales y flavonoides totales de cada extracto [17], con una adaptación final de volúmenes a 200 µL para ser utilizados en un lector de microplacas. La absorbancia a 760 nm y 510 nm, respectivamente, se determinó frente a un blanco de metanol. Curvas de calibración estándar de ácido gálico (0–300 mg/L) (y=0.0083x más 0.9106, r2=0.978) y quercetina (0–100 mg/L) (y {{14 }}.0008x más 0.0597, r2=0.994), respectivamente, se utilizaron.

Utilizando el radical libre 1,1-difenil-2-picrilhidrazilo, se investigó la actividad de eliminación de antioxidantes (DPPH). Mediante una adaptación final de volúmenes a 300 µL y 275 µL, respectivamente, para emplear un lector de microplacas, se evaluó la capacidad de los extractos para disminuir el hierro (III), tal como lo describen Nacoulma et al. [17]. En comparación con un blanco de metanol, la absorbancia se midió a 517 nm y 700 nm, respectivamente. Luego, utilizando la siguiente ecuación, se estimó la actividad eliminadora de radicales libres de cada solución como un porcentaje de inhibición:

Se obtuvo una curva de calibración estándar usando ácido ascórbico ({{0}}–100 mg/L) como estándar antioxidante (y=0.0014x más 0.0875, r2=0.998).

2.3.2. Ensayo inhibidor del crecimiento de helio FoAMyc

Con una pequeña modificación, el método descrito por Neri et al. [18] se utilizó para determinar el grado en que los productos químicos puros inhibían el crecimiento del micelio de FoA. Un cultivo de FoA de 7-días tenía cinco milímetros de discos de micelio colocados en placas de Petri con medio PDA complementado con los productos químicos puros enumerados anteriormente a 50, 75 y 100 µg/mL. Las placas se incubaron durante 5 días a 28 ◦C. Se utilizó el diámetro medio de la colonia medido en dos ángulos rectos para evaluar la inhibición del crecimiento del micelio de FoA. Cada tratamiento constaba de tres pruebas con tres cepas de FoA diferentes: FoA 41818, FoA 41814 (BCCM, Bélgica) y FoA Local (Palemeraie de Figuig, Marruecos), así como un control negativo con un medio que no se había añadido.

2.3.3. Viabilidad celular y actividad del proteasoma 20S

Se usaron fibroblastos dérmicos humanos normales de un hombre de {{0}}años de edad (NHDF) (Promocell, Heidelberg, Alemania) donde las células se colocaron a una densidad de 100,{{3 }} células/ml en RPMI al 10 % suplementado con 10 % (p/v) de FBS, 1 % (p/v) de L-glutamina, 100 unidades/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina. Se mantuvieron en 96-placas de micropocillos blancas o transparentes durante 24 h a 37 ◦C en una incubadora con un ambiente humidificado de 5 por ciento de CO2. Para el ensayo de actividad del proteasoma, así como para la evaluación de los efectos protectores sobre el daño inducido por hipoclorito, las células se trataron con materiales de prueba (un compuesto puro de 5 a 50 µg/mL, control positivo a 0,5 y/o 1 µM, y extractos metanólicos de plantas de 15 a 50 µg/mL) por 24 h con un máximo de 0.3 por ciento de DMSO en la concentración final, simultáneamente, sin cambios, con respecto al control negativo. La investigación de los efectos protectores del extracto de TAAR o los compuestos puros sobre la actividad del proteasoma significó que las células de fibroblastos se sometieran posteriormente a 50 µM de OCl− durante 35 min (seleccionado como inhibidor oxidante óptimo, sin toxicidad celular, de la condición del proteasoma 20S) [19]. Las siguientes etapas experimentales se completaron con la metodología del proveedor (Proteasome-Glo Chymotrypsin-Like Cell-Based Assay, Promega Corporation, EE. UU.): Primero, un experimento de viabilidad celular simultáneo que empleó ensayos colorimétricos de cristal violeta o MTT que se llevaron a cabo en condiciones absolutamente similares se utilizó para normalizar este ensayo de bioluminiscencia de células. Se muestran las desviaciones estándar y la fluorescencia promedio en muestras por triplicado de dos pruebas separadas (n=6). Todas las mediciones y experimentos independientes (n=2) se realizaron dos veces.

