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Actividad antinociceptiva de estolones de salsa Cistanche, creciendo en la República de Kazajistán

Elmira B. Kartbaevaa, et al.

RESUMEN

HerbaCistanche(especie Cistanche) en la Medicina Tradicional China se utiliza para el tratamiento de varias enfermedades y síntomas, incluido el dolor. El objetivo de este estudio fue evaluar el efecto antinociceptivo del hidroetanólicoextracto deCistanchesalsa(CAMey.) Beck, Orobanchaceae, estolones en modelos animales de dolor. La composición química deHerbaCistanchefue analizado por HPLC-UV. Los ratones Swiss Webster (25–30 g, n=6) fueron pretratados por vía oral conHerbaCistanche(10, 30 o 100 mg/kg) y evaluados en la prueba de formalina y en la respuesta de lamido inducida por capsaicina o glutamato. kazajoHerba Cistanchese compone principalmente de glucósidos fenilpropanoides, de los cualesechinacósido, acteósido, ytubulósidoB son los constituyentes principales. CuandoHerbaCistanchese administró a ratones tuvo un efecto en ambas fases de la prueba de formalina (77 por ciento de actividad a 30 mg/kg para la fase 1 y 62 por ciento de actividad a 100 mg/kg para la fase 2), lo que sugiere propiedades analgésicas y antiinflamatorias. kazajoHerbaCistanchefue capaz de reducir el tiempo de lamido de los animales después de la inyección de glutamato (81 por ciento de reducción a 30 mg/kg) y capsaicina (81 por ciento de reducción a 100 mg/kg). Concluimos que los fenoles presentes en el extracto hidroetanólico de C. salsa podrían ser los responsables de su perfil farmacológico. Con el fin de obtener una materia prima de buena calidad para la Medicina Tradicional China, recomendamos que esta especie kazaja se estandarice utilizandoechinacósido y acteósidocomo marcadores.

Palabras clave:Herba Cistanche,HPLC-UV,echinacósido, acteósido, tubulósido, Estandarización

Introducción

Cistanchesalsa(CA Mey) Beck, Orobanchaceae, es una planta parásita de la República de Kazajstán, donde se utiliza como materia prima industrial (Sarsenbayev et al., 2011; Grudzinskaya y Gemedzhieva, 2012). El valor científico de esta hierba en la Medicina Tradicional China se relaciona con el tratamiento de problemas renales (que varían desde dolor hasta insuficiencia), impotencia, infertilidad femenina, leucorrea mórbida, metrorragia profusa y estreñimiento senil (Jiangsu New Medical College Dictionary of Traditional ChineseDrugs, 1977; Hierbas medicinales chinas, 1988). La composición química de los estolones de otras especies deCistancheya ha sido estudiado en detalle por científicos chinos. Se identificaron los siguientes compuestos fenólicos:echinacósido, tubulósido, acteósido, además de lignanos, iridoides y un polisacárido complejo (Yong and Tu, 2009; Zhang et al., 2003; Xie et al., 2005; Jiang et al., 2009; Suiet al., 2011; Liu et al., 2013; Zhou et al., 2014).

Shimoda et al. (2009) demostraron que esta hierba posee un efecto hipocolesterolémico mientras que Yang et al. (2013) determinaron su actividad hepatoprotectora. Nan et al. (2013) reportaron la actividad antiinflamatoria de sus extractos. Un polisacárido complejo previamente aislado de esta planta mostró efectos inmunomoduladores (Wang et al., 2009).

Aunque hay una cantidad considerable deCistancheestolones en la República de Kazajstán, no hay un uso popular para esta planta por parte de la población kazaja, aunque los vecinos en China la usan ampliamente. Debido a que actualmente existe un problema considerable en relación con la sustitución/adulteración de plantas medicinales y la creciente necesidad de estandarizar medicamentos para su uso en la Medicina Tradicional China, este estudio fue diseñado para determinar la composición química fenólica de esta materia prima vegetal que crece en el vecino Kazajistán. así como evaluar su uso como antinociceptivo para aliviar potencialmente el dolor, lo que caracteriza a uno de sus principales usos en la Medicina Tradicional China.

materiales y métodos

Material vegetal

Cistanchesalsa (CAMey.) Beck, Orobanchaceae, estolones fueron recolectados en el desierto de Moinkum, pueblo de Bakanas, en julio de 2014 en Almaty. El material vegetal fue identificado por el Dr. G. Sitpayeva del Instituto de Botánica y Fitointroducción, Ministerio de Educación y Ciencias de la República de Kazajstán, donde fue depositado con el número 01-04/306.

