Bioensayo para monitorear el efecto antienvejecimiento del tratamiento con sangre del cordón umbilical

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Sang-Hun Bae1*, Ala Jo1,2*, Jae Hyun Park1, Chul-Woo Lim1, Yuri Choi1, Juhyun Oh2, Ji-Min Park1, TaeHo Kong1, Ralph Weissleder2,3, Hakho Lee2, Jisook Moon1

1. Departamento de Biotecnología, Facultad de Ciencias de la Vida, Universidad CHA, Gyeonggi-do 13488, República de Corea

2. Centro de Biología de Sistemas, Hospital General de Massachusetts, Facultad de Medicina de Harvard, Boston, MA 02114, EE. UU.

3. Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina de Harvard, Boston, MA 02115, EE. UU. *Estos autores contribuyeron por igual.

Autor para correspondencia: Hakho Lee, PhD. Centro de Biología de Sistemas, Hospital General de Massachusetts, 185 Cambridge St, CPZN 5206, Boston, MA 02114, EE. UU. 617-726-8226 hlee@mgh.harvard.edu Jisook Moon, PhD. Departamento de Biotecnología, Facultad de Ciencias de la Vida, Universidad CHA, Pangyo-ro 335, Bundang-gu, Seongnam-si, Gyeonggi-do 13488, República de Corea. 82-31-881-7210 jmoon@cha.ac.kr

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Recibido: 2018.10.04; Aceptado: 2018. 11. 18; Publicado: 2019.01.01

Cistanche tiene un efecto antienvejecimiento.

Resumen

Fondo: El tratamiento de animales envejecidos con plasma de una etapa temprana de desarrollo (p. ej., plasma del cordón umbilical) mostró un potencial impresionante para retardar la degradación de las funciones neuronales y cognitivas asociada con la edad. Sin embargo, traducir tales hallazgos a la realidad clínica requiere formas efectivas de evaluar la eficacia del tratamiento; los métodos ideales deben ser mínimamente invasivos, susceptibles de ensayos en serie, rentables y cuantitativos.

Métodos: Desarrollamos un nuevo enfoque de biosensor para monitorearantienvejecimientoterapia. Avanzamos dos componentes clave del sensor: i) se identificó un metabolito transmitido por la sangre como un marcador de envejecimiento sustituto; y ii) se desarrolló un sistema de ensayo compacto y rentable para aplicaciones in situ. Tratamos ratones viejos con plasma de cordón umbilical humano o solución salina; El perfil imparcial de metabolitos en plasma de ratón reveló que el ácido araquidónico (AA) es un potente indicador asociado con laantienvejecimientoefecto. A continuación, implementamos un sensor magnetoelectroquímico competitivo (cMES) optimizado para la detección de AA directamente del plasma. La plataforma desarrollada podría detectar AA directamente a partir de pequeños volúmenes de plasma (0.5 µL) en 1,5 horas.

Resultados: los ensayos cMES confirmaron una fuerte correlación entre los niveles de AA yefecto antienvejecimiento: Los niveles de AA, aunque disminuyeron con el envejecimiento, aumentaron en los ratones envejecidos tratados con plasma, lo que también mostró una mejora en el aprendizaje y el rendimiento de la memoria.

Conclusiones: La plataforma cMES potenciará tanto la pre- como clínicaantienvejecimientoinvestigación al permitir la vigilancia del tratamiento longitudinal mínimamente invasivo; estas capacidades acelerarán el desarrollo deantienvejecimientoterapias, mejorando la calidad de vida de las personas.

Palabras clave: antienvejecimiento, ácido araquidónico, perfilado de metabolitos, sensor magnetoelectroquímico, biosensor

Introducción

El envejecimiento se reconoce cada vez más como un factor de riesgo clínico para la degeneración cognitiva (p. ej., neurodegeneración, demencia) y otras enfermedades crónicas (p. ej., cáncer, enfermedad cardiovascular, degeneración muscular) [1]. Con la expansión de la vida humana y el aumento de la población anciana, se están realizando importantes esfuerzos para dilucidar los mecanismos del envejecimiento [1–3] y para encontrar estrategias terapéuticas para ralentizar o incluso revertir los procesos de envejecimiento [4]. De hecho, se han informado resultados prometedores de estudios en animales; Los ratones adultos que recibieron una transfusión de plasma de ratones jóvenes recuperaron la función cognitiva, la plasticidad sináptica y la actividad neuronal [5]. Rápido desarrollo enantienvejecimientoSe anticipan tratamientos y su traducción a ensayos en humanos [6]. Sin embargo, las métricas actuales para monitorear los efectos del tratamiento tienen una practicidad limitada, ya que los métodos a menudo son difíciles de aplicar con humanos (p. ej., imágenes cerebrales invasivas, observación controlada del comportamiento) y subjetivos (p. ej., cuestionarios sobre las experiencias de los pacientes). Un requisito clave para avanzarantienvejecimientoPor lo tanto, las terapias radican en el desarrollo de ensayos cuantitativos mínimamente invasivos para el seguimiento del tratamiento.