2.3.4. Efecto inhibidor sobre la tirosinasa de hongos libres de células

Para investigar el efecto sobre la actividad enzimática, los materiales de prueba (antioxidantes puros o extractos metanólicos de plantas) se preincubaron con enzimas en tampón de fosfato a temperatura ambiente. En pocas palabras, se agregaron 300 mL de una solución de L-DOPA 5 mM en tampón de fosfato 50 mM (pH 6.5) con o sin materiales de prueba en varias concentraciones a un 96-microplaca de pocillos junto con 100 ml de una solución acuosa de tirosinasa de hongo (20 unidades). Durante 40 min, la mezcla de ensayo se incubó a 25 ◦C. Después de la incubación, el nivel de producción de dopacromo de la mezcla de reacción se midió espectrofotométricamente a 492 nm [20]. Se trazó una curva de calibración estándar utilizando ácido gálico (0–1000 µg/ml) (y=−0,087 × más 0,45; r2=0,97). Cada medición y experimento independiente (n=2) se llevó a cabo dos veces.

2.4. Análisis, Aislamiento y Procedimientos de Elucidación de Estructuras

La raíz molida (20 g) se extrajo con 200 mL de metanol, se agitó durante 24 h a temperatura ambiente, se filtró, se centrifugó a 10,000× g durante 15 min y luego se evaporó a 35 ◦C en un rotatorio. aparato de evaporación al vacío. El extracto crudo se diluyó con 20 mL de agua destilada, se volvió a extraer con 2 x 20 mL de acetato de etilo y luego se concentró mediante un sistema de evaporación al vacío rotatorio a 35 ◦C. El producto principal se purificó mediante HPLC preparativa utilizando una columna Waters C18 (SymmetryPrep 150 × 19 mm, tamaño de partícula de 7 µm) con las mismas condiciones de gradiente de LC utilizadas anteriormente y un caudal de 5 ml/min. El pico a TA estuvo entre 38,8 y 40,8 min, recogido entre 39,2 y 40,2 min; el volumen total recogido se liofilizó para dar 27 mg del compuesto. MS y NMR 1H y 13C luego lo identificaron.

Los análisis se realizaron con un sistema de la serie LC 1200 de resolución rápida utilizando un detector de matriz de diodos (DAD) utilizado para monitorear los espectros UV a 320 nm (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.). La separación de compuestos se realizó en una columna Beckman C18 (ULTRASPHERE 250 mm × 4,6 mm, tamaño de partícula de 5 µm) utilizando un gradiente de 47 min de acetato de amonio 10 mM/ácido fórmico al 0,2 % en agua (v/v), pH 2,9 ({{ 13}}disolvente A) y mezcla de acetonitrilo/metanol 30/70 (=disolvente B). El caudal fue de 0,8 ml/min y el disolvente B se elevó del 5 al 35 por ciento en 45 min y se volvió a equilibrar durante 2 min. En una serie con DAD, se utilizó una serie ESI-QTOF 6520 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.) para análisis de MS de alta resolución y MS en tándem dirigido (MS/MS). Los espectros se adquirieron en modos de adquisición negativos y de alta resolución (4 GHz).

Los espectros de RMN 1H y RMN 13C se registraron en un espectrómetro Bruker Avance 300 que funciona a 300 MHz. Las desintegraciones por inducción libre se procesaron con la suite MestreNova 5.3.2 NMR de MestreLab Research SL.