Análisis químico

Estolones de C. salsa (2 g) fueron sometidos a extracción por microondas. Inicialmente, el material se molió a 0.001–2.000 mm y luego se colocó en un recipiente hermético para extraerlo durante 10 min. at100–1100 ◦C con etanol al 80 por ciento (proporción 1:10). El extracto de hidroetanol (CSHE) se analizó por HPLC-MS. El extracto crudo se disolvió en metanol (9,6 mg/ml) y se filtró a través de una membrana de teflón de 0,45 mm antes del análisis. Un cromatógrafo de líquidos modelo HP 1100 Series (empresa Agilent Technologies, Inc., CA, EE. UU.), equipado con un desgasificador de vacío de flujo, una bomba de gradiente de baja presión de cuatro canales y un inyector automático. Los compuestos fenólicos se separaron cromatográficamente mediante una columna Zorbax Eclipse XDB-C18, 2,1 × 50 mm, rellena con polímero de gel de sílice de octadecilsililo (1,8). El análisis cromatográfico se llevó a cabo con un flujo de fase móvil de 0,2 ml/min, presión operativa del eluyente de 175–200 kPa, temperatura del horno de la columna de 30 ◦C, volumen de muestra de 2 ml, modo de alimentación del eluyente en gradiente: 0–36 min 10 % A – 90 % B; 36 min – 100 por ciento B (eluyente A: metanol, eluyente B: solución de ácido fórmico al 0,2 por ciento). La detección se realizó por UV a las longitudes de onda de 254, 334, 350, 410, 450 y 550 nm. Para la identificación de los compuestos químicos en el extracto se utilizó la comparación de los tiempos de retención obtenidos, los espectros UV y de masas con los de los compuestos de referencia. El análisis cuantitativo se realizó mediante el uso de estándaresverbascosideyechinacósidoanalizados en las mismas condiciones cromatográficas. Sus curvas de calibración permitieron el cálculo de la cantidad de cada uno de los glicósidos fenilpropanoides en el extracto etanólico de esta planta. El método no fue validado.

animales

En este estudio se utilizaron ratones Swiss Webster (20-25 g, dos meses de edad) (donados por el Instituto Vital Brasil, Niterói, RJ, Brasil). Los animales se mantuvieron en condiciones estándar (ciclo de luz-oscuridad de 12 h, 22 ± 2 grados y 70-80 por ciento de humedad. Comida y agua ad libitum). Los animales recibieron solo agua para evitar la interferencia de los alimentos con la absorción de sustancias 12 h antes del inicio de los experimentos. La aclimatación a las condiciones del laboratorio ocurrió por lo menos 1 h antes de cada prueba. Todos los protocolos fueron realizados de acuerdo con las Directrices sobre Normas Éticas para la Investigación del Dolor Experimental en Animales y siguieron los principios y directrices adoptados por el Consejo Nacional para el Control de la Experimentación Animal (CONCEA), aprobados por el Instituto de Ciencias Biomédicas/UFRJ, Ética Comité de Investigación Animal, y recibió el número DFBCICB015-04/16. Todos los protocolos experimentales se realizaron durante la fase de luz. El número de animales por grupo se mantuvo al mínimo y de acuerdo con las normas del CONCEA. Al final de cada experimento, los ratones fueron asesinados por sobredosis de ketamina/xilazina.

Tratos

En este estudio, CSHE se evaluó a 10, 30 y 100 mg/kg. El extracto se disolvió en dimetilsulfóxido (DMSO, FisherBiotech) para preparar una solución madre a 100 mg/ml. Se utilizó PBS como diluyente para la preparación de las diferentes dosis. Soluciones que contienen 10, 30 y 100 mg/kg del extracto de hidroetanolCistanchesalsaestaban preparados. Los fármacos estándar utilizados fueron morfina 2,5 mg/kg (Merck, diluida en tampón fosfato salino (PBS)), ácido acetilsalicílico 200 mg/kg (Sigma Aldrich, disuelta con hidróxido de sodio 5 M (NaOH) en 0,9 por ciento de solución salina) y capsazepina 10 nMolper pata. Se administró solución salina más DMSO (a la misma concentración que en el tratamiento más alto con extracto) al grupo de control negativo. Todos los tratamientos (extracto ensayado y estándares) se administraron por vía oral. La única excepción fue la capsazepina, que se administró mediante inyección intraplantar.