Razonamos que los metabolitos serían una fuente potente deantienvejecimientobiomarcadores. Los metabolitos son un fenotipo esencial en un organismo y están siendo estudiados como biomarcadores de diagnóstico para otras enfermedades [7]. En particular, el envejecimiento generalmente se asocia con cambios o disfunciones metabólicas, lo que afecta los perfiles generales de metabolitos en los organismos. Como tal, es concebible que rastrear la composición y/o los niveles de los metabolitos informaría la eficacia deantienvejecimientotratamiento. Además, los ensayos de metabolitos, particularmente en forma de análisis de sangre, podrían ser cuantitativos y mínimamente invasivos; estos méritos facilitarían el conocimiento de diferentes regímenes de tratamiento o grupos de pacientes, y el seguimiento de la dinámica del (anti)envejecimiento a través de muestreos seriados.

Aquí describimos una nueva estrategia de biosensor para monitorearantienvejecimientotratamiento. Se propusieron dos elementos clave: i) se identificó un metabolito transmitido por la sangre como marcador sustituto del envejecimiento; y ii) se desarrolló un sistema de ensayo rápido y rentable para aplicaciones en entornos clínicos de rutina. Específicamente, tratamos una cohorte de ratones de edad avanzada (alrededor de 2 años) con plasma de sangre de cordón umbilical humano. Los análisis completos de metabolómica en sangre de ratón revelaron que el ácido araquidónico (AA), cuyo nivel disminuyó significativamente con el envejecimiento, aumentó de manera inversa en el grupo tratado. Esta observación nos llevó a diseñar un sensor magnetoelectroquímico para objetivos moleculares pequeños: optimizamos una reacción electroquímica competitiva en la que AA se capturó en perlas magnéticas y se concentró para una mayor sensibilidad. La plataforma desarrollada podría detectar AA directamente a partir de pequeños volúmenes de plasma (0.5 µL) en 1,5 horas. Usando esta plataforma, pudimos establecer aún más una correlación positiva entre los niveles de AA en sangre y el mejor desempeño de los animales en la tarea motora.

Resultados

Tratamiento de ratones adultos con plasma de sangre de cordón La figura 1a muestra el esquema general del experimento.

Como agente, utilizamos plasma derivado de muestras de sangre de cordón umbilical humano. Estudios previos mostraron que los ratones envejecidos a los que se les inyectó plasma de ratón joven recuperaron la función de la memoria espacial, y la administración sistémica de plasma de sangre del cordón umbilical humano mejoró la cognición dependiente del hipocampo en ratones envejecidos [5, 8]. La inyección de plasma, que carece de componentes celulares, minimizó el riesgo de rechazo inmunológico proveniente de la falta de coincidencia de especies. Los ratones envejecidos (edad inicial, 18 meses de edad) se aleatorizaron y recibieron plasma (un grupo de tratamiento) o tampón salino (un grupo simulado) mediante inyección en la cola (130 µL; consulte la Fig. S1 para obtener más detalles). Como control positivo se utilizaron ratones jóvenes (3 meses de edad). El plasma derivado de la sangre del cordón umbilical no se combinó y a cada ratón se le infundió repetidamente plasma del mismo donante (Fig. S1). Después de un tratamiento de 4-semanas, los ratones se sometieron a una prueba de comportamiento (es decir, rotarod) y se les extrajo sangre para su análisis.

Figura 1. Diseño experimental. Se administró plasma de sangre de cordón humano a los grupos de jóvenes (3-meses), ancianos (20- y 23-meses) y ancianos tratados con plasma (20- y 23-mes de edad). Los tres grupos se sometieron a 2-pruebas Rotarod de prueba para medir la coordinación motora y el aprendizaje. El perfil de metabolitos no dirigidos se realizó en sangre de los tres grupos, y el másantienvejecimiento-La ruta relevante se determinó a través de un enfoque bioinformático. El biosensor se desarrolló para detectar el metabolito más importante de la vía.

Figura 2. Determinación de biomarcadores de metabolitos asociados al tratamiento con plasma de sangre de cordón humano. (A) Perfil global de perturbación de metabolitos. Las filas corresponden a características (una combinación única de valor m/z y tiempo de retención) desde LC/MS y columnas hasta muestras. Las filas están agrupadas jerárquicamente. (B) Gráfico de puntuación de PCA para reducción dimensional. Las muestras se trazaron frente al componente principal (PC) 1 y 2. Los valores entre paréntesis de las leyendas de los ejes son proporciones de varianza explicadas por esos componentes. Lo más probable es que PC1 explique los efectos antienvejecimiento, dado que el grupo tratado con plasma estaba mucho más cerca del grupo joven que del grupo simulado. (C) Análisis de enriquecimiento de vías. Los metabolitos se identificaron haciendo coincidir los valores de m/z medidos con la información de la masa molecular. Cada círculo representa un camino específico encontrado. Para una vía determinada, la ubicación x o el tamaño del círculo corresponde a la centralidad de intermediación relativa (una medida del impacto de la vía) de los metabolitos, y la ubicación o color y (valores p más bajos para el rojo y más altos para el azul) en la medida en que qué metabolitos están sobrerrepresentados. Las vías dominantes tienen valores de x e y más altos. En consecuencia, el metabolismo del ácido araquidónico (AA) se identificó como la vía más probable para explicar laefectos antienvejecimientodel plasma de la sangre del cordón.