2.5. Análisis estadístico

Todos los experimentos independientes se realizaron por triplicado. Todos los datos se presentaron como valores medios ± SD. Usando la versión 6 del programa GraphPad Prism, los resultados se analizaron usando la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis junto con la prueba de comparación múltiple de Dunn. Los valores p 0.05 e inferiores se consideran significativos.

3. Resultados y discusión

3.1. Contenido total de fenólicos y flavonoides de extractos metanólicos

Debido a sus propiedades redox, se ha descubierto que los compuestos fenólicos de las plantas tienen una variedad de impactos biológicos, incluida la actividad antioxidante [21]. La Tabla 1 muestra el contenido fenólico total de extractos de raíz de metanol (500 µg/mL) de variedades susceptibles de ghagras Bouffegous infectadas (BI) y no infectadas (BNI) por FoA o resistentes como Taabdount (TAAR). Su concentración varió de 171 ± 14 a 253 ± 47 mg de ácido gálico eq./g. La mayor cantidad de estos compuestos se encontró en la variedad BNI, mientras que la menor concentración provino del extracto metanólico de raíz de BI. El número de flavonoides en estos mismos extractos (Cuadro 1) varió de 240 ± 25 a 406 ± 66 mg de quercetina eq./g, y, nuevamente, la mayor cantidad se atribuyó a la variedad BNI. Hay una pérdida de aproximadamente 1/3 de la cantidad total de polifenoles y flavonoides entre las variedades no infectadas (BNI) y las variedades infectadas (BI) o resistentes (TAAR) a la FoA. Por tanto, es de destacar comprobar cómo la pérdida de compuestos, descritos como críticos para la capacidad antioxidante de la planta, puede afectar a las actividades biológicas que nos interesan.

3.2. Potencial antioxidante de los extractos metanólicos

La actividad de captación de radicales DPPH es un método ampliamente utilizado para detectar la actividad antioxidante de los extractos de plantas [22]. Esta prueba determina si los químicos antioxidantes que se encuentran en los extractos son capaces de eliminar las especies de radicales estables DPPH. Los datos experimentales (Figura 1) revelan que es probable que todos los extractos metanólicos (a 100 o 500 µg/mL) tengan el efecto de eliminar los radicales libres con las actividades de eliminación de DPPH más altas observadas en las raíces TAAR (87,0 porcentaje de inhibición de DPPH). La actividad antioxidante parece no depender de la presencia de la cantidad total de compuestos polifenólicos o flavonoides. Sin embargo, la mejor actividad de los extractos metanólicos de la raíz TAAR podría deberse a que el extracto contiene más componentes donantes de hidrógeno.

El poder reductor se evalúa por la capacidad del extracto metanólico de transformar el Fe (III) en Fe (II). Esta capacidad de reducir el Fe (III) puede atribuirse al número y posición de los grupos hidroxilo presentes en los compuestos fenólicos y su capacidad para donar hidrógeno [23]. La Tabla 2 muestra las actividades reductoras de los extractos metanólicos de nuestras muestras de plantas en comparación con el ácido ascórbico como estándar. Los extractos metanólicos de raíces TAAR contienen reducciones altas (95 ± 1 mg de ácido ascórbico eq./g), mientras que el contenido más bajo se obtuvo de los extractos de raíces BNI (27 ± 2 mg de ácido ascórbico eq./g).