Dolor agudo inducido por formalina

Se inyectó una solución de formalina al 2,5 por ciento (formaldehído al 37 por ciento) (20 ul) en la región plantar de la pata trasera derecha de ratones 60 minutos después del tratamiento (extracto de hidroetanol deCistanchesalsao ácido acetilsalicílico 200 mg/kg o morfina 2,5 mg/kg) (Matheus et al., 2005). Los animales se colocaron individualmente en una cámara de vidrio transparente y se registró la duración del tiempo en segundos que dedicaron a lamerse la pata después de la inyección de formalina y se analizó en dos períodos separados, dolor neurogénico de fase temprana (0 a 5 minutos después de la inyección) y dolor de fase tardía. dolor inflamatorio (15-30 min después de la inyección).

Nocicepción inducida por capsaicina

Esta prueba se basó en el método descrito por Sakurada et al. con algunas modificaciones (Sakurada et al., 1992). Se inyectó capsaicina (20 ul) C18H27NO3 (Galena, Campinas, SP) en la región plantar de la pata trasera derecha de los ratones (1,6 ug/pata) una hora después del tratamiento (extracto hidroetanol deCistanchesalsa o capsazepina10 nMol/pata). Los animales se colocaron individualmente en una cámara de vidrio y se registró la duración de lamerse las patas entre 0 y 5 minutos después de la inyección de capsaicina y luego se analizó.

Nocicepción inducida por glutamato

En el método descrito por Beirith et al. (2002), solución de glutamato en PBS (20 ul) (ácido l-glutámico, Sigma-Aldrich, 3,7 ng/pata) se inyectó en la región plantar de la pata trasera derecha de los ratones una hora después del tratamiento (extracto de hidroetanol deCistanchesalsa o morfina 2,5 mg/kg). Los animales se colocaron individualmente en una cámara de vidrio y se registró la duración de lamer la pata (segundos) entre 0y 15 min después de la inyección de glutamato y luego se analizó.

análisis estadístico

Los datos químicos se presentan como media ± DE de cinco experimentos. Todos los grupos experimentales farmacológicos consistieron en un mínimo de seis ratones. El análisis de la varianza unidireccional (ANOVA) seguido de la prueba de Dunnett permitió la visualización de la significancia estadística entre los grupos utilizando el software GraphPad Prism 5.0. Los valores de p se consideraron significativos cuando eran inferiores a 0.05(p <>

Resultados

CistancheEl cromatograma del extracto de salsa hidroetanol (dos diluciones diferentes) se muestra en la Fig. 1. La Tabla 1 muestra la determinación de los compuestos fenólicos junto con sus respectivos tiempos de retención en el cromatograma.

Efecto de CSHE sobre el dolor agudo inducido por formalina

En la prueba de dolor agudo inducido por formalina, el CSHE a 10, 30 y 100 mg/kg fue capaz de disminuir el lamerse las patas en la primera fase de la prueba conocida como fase de dolor neurogénico, estas reducciones fueron del 60, 77 y 58 por ciento, respectivamente. . Además, también fueron eficaces en la reducción del dolor inflamatorio inducido durante la segunda fase del ensayo, el porcentaje de inhibición del dolor inflamatorio fue del 42, 46 y 62 por ciento, respectivamente (fig. 2). La morfina (2,5 mg/kg) y el ácido acetilsalicílico (200 mg/kg) presentaron los siguientes resultados: 55 por ciento/33 por ciento y 31 por ciento/54 por ciento para la primera y segunda fase, respectivamente.

Efecto de CSHE sobre la nocicepción inducida por glutamato

El CSHE redujo el lamido inducido por el glutamato en las tres dosis probadas, 10, 30 y 100 mg/kg en un 76, 81 y 53 por ciento, respectivamente (Fig. 3). La morfina al 2,5 % dio como resultado una reducción del 76 %

Efecto de CSHE sobre la nocicepción inducida por capsaicina

Para verificar si el CSHE afectaría la nocicepción a través de los receptores TRPV1, se probó en un modelo de dolor inducido por capsaicina. El efecto antinociceptivo a través de este modelo se observó para el CSHE en las tres dosis probadas, en un 76, 79 y 81 por ciento, respectivamente (Fig. 4). Capsazepine 10 nMol/pata dio como resultado una reducción del 60 por ciento.