Análisis metabólicos en muestras de sangre de ratón.

Primero realizamos un perfil imparcial de metabolitos de moléculas pequeñas en plasma de ratón. Las muestras de sangre de los tres grupos de ratones se sometieron a análisis de cromatografía líquida y espectrometría de masas (LC/MS). Procesamos los datos de m/z por MAIT (kit de herramientas de identificación automática de metabolitos) e identificamos características estadísticamente significativas a través de ANOVA (8572 combinaciones únicas de m/z y tiempo de retención) (Fig. 2a). El análisis de agrupamiento jerárquico (HCA) de metabolitos reveló dos patrones clave: i) los perfiles de metabolitos eran claramente diferentes entre ratones viejos (no tratados) y jóvenes; y ii) el perfil de los ratones viejos tratados con plasma era más cercano al de los ratones jóvenes.

El análisis de componentes principales (PCA) reveló estructuras inherentes de los datos de metabolómica (Fig. 2b). Alrededor del 50 por ciento de las variaciones totales fueron explicables por el primer (PC1) y el segundo componente principal (PC2). Las tres cohortes (es decir, grupos jóvenes, tratados con plasma y simulados) se asentaron en posiciones discretas, lo que indica que se identificaron características biológicamente relevantes para diferenciar las clases de grupos. Curiosamente, el grupo de ancianos tratados con plasma se alejó del simulacro hacia el grupo de jóvenes. Para cuantificar la separación de grupos, calculamos la agrupación jerárquica en los dos componentes principales. En el dendrograma, los grupos jóvenes y tratados con plasma se agruparon en un nivel de disimilitud más bajo (o un nivel de similitud más alto, 1120,9) que el grupo no tratado (3162,5) (Fig. S2). Estos resultados indican que las características seleccionadas (variables o filas en la Fig. 2a) se pueden usar para inferir biomarcadores de metabolitos relevantes para el envejecimiento yantienvejecimiento. Anotamos las características con metabolitos conocidos utilizando una base de datos de dominio público [9].

Además, evaluamos las funciones y la interconectividad de los metabolitos identificados, aplicando el mapeo KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) [10]. Para una vía determinada, medimos i) la sobrerrepresentación de un metabolito candidato y ii) su importancia (es decir, centralidad de intermediación) [11] como un nodo intermedio clave entre pares de otros metabolitos (ver Métodos para más detalles). Descubrimos que el metabolismo del ácido araquidónico (AA) era la vía más sobrerrepresentada (el valor de y más alto en la Fig. 2c), y los metabolitos en esa vía tendían a ubicarse en las vías de comunicación (valores de x más altos en la Fig. 2c) y gobiernan el flujo de información. Entre muchos metabolitos en el metabolismo del AA, seleccionamos el propio AA como biomarcador; como entrada inicial en la vía, el AA solo puede ser un representante de otros metabolitos perturbados.

Sensor magnetoelectroquímico competitivo (cMES) para la detección de AA en plasma

A continuación, nos propusimos avanzar en un sistema de ensayo rápido e in situ para la detección de AA. Optamos por utilizar la tecnología de detección magnetoelectroquímica [12–17]. Combina el enriquecimiento de objetivos y la detección en una sola plataforma: las perlas magnéticas (MB) se utilizan para capturar y etiquetar objetivos moleculares, y los objetivos unidos a perlas se detectan mediante detección electroquímica. Este enfoque tiene muchas ventajas prácticas: i) las muestras nativas (plasma o sangre) pueden usarse directamente sin necesidad de purificación de la muestra; ii) el ensayo logra una alta sensibilidad de detección a través del enriquecimiento magnético y la amplificación de la señal enzimática; iii) según el esquema de detección eléctrica, los sensores se pueden miniaturizar fácilmente como un dispositivo portátil (Fig. 3a).

Sin embargo, la detección de AA a través de la detección magnetoelectroquímica planteó un desafío técnico; dado que AA es una molécula pequeña (~304,5 Da), los inmunoensayos que utilizan un par de anticuerpos AA fueron difíciles de aplicar. Por lo tanto, exploramos un formato de ensayo competitivo (cMES; sensor magnetoelectroquímico competitivo) que requería solo un único anticuerpo AA (Fig. 3b). Para la captura de objetivos, cubrimos los MB con anticuerpos AA (MBAb). También preparamos un agente competidor (AA-HRP) conjugando AA con una enzima oxidante (peroxidasa de rábano picante, HRP). Específicamente, usamos una forma de hapteno; AA conjugado con albúmina de suero bovino (BSA) y HRP conjugado adicionalmente con el portador de BSA (Fig. S3). Para el ensayo cMES, las muestras de sangre se mezclaron con MBAb y AA-HRP. La cantidad de AA-HRP fue suficiente para saturar los sitios de unión a AA en MBAb (Métodos). Esto conduciría a una carga diferencial de HRP en MB, dependiendo de las cantidades endógenas de AA en las muestras. La adición secuencial de un mediador de electrones cromogénico (3,3',5,5'-tetrametilbencidina, TMB) generó una corriente eléctrica que fue leída por un electrodo plano. El tiempo de reacción para la captura de AA y la incubación de TMB se optimizó para maximizar el nivel de señal (Fig. S4).