Se realizó un análisis de regresión para correlacionar los resultados obtenidos (coeficiente de correlación (R)). Se encontraron correlaciones lineales significativas entre el contenido total de fenoles y flavonoides (R {{0}}.849, p < 0.05) y entre el DPPH y el ensayo de poder reductor (R=0. 816, p < 0.05), pero no hubo diferencias entre el contenido de fenoles o flavonoides de los extractos metanólicos y sus actividades antioxidantes. Finalmente, todos los extractos metanólicos exhibieron actividades antioxidantes significativas contra la actividad de captación de radicales DPPH y el ensayo de poder reductor, pero estas actividades antioxidantes parecen no estar relacionadas con el contenido total de fenoles o flavonoides. Por lo tanto, estos hallazgos implican que un tipo particular de sustancia química, en lugar de la cantidad de compuestos fenólicos o flavonoides que se encuentran en nuestros diversos extractos, es probablemente el responsable de la actividad antioxidante de los extractos de plantas bajo revisión. Algunos componentes fenólicos que se describieron previamente y que son individuos altamente activos también pueden tener un impacto en la actividad antioxidante de los extractos de plantas: Independientemente de su concentración, los compuestos fenólicos que se encuentran en el vino tinto envejecido pueden exhibir varias propiedades antirradicales relacionadas con sus aspectos estructurales. 24].

La variedad resistente a TAAR FoA muestra la mayor actividad antioxidante entre las diferentes variedades de palmeras datileras. Con referencia a la literatura, el desarrollo de resistencia en estas palmeras datileras en particular puede atribuirse a un aumento en la cantidad de diferentes isómeros posicionales del ácido cafeoil shikímico [5].

3.3. Actividad de tirosinasa de hongos

La actividad de la difenolasa tirosinasa de hongo cataliza la oxidación de dos derivados de dopaquinona que conducen a la síntesis de melanina. Los resultados presentados en la Tabla 3 muestran la capacidad de los compuestos presentes en los extractos metanólicos de TAAR, BI y BNI para interferir con la hidroxilación de l-DOPA a través de la inhibición de la actividad tirosinasa de hongo. Además, estos resultados muestran que el extracto metanólico de TAAR es estadísticamente más activo que los extractos de BI (p < 0.05) y BNI (p < 0,05) sobre la actividad tirosinasa de hongos. Por lo tanto, la capacidad de los extractos de raíz de palmera datilera para inhibir la actividad de la tirosinasa parece seguir la misma tendencia que las capacidades antioxidantes.

Las tirosinasas se asocian principalmente con la pigmentación de la piel, los ojos y el cabello. De hecho, las tirosinasas son enzimas de melanogénesis involucradas en los primeros pasos de la biosíntesis de melanina, y la melanina está asociada con la protección contra la radiación ultravioleta (UV), solar o gamma, la susceptibilidad celular reducida y la resistencia de la pared celular contra las enzimas hidrolíticas [20]. Por el contrario, una sobreproducción de melanina puede desempeñar un papel en anomalías de la piel o enfermedades más graves como el cáncer (p. ej., melanoma), y un exceso de dopaquinona puede provocar enfermedades neurodegenerativas (p. ej., enfermedad de Parkinson) [20,25]. Además, se ha informado que la melanogénesis produce peróxido de hidrógeno y otras ROS, lo que expone a los melanocitos humanos a altos niveles de estrés oxidativo [26]. Varios compuestos antioxidantes naturales (fenólicos, flavonoides y otros) obtenidos de las plantas inhibieron la actividad de la tirosinasa fenolasa [27,28]. Aquí, el extracto de TAAR parece contener uno o más compuestos susceptibles de inhibir el envejecimiento de la piel y la melanogénesis.