Discusión

Se identificaron un total de diez glucósidos fenilpropanoides en el extracto de hidroetanol de C. salsa (que crece en Kazajstán).echinacósido(10,98 mg/g),acteósido(9,44 mg/g) y tubuloside B (7,94 mg/g) fueron los principales compuestos identificados. Los datos obtenidos se correlacionaron con la literatura disponible para especies deCistanchecreciendo en diferentes regiones de Asia (Zhou et al., 2014; Xieet al., 2005; Jiang et al., 2009).echinacósidoyacteósidoson los componentes principales, que forman la base para la estandarización de las especies oficialesCistanchedeserticola yCistanchetubulosa, incluida en la Farmacopea China en 2005. Proponemos que estos compuestos también podrían usarse para la estandarización deCistancheestolones de salsa de Kazajstán, ya que son los principales en el extracto de hidroetanol estudiado.

De acuerdo con los resultados farmacológicos de este estudio, es posible sugerir que el CSHE es un agente eficaz contra el dolor neurogénico y la inflamación como se observó en la prueba de formalina. A lo mejor de nuestro conocimiento,Cistanchesalsa nunca ha sido probada en relación con sus acciones antinociceptivas. Un estudio de 2002 conCistanchedeserticola (Lin et al., 2002) ha demostrado que esta planta presenta actividades antinociceptivas y antiinflamatorias cuando se ensaya en modelos como retorcimiento total, formalina y edema de la pata. Aunque no se intentó investigar los principales constituyentes de los extractos activos, se consideró que el extracto de butanol y la capa de agua eran los activos. No es sorprendente que estos solventes estén en la escala de polaridad que coincide con los glucósidos fenilpropanoides que se encuentran enCistanchesalsa Además, Lin y colaboradores establecieron que la acción antinociceptiva deCistancheextractos de deserticola no se debió a la acción del compuesto en el receptor de opiáceos ni se relacionó con el sistema inmunitario. En nuestro estudio, el extracto rico en fenilpropanoide mostró actividad en ambas fases de la prueba de formalina. La actividad observada se debió de hecho a la diana farmacológica investigada y no a una posible alteración motora como lo demuestra la prueba de la varilla rotatoria. Los resultados de la prueba de formalina indican el potencial de dolor neurogénico así como el dolor inducido por mediadores inflamatorios. Inicialmente, decidimos investigar la ruta del dolor neurogénico. Debido a que compuestos similares de otras especies previamente estudiadas no mostraron ninguna actividad de receptor de opiáceos, decidimos probar otros modelos, como los modelos de glutamato y capsaicina.

El glutamato es un neurotransmisor excitatorio que tiene un papel importante en la modulación del dolor en los sistemas nervioso central y periférico. Esta acción está mediada por receptores de glutamato ionotrópicos controlados por ligandos (iGluR) y receptores de glutamato metabotrópicos. Los iGluR se pueden dividir en N-metil-D-aspartato (NMDA) y -amino-3-hidroxi-5-metilisoxazol-4-propiónico (AMPA) (Kolber, 2015). La investigación ha demostrado que cuando se antagonizan los receptores NMDA y AMPA con ketamina y kainato, respectivamente, se observan efectos antinociceptivos. Sin embargo, los antagonistas dirigidos a estos receptores hasta ahora han inducido un efecto adverso sustancial y, por esta razón, se ha llevado a cabo una nueva investigación centrada en mGluR que sugiere que el medicamento mediado a través de este receptor causaría menos efectos secundarios (Palazzo et al., 2014). Los resultados de las pruebas del CSHE mostraron que este tratamiento fue efectivo para reducir el dolor inducido por el glutamato. Sin embargo, aún se desconoce si este efecto está mediado por receptores ionotrópicos y/o metabotrópicos. La morfina es uno de los fármacos disponibles que tienen un efecto sobre la transmisión glutamatérgica (Deyama et al., 2007). Se informa en la literatura que la activación del receptor de glutamato aumenta las respuestas TRPV1 (Szteyn et al., 2015). Por esa razón, es posible que el efecto observado para CSHE se deba a la actividad sobre TRPV1 y no necesariamente a través de una respuesta directa sobre los receptores de glutamato.