Figura 3. Sensor magnetoelectroquímico competitivo (cMES) para ensayo AA. (A) Esquema del dispositivo. El dispositivo cMES ocupa poco espacio y ofrece

operaciones en el sitio. (B) Ideamos un ensayo electroquímico competitivo para la detección de AA. Se conjugaron perlas magnéticas (MBAb) con anticuerpos contra AA.

Las muestras de control contenían solo AA-HRP y se mezclaron con perlas magnéticas. Las muestras de prueba se mezclaron con perlas magnéticas y AA-HRP. (C) Corrientes eléctricas

medido por el lector cMES portátil. En el ensayo cMES, la magnitud actual disminuye al aumentar la concentración de AA [AA]. La señal del control

muestra establecer la línea de base para [AA]=0 ng/mL. La diferencia actual (∆I) entre las muestras de plasma de control y objetivo se utilizó como métrica analítica. (D)

Se agregaron cantidades conocidas de AA en suero y se midieron mediante el cMES. El límite de detección fue ~ 126 ng/mL. (E) cMES y ELISA se compararon para

concordancia. Los resultados de ambas modalidades mostraron una buena concordancia (R2=0.959). Los datos se muestran como media ± SEM de mediciones por triplicado.

Figura 4. Mediciones de AA en muestras de plasma. (A) Análisis del curso temporal del nivel de AA del ratón después de la inyección de plasma. Inyectamos 13{{10}} μL de plasma (concentración de AA=7.2 µg/mL) en ratones (n=6) y recolectamos sangre de ratones después de 3, 7 y 14 días. A continuación, se controlaron los niveles de AA en la sangre de los ratones. Los niveles de AA aumentaron significativamente el día 3 y volvieron al nivel normal después de 7 días. *p < 0.05;="" **p="">< 0.01;="" ***p="">< 0.001.="" (b)="" se="" analizaron="" muestras="" de="" plasma="" de="" ratón.="" en="" el="" grupo="" de="" control="" (n="5)," los="" ratones="" jóvenes="" (edades,="" 5="" y="" 8="" meses)="" tenían="" niveles="" más="" altos="" de="" aa="" que="" los="" ratones="" viejos="" tratados="" con="" simulación="" (edades,="" 20="" y="" 23="" meses;="" n="8)." para="" el="" grupo="" tratado="" con="" plasma="" (n="5)," se="" observó="" un="" aumento="" sostenido="" de="" aa.="" *p="">< 0,05;="" **="" p="">< 0,01;="" ***="" p="">< 0,001.="" (c)="" las="" muestras="" de="" plasma="" de="" las="" mismas="" cohortes="" que="" en="" (b)="" se="" analizaron="" mediante="" espectrometría="" de="" masas.="" los="" niveles="" de="" aa="" mostraron="" una="" tendencia="" similar="" medida="" por="" cmes.="" *p="">< 0,05;="" **="" p="">< 0,01;="" ***="" p="">< 0,001.="" los="" datos="" se="" muestran="" como="" media="" ±="">

Como resultado del ensayo competitivo, la magnitud de la corriente eléctrica disminuyó con concentraciones más altas de AA en plasma ([AA]). Por lo tanto, preparamos una muestra de control incubando MBAb solo con AA-HRP. La muestra de control se usó para establecer la línea de base superior (es decir, [AA]=0 ng/mL) para calcular las diferencias de señal; Se midieron las corrientes eléctricas del control y la muestra de plasma, y ​​la diferencia neta |∆I |=|Icontrol - Iplasma|se obtuvo (Fig. 3c). Tal

las mediciones diferenciales también compensaron la señal de fondo común.

El experimento de titulación (Fig. 3d) con muestras enriquecidas con cantidades variables de AA reveló que el límite de detección (LOD) era ~125,9 ng/mL. El LOD del ensayo fue ~300- veces menor que la concentración típica de AA de (38 µg/ml) en plasma de ratones jóvenes (5 meses, n=2). En base a estos resultados, diluimos las muestras de plasma iniciales (100-veces) agregando una solución tampón (ver Métodos). La señal de la unión no específica estuvo cerca de un nivel de fondo intrínseco (~43 nA), lo que potencialmente se benefició del alto factor de dilución. También confirmamos que los resultados del ensayo coincidían con los de ELISA convencional (R2=0.961, Fig. 3e). Sin embargo, el ensayo cMES fue más rápido (1 hora) que ELISA (4 horas), principalmente debido a la rápida cinética de unión; en el cMES, los MB capturan AA en todo el volumen de la muestra (3-difusión dimensional), mientras que la captura de AA se basa en la 1-difusión dimensional en el ELISA basado en placas.