3.4. Actividad proteasómica de extractos metanólicos de raíz de palmera datilera

Se ha informado que los niveles elevados del proteasoma 20S conducen a una mayor tolerancia al estrés oxidativo [13]. Por lo tanto, se investigó la regulación de la actividad del proteosoma por extractos de raíces de los cultivares BI, BNI y TAAR. La actividad del proteosoma 20S medida está relacionada con la actividad similar a la quimotripsina (CT-L) en células envejecidas con NHDF (ver Materiales y Métodos). Como se ilustra en la Figura 2A, las células tratadas con 50 µg/mL de extractos metanólicos durante 24 h exhibieron una activación significativa de CT-L para extractos BI y TAAR y una inhibición de BNI sin generar más del 30 por ciento de toxicidad celular. El extracto de raíz TAAR mostró una activa activación del proteosoma en comparación con la de 1 µM de ácido lipoico (Ct plus) (212 por ciento y 248 por ciento, respectivamente). El proteasoma es un complejo de proteinasa cilíndrico que contiene un núcleo de cuatro anillos apilados responsables de la eliminación del proteasoma anormalmente degradado (26S) y proteínas dañadas oxidativamente (complejo de núcleo proteolítico 20S) (Ciechanover, 1998). Como se presenta en el trabajo de Hwang [29], la disfunción del proteosoma puede contribuir al envejecimiento de la piel humana. De hecho, se ha demostrado que las células senescentes envejecidas y replicativas han disminuido la actividad del proteasoma, así como los niveles de proteína de las subunidades del proteasoma. El hecho de que tanto las proteínas celulares oxidadas como las dañadas se acumulen más a menudo en estas células sugiere que la vía de degradación de proteínas de la ubiquitina-proteasoma está implicada en los procesos intrínsecos de envejecimiento. Las Figuras 2B y C muestran la capacidad del extracto metanólico de TAAR para proteger a las células envejecidas con NHDF de la inhibición de la actividad del proteasoma 20S por el oxidante OCl-. De hecho, el oxidante OCl- inhibe en un 50 por ciento la actividad del proteasoma de las células de control (Ct), mientras que el activador del proteasoma 20S más alto (ácido lipoico a 1 µM, Ct plus) con más del 50 por ciento de actividad de inhibición no logra revertir la inhibición. de la actividad del proteosoma 20S por el OCl−, mientras que todas las demás concentraciones probadas (15, 50 y 75 µg/mL) de extracto metanólico de TAAR parecen revertir esta inhibición (0 a 19 por ciento de inhibición). Estos resultados sugieren que los extractos de raíz de TAAR podrían contener moléculas que podrían retrasar el envejecimiento de la piel no solo al aumentar la actividad del proteosoma sino también al contrarrestar los efectos inhibidores de los agentes oxidantes. Entre estas moléculas, es más probable que esté presente el ácido cafeoil shikímico, así como otros compuestos. Además, se han realizado análisis de LC-DAD-MS (MS) y NMR para identificar los compuestos principales de los extractos y se analizan en la siguiente sección.

3.5. Análisis Espectrométricos

3.5.1. Análisis LC-DAD-MS de extractos metanólicos

El estudio comparativo de las raíces de la palmera datilera no reveló diferencias cualitativas, pero, en cambio, se observaron diferencias semicuantitativas (en los cromatogramas DAD y MS) entre los cultivares (Figura 3A, D) hasta cierto punto. De hecho, los presentes resultados no permiten un vínculo entre la resistencia de las palmeras datileras a un aumento en la cantidad de diferentes isómeros posicionales del ácido cafeoil shikímico porque el cultivar resistente (TAAR) muestra la abundancia relativa más baja de estos compuestos (Figura 3C). Los tres isómeros posicionales del ácido cafeoil shikímico (m/z=335.0768 con un error de 1,2 ppm) se identificaron mediante sus espectros MS/MS (Figura S6) con un fragmento en m/z 179.0340, correspondiente a un fragmento A de ácido cafeico (C9H7O4) y un fragmento m/z 135.0443, correspondiente a la descarboxilación de ácido cafeico (C8H7O2). Sin embargo, otro compuesto que no corresponde a los ácidos cafeoil shikímicos (Figura 3C) y cuyo tiempo de retención es de 29 min con m/z=259.0607 (o 373.0543 para el aducto de TFA), parece distinguirse claramente entre diferentes cultivares. (Figura 3D). La diferencia en la acumulación de este compuesto en las raíces de cultivares sensibles y resistentes (0.135 por ciento), con una proporción de alrededor de 1:35 (de m/z=259.06, datos de MS), podría explicar el prominente efecto biológico actividades observadas para el extracto metanólico de esta raíz.

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