El siguiente paso de esta investigación fue realizar una prueba de lamerse las patas utilizando como agente algésico la capsaicina, que es un agonista del receptor TRPV1. Los resultados mostraron que, de hecho, CSHE disminuyó el dolor a través del receptor TRPV1.

En el caso de CSHE, en casi todas las metodologías probadas, pudimos observar que la dosis de 30 mg/kg logró mejores resultados que la de 100 mg/kg. Esto puede ser debido a la saturación de la solución que conduce a compuestos precipitados y efectivamente menos cantidad de fármacos biodisponibles.

Confirmar la composición química establecida para el extracto kazajo CSHE fue un paso importante porque ya se han confirmado de alguna manera las acciones antinociceptivas/antiinflamatorias de los principales constituyentes presentes en él. Por ejemplo,echinacósidose estableció como uno de los principios activos responsables de la acción antinociceptiva de la Equinácea (Hostettmann, 2003). Además, un estudio previo de Schapoval y colaboradores (Schapoval et al., 1998) señalóacteósidocomo uno de los principales principios activos en un extracto etanólico preparado con Stachytarpheta cayennensis evaluado por edema de la pata y modelos de placas calientes. Backhouse y compañeros de trabajo (Backhouse et al., 2008) también consideraronacteósidoser el principio activo de Buddleja globosausando varios modelos de evaluación del dolor, incluida la prueba de formalina. Ahora se están desarrollando nuevas formulaciones utilizando el conocimiento más avanzado para aumentar la estabilidad y prolongar la acción antinociceptiva deacteósido(Isacchi et al., 2016).

Conclusión

Se identificaron diez sustancias de naturaleza fenólica en los estolones del kazajoCistanchesalsa por análisis HPLC/MS. Estos compuestos podrían ser los responsables de la actividad antinociceptiva observada en los modelos experimentales realizados en este documento. Teniendo en cuenta que en el territorio de Kazajstán el géneroCistancheestá representada principalmente por especiesCistanchesalsa, podemos recomendar su recolección y estandarización utilizandoechinacósidoyacteósidocomo compuestos estándar, para obtener una materia prima de buena calidad para la Medicina Tradicional China.

Divulgaciones éticas

Protección de sujetos humanos y animales. Los autores declaran que los procedimientos seguidos estuvieron de acuerdo con las normas del comité de ética de investigación clínica correspondiente y con las del Código de Ética de la Asociación Médica Mundial (Declaración de Helsinki).

Confidencialidad de los datos.

Los autores declaran que en este artículo no aparecen datos de pacientes.

Derecho a la privacidad y consentimiento informado. Los autores declaran que en este artículo no aparecen datos de pacientes.

Contribuciones de los autores

EBK ejecutó la recolección de la planta, preparación del extracto y análisis de los resultados químicos así como la redacción del artículo; GRD, ejecutó todas las pruebas farmacológicas; ZBS, diseñó el estudio en conjunto con FB; LNI y ENB, participaron en el diseño farmacopeico del estudio para la inclusión de los resultados obtenidos en la farmacopea kazaja; IIT, ejecutó los análisis de HPLC; PDF, diseñó el estudio farmacológico y FB, organizó el equipo para escribir este artículo.

Conflictos de interés

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

Los autores de Brasil agradecen al Sr. Alan Minho por la asistencia técnica y al Instituto Vital Brasil por las donaciones de animales utilizados. También quieren reconocer las becas del CNPq y de la Fundac¸ ão Carlos Chagas Filho de Apoio à Pesquisa do Estadodo Rio de Janeiro. Los autores de Irlanda desean reconocer el apoyo financiero del Ciclo 5 del Programa de Investigación en Instituciones de Tercer Nivel de la Autoridad de Educación Superior para TBSI y reforzar la importancia del programa SFI ISCA-Brasil (grantno. SFI/13/ISCA/2843) que contribuyó a la trabajo colaborativo entre Brasil e Irlanda. Los autores de Kazajstán quieren agradecer a KazNMU por el apoyo financiero permitido para la ejecución de este trabajo.

De: 'Actividad antinociceptiva de los estolones de salsa Cistanche, creciendo en la República de Kazajstán' por Elmira B. Kartbaevaa, et al

---EB Kartbaeva et al. / Revista Brasileira de Farmacognosia 27 (2017) 587–591

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