Monitoreo de AA en ratones tratados con plasma

Aplicamos cMES para analizar los niveles de AA en ratones después de un solo tratamiento con plasma. Dado que el AA está presente de forma natural en la sangre del cordón umbilical humano, la inyección de plasma aumentaría de forma adicional los niveles de AA en ratones. La concentración promedio de AA de seis plasmas diferentes de sangre de cordón umbilical humano fue de 7,2 ± 0,5 µg/mL (media ± SEM). Inyectamos 130 µL de plasma de sangre de cordón humano a ratones (n=6) y monitoreamos sus niveles de AA (Fig. 4a). La inyección de plasma aumentó inmediatamente los niveles de AA en sangre (día 3; p < 0,01,="" en="" comparación="" con="" todos="" los="" demás="" puntos="" temporales),="" pero="" el="" efecto="" fue="" temporal;="" los="" niveles="" de="" aa="" volvieron="" a="" la="" normalidad="" 7="" días="" después="" del="" tratamiento="" (p="0.34," en="" comparación="" con="" el="" punto="" de="" tiempo="" antes="" de="" la="" inyección="" de="">

Luego monitoreamos los niveles de AA en plasma después del programa de tratamiento completo (Fig. S1). Se utilizaron tres cohortes de ratones diferentes: un grupo de edad tratado con plasma (n=8) y otro simulado (n=8) (20-23 meses) y un grupo de control joven (<8 months="" old,="" n="5)." we="" used="" 0.5="" µl="" of="" mouse="" plasma="" for="" each="" measurement.="" the="" sham="" group="" showed="" lower="" aa="" level="" compared="" to="" the="" young="" group="" (p="0.003," fig.="" 4b).="" the="" plasma="" treated="" group,="" however,="" showed="" increased="" aa="" levels="" even="" after="" 1="" month="" after="" the="" treatment.="" the="" effect="" was="" sustained="" up="" to="" 4="" months="" post="" treatment;="" the="" plasma-treated="" group="" had="" higher="" aa="" level="" than="" the="" sham="" group="" (p="0.0003)." we="" also="" analyzed="" aliquots="" of="" samples="" via="" lc/ms="" (fig.="" 4c).="" the="" results="" from="" both="" assays="" were="" concordant,="" corroborating="" aa's="" value="" as="" a="">

Tratamiento con plasma que conduce a una mejora cognitiva y conductual en ratones de edad avanzada

Además, evaluamos los fenotipos de comportamiento de las cohortes de animales, en particular evaluando sus funciones de memoria y aprendizaje motor. Realizamos {{0}}pruebas rotarod de prueba 1 y 4 meses después del tratamiento con plasma o simulado (Fig. 5a); se utilizó la latencia (tiempo de ejecución) de un ratón antes de caer sobre una varilla giratoria para evaluar el rendimiento motor del animal. Un mes después del tratamiento (20-meses de edad), la latencia de los grupos simulado y tratado con plasma fue significativamente menor (p < 0,0001)="" que="" la="" de="" los="" jóvenes="" (5-meses="" de="" edad).="" )="" grupo="" (fig.="" 5b).="" sin="" embargo,="" el="" grupo="" tratado="" con="" plasma="" mostró="" una="" mejora="" gradual="" en="" el="" aprendizaje="" motor="" y="" la="" memoria,="" mientras="" que="" la="" misma="" facultad="" disminuyó="" en="" el="" grupo="" simulado.="" los="" cambios="" en="" los="" niveles="" de="" aa="" precedieron="" a="" los="" cambios="" de="" comportamiento,="" lo="" que="" podría="" servir="" como="" un="" indicador="" temprano="">antienvejecimientoefecto del tratamiento (Fig. 5c).

Los análisis de tejido cerebral (Figs. 5d, 5e) mostraron que los ratones envejecidos (el grupo simulado) tenían un área más pequeña de células positivas para DCX en la zona subventricular que los ratones jóvenes. Por el contrario, el área de células positivas para DCX aumentó en el animal tratado con plasma y permaneció sin cambios (p=0.04), lo que indica que el plasma de sangre del cordón umbilical inyectado estimuló la neurogénesis del cerebro antiguo. Los resultados sugieren el beneficio potencial del tratamiento con plasma en la neurogénesis sostenida que dio como resultado una función motora mejorada en el grupo tratado.

Discusión

Los avances en las terapias de rejuvenecimiento aumentan concomitantemente la necesidad de una medida objetiva y cuantitativa para leer la eficacia del tratamiento. Por lo tanto, diseñamos nuestro estudio para identificar biomarcadores moleculares que puedan explicar mejor las características fenotípicas del envejecimiento yantienvejecimientotratamiento. Nuestros experimentos con animales llevaron a las siguientes observaciones: i) los perfiles de metabolitos de las cohortes de ratones jóvenes y adultos son evidentemente diferentes; y ii) la inyección de plasma de cordón humano en ratones viejos cambia sus patrones de metabolitos más cerca de los de ratones jóvenes. Curiosamente, encontramos que el ácido araquidónico (AA) es el biomarcador sustituto más efectivo paraantienvejecimientotratamiento; El metabolismo de AA estaba muy desregulado tanto en ratones jóvenes como en ratones tratados con plasma, y ​​se descubrió que desempeñaba un papel clave en la interacción con otras vías metabólicas, como el metabolismo del ácido linoleico [10, 18].

Además, desarrollamos un sistema de sensor portátil y rápido (cMES) para facilitar la detección de AA en entornos clínicos y de investigación de rutina. Integramos específicamente un esquema de ensayo competitivo con enriquecimiento inmunomagnético en un intento por detectar objetivos moleculares pequeños (es decir, metabolitos) directamente de las muestras de plasma. Esta combinación trae las siguientes ventajas. (i) El ensayo se beneficia de una cinética de unión rápida, ya que las perlas magnéticas capturan AA en todo el volumen de la muestra (3-difusión dimensional). (ii) Los procesos de ensayo (p. ej., pasos de lavado) se simplifican con imanes externos que se utilizan para la recolección de perlas. (iii) Al concentrar magnéticamente perlas unidas a AA cerca del electrodo de detección, se puede mejorar la señal analítica general (~72 por ciento) [12]. De hecho, demostramos que el ensayo cMES utiliza<1 µl="" of="" plasma="" with="" the="" total="" assay="" time="" within="" 1.5="" hour.="" both="" cmes="" and="" mass="" spectrometry="" consistently="" showed="" that="" plasma="" aa="" levels="" decrease="" with="" aging,="" but="" that="" they="" reversely="" increase="" with="" cord-plasma="" treatment.="" importantly,="" increases="" in="" aa="" levels="" could="" be="" an="" early="" indicator="" of="" improved="" cognitive="" functions="" in="" treated="" animals.="" these="" results="" highlight="" the="" utility="" of="" aa-cmes;="" with="" minimally="" invasive="" blood="" draw,="" individual="" patients="" can="" be="" monitored="" in="" a="" serial="" fashion="" to="" better="" assess="" treatment="">

Figura 5. Ensayos conductuales y moleculares. (A) Se realizaron 2-pruebas de prueba de Rotarod 1 y 4 meses después de la inyección de plasma. (B) El grupo tratado con plasma

mostró una mejora progresiva en la coordinación motora; el desempeño fue similar al del grupo joven al final (la segunda prueba a los 3 meses). El tiempo de ejecución del grupo simulado disminuyó con el envejecimiento. *p < 0.05;="" **p="">< 0.01.="" (c)="" para="" el="" grupo="" tratado="" con="" plasma,="" el="" aumento="" de="" los="" niveles="" de="" aa="" precedió="" a="" la="" mejora="" de="" la="" función="" motora.="" *p="">< 0.05;="" **="" p="">< 0,01;="" ***="" p="">< 0,001.="" (d)="" las="" células="" cerebrales="" en="" la="" zona="" subventricular="" fueron="" inmunoteñidas="" para="" un="" marcador="" de="" neurogénesis,="" doblecortina="">

La barra de escala es 50 µm. Tenga en cuenta que el grupo simulado tenía un área significativamente más pequeña de células positivas para DCX en la zona subventricular que los ratones jóvenes, mientras que el área aumentó en el animal tratado con plasma y permaneció sin cambios. (E) Se midió el área de células positivas para DCX en la imagen (D). *p < 0.05;="" ***="" p=""><>

Se ha demostrado que AA promueve el crecimiento muscular y el desarrollo cerebral [19, 20]. Otros informes también destacaron los beneficios potenciales de AA enantienvejecimiento[21, 22]. El estudio actual está en línea con estos hallazgos, pero su alcance se limitó a establecer una relación correlativa entre los niveles de AA yantienvejecimientofenotipos. Sin embargo, el monitoreo serial de AA indicó que los aumentos de AA en los ratones tratados con plasma probablemente provenían de fuentes endógenas, no del plasma transfundido. Además, sostenidaantienvejecimientose observaron efectos en ratones receptores incluso 4 meses después del final del tratamiento con plasma. El aprendizaje motor y las funciones de memoria mejoraron; y el número de células precursoras neuronales aumentó en el cerebro. Estas observaciones sugieren fuertemente cambios fisiológicos en ratones tratados con plasma; el mecanismo exacto aún no se ha dilucidado.

Varias otras limitaciones de este estudio deben abordarse en futuras investigaciones. En primer lugar, el ensayo cMES debe refinarse para lograr una mayor precisión. En particular, con la falta de muestras negativas verdaderas (es decir, muestras de sangre sin ningún AA endógeno), fue difícil explicar las señales de la unión no específica. Posiblemente, el efecto de las matrices de sangre puede ser insignificante ya que diluimos las muestras 100-veces. Sin embargo, tal suposición debe validarse mediante el uso de muestras de plasma con AA eliminado que podrían prepararse a partir de un modelo de ratón con deficiencia de AA [23] o mediante inmunodepleción de AA. En segundo lugar, nos enfocamos en detectar un solo metabolito en el metabolismo de AA por simplicidad, pero este enfoque puede ignorar el contexto biológico, como las interacciones entre los metabolitos en una vía determinada. La inclusión de un panel de metabolitos capturaría mejor las perturbaciones metabólicas y también aumentaría la precisión del diagnóstico. cMES se puede escalar fácilmente para detectar diversos marcadores mientras se consumen pequeñas cantidades de muestra. En tercer lugar, sería un desafío interpolar los hallazgos actuales a los humanos. Aunque los ratones y los humanos comparten rutas metabólicas similares, los ratones tienen una tasa metabólica 7-veces más alta que los humanos [24]. Los ensayos en humanos son necesarios para determinar las dosis óptimas de plasma para infusión y para establecer las líneas de base para los biomarcadores; informados por estudios en animales, estamos planeando tales estudios en humanos. Estos esfuerzos acelerarán el desarrollo deantienvejecimientoterapias, mejorando la calidad de vida de las personas y reduciendo las cargas sociales.

Métodos

Diseño experimental

El plasma se separó de la sangre del cordón umbilical humano recogida en el momento del parto. El plasma de sangre del cordón umbilical se administró mediante infusión intravenosa a ratones viejos (18-mes de edad), control simulado (18-mes de edad) y ratones jóvenes (3-mes de edad como positivos). control) fue inyectado con solución salina. 1 y 4 meses después del trasplante, se realizaron 2-pruebas rotarod de prueba para evaluar la coordinación motora y la memoria a largo plazo (Fig. S1). El perfil de metabolitos no objetivo se realizó en la sangre de los tres grupos y el análisis bioinformático determinó laantienvejecimientovía relevante (metabolismo del ácido araquidónico). El biosensor fue desarrollado para detectar ácido araquidónico circulante en la sangre de manera fácil y eficiente.

Preparación de muestras de sangre de cordón

La sangre del cordón umbilical humano se recolectó bajo la Junta de Revisión Institucional del Hospital General CHA (Seúl, Corea, IRB No. CHAMC-2015- 08-130-009). Se donó sangre de cordón umbilical humano de 4 donantes y se trató con anticoagulante citrato-fosfato-dextrosa con adenina (CPDA-1). Se aisló plasma de sangre de cordón umbilical humano mediante centrifugación a 2,000 g durante 15 min a temperatura ambiente. Las muestras de plasma aisladas se almacenaron a -80 grados y se usaron con un único ciclo de congelación-descongelación a temperatura ambiente.

experimentos con animales

Los protocolos de animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de CHA (IACUC). Usamos ratones hembra C57BL/6 de 18-meses de edad para evaluar las perturbaciones metabólicas y los fenotipos de comportamiento que se correlacionan con el envejecimiento yantienvejecimiento. Los controles positivos fueron ratones hembra C57BL/6 de 3-meses de edad. Todos los ratones se criaron a temperatura ambiente en un ciclo de luz-oscuridad estándar de 12 horas. Para los ratones adultos, el plasma de sangre del cordón umbilical o solución salina (130 µl) se inyectó por vía intravenosa 12 veces durante 4 semanas. El plasma de sangre del cordón umbilical humano aislado no se combinó, y un animal determinado recibió plasma de sangre del cordón umbilical del mismo donante. El número de animales utilizados en cada experimento se describe en las secciones correspondientes del método. El plasma se recogió mediante centrifugación (3, 000 g, 15 min a temperatura ambiente).

Adquisición de metabolitos y análisis de datos.

Para el perfil de los metabolitos transmitidos por la sangre, se recolectó sangre de los ratones mediante punción cardíaca en los puntos de tiempo designados: el grupo joven (3-mes de edad, n=10), el grupo simulado ({{ 4}}meses, n=10; 23-meses, n=12), el grupo tratado con plasma (20-meses, n {{13 }}; 23-mes de edad, n=5). Las muestras de sangre se analizaron utilizando un sistema de cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) (Agilent). Convertimos archivos LC/MS a un formato mzXML estándar (ProteoWizard) [25] y luego los procesamos usando MAIT (kit de herramientas de identificación automática de metabolitos) [26] para la detección de características, el análisis estadístico y la identificación de metabolitos. Las características estadísticamente significativas (es decir, metabolitos ionizados y/o fragmentados) se identificaron mediante análisis de varianza (ANOVA). Estas características se compararon con todos los posibles metabolitos putativos en la base de datos de metabolomas [9] en función de la relación masa/carga del ion espectral de masas (tolerancia m/z de 0.005). Caracterizamos las alteraciones globales de metabolitos a través del análisis de agrupamiento jerárquico y las estructuras inherentes de los datos metabolómicos a través del análisis de componentes principales (PCA). Se incluyeron dos o tres réplicas técnicas (asegurando que la variación técnica sea mucho menor que la variación biológica) por ratón en el aprendizaje no supervisado, como PCA y agrupación jerárquica. El agrupamiento jerárquico en componentes principales (HCPC) fue realizado por FactoMineR, un paquete R [27]. Para un análisis funcional, las rutas metabólicas más probables de verse perturbadas por el envejecimiento y el tratamiento con plasma se determinaron mediante el análisis de la ruta KEGG (MetaboAnalyst 3.0) [28]. La distribución hipergeométrica se utilizó para medir la sobrerrepresentación de los metabolitos emparejados en vías específicas de KEGG.

Preparación de perlas inmunomagnéticas

Se suspendieron perlas magnéticas (5 mg) recubiertas con grupos epoxi (Dynabeads M-270 Epoxy, Invitrogen) en 100 µL de solución de fosfato de sodio 0,1 M. Se añadieron cien microgramos de anticuerpo contra el ácido araquidónico (Biomatik) y se mezclaron completamente. Se añadieron cien microlitros de solución de sulfato de amonio 3 M y la mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 2 horas y luego se incubó adicionalmente a 4 grados durante la noche con rotación de inclinación lenta. La reacción de conjugación se llevó a cabo a pH=7,4. Estos procesos inducen la formación de enlaces covalentes entre los grupos epoxi (perla) y amina (anticuerpo), que confirmamos previamente al someter los conjugados de anticuerpo-perla a pruebas de pH [29]. En promedio, se inmovilizaron 2,4 x 104 anticuerpos por perla. Las perlas magnéticas conjugadas con anticuerpo se separaron con un imán permanente, se lavaron dos veces con solución de PBS y se resuspendieron en 200 µl de PBS con BSA al 1 por ciento. Las perlas se almacenaron en 4 grados hasta un mes.

Conjugación de HRP a ácido araquidónico

A continuación, HRP se conjugó con BSA mediante química de aminación reductora. Específicamente, 100 µg de AA conjugado con BSA (RPU51089, Biomatik) se disolvió en 0,5 ml de tampón de carbonato-biocarbonato 0,2 M (pH 9,4), se agregó a un miligramo de EZ-link liofilizado. Peroxidasa Activada Plus (Thermo Scientific), e incubado durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, se añadieron 10 µL de cianoborohidruro de sodio (Thermo Scientific) y la mezcla se incubó durante 15 min a temperatura ambiente. Finalmente, se añadieron 20 µL de tampón de extinción (Thermo Scientific), seguido de 15 min de incubación a temperatura ambiente. La electroforesis en gel y el análisis de bandas de proteínas confirmaron la conjugación de HPR con BSA-AA (Fig. S3a). Los AA conjugados con HRP se recogieron y concentraron con un filtro centrífugo Amicon Ultra 100K (Millipore). La peroxidasa restante y BSA-AA se lavaron con PBS cuatro veces.

Detección electroquímica de AA en muestras de plasma

Para la detección electroquímica de AA, se recolectó sangre de los grupos jóvenes (n {{0}}), simulados (n=8) y tratados con plasma (n=5 durante 1 mes y n=5 durante 3 meses). Muestras de plasma de ratón (0.5 µL) se diluyeron en 50 µL de BSA al 1 por ciento en PBS (x100-veces de dilución) y se mezclaron con solución de microesferas inmunomagnéticas (50 µL) y solución de AA conjugado con HRP (50 µl). La cantidad de AA-HRP fue lo suficientemente grande como para saturar los sitios de unión en las perlas magnéticas. Utilizamos alrededor de 8,4 × 107 perlas por prueba, lo que puso a disposición 2,0 × 1012 sitios de unión a AA. La cantidad de AA-HRP fue ~1,7 × 1013; la relación entre AA-HRP y los sitios de unión fue ~8:1. La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora con rotación basculante lenta. La perla de control se preparó mezclando BSA al 1 por ciento en PBS (50 µl) con solución de perla inmunomagnética (50 µl) y solución de AA conjugada con HRP (50 µl). Todas las perlas que reaccionaron se separaron con un imán permanente y se lavaron dos veces con 80 µl de PBS (BSA al 1 por ciento). Finalmente, las perlas se resuspendieron en 7 µL de PBS. La solución de perlas preparada y 20 µL de solución TMB (Biomatik) se cargaron en la parte superior del electrodo. Después de 6 min, se inició la medición de la cronoamperometría. Utilizamos un sensor electroquímico miniaturizado (un sistema prototipo desarrollado por AcurreHealth Inc.). Se promediaron los niveles actuales en el rango de 40-45 s. Usamos el factor de conversión (×100) para informar las concentraciones originales estimadas de AA en plasma.

Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA)

Los experimentos ELISA se realizaron utilizando el kit ELISA de ácido araquidónico (AA) de ratón (Biomatik) de acuerdo con las pautas de fabricación. Se añadieron AA diluidos en serie a cada pocillo y se incubaron con AA conjugado con HRP a 37 grados durante 40 min. Después de lavar cuatro veces con tampón de lavado, se añadió solución de TMB y se incubó durante 20 min. El desarrollo de color se detuvo añadiendo solución de parada. La absorbancia se leyó a 450 nm utilizando un lector de microplacas (Tecan).

Prueba rotarod

Modificamos la prueba de Rotarod de Kong et al. [30] para evaluar la coordinación locomotora. El rotarod con una varilla de 3-cm de diámetro comenzó a 4 rpm y aceleró 4 rpm cada 30 segundos durante 5 min. Los ratones se colocaron en la varilla y se midió el tiempo que tardaban los ratones en caerse de la varilla. A cada ratón se le dieron 3 intentos al día, y los tiempos de ejecución de cada día se calcularon como el promedio de los tiempos de entrenamiento. La primera prueba rotarod se realizó 1-mes después del tratamiento con plasma: el grupo joven (n=29), el grupo simulado (n=17), el grupo tratado con plasma (n {{ 11}}). Se inició una sesión de reentrenamiento 4-meses después del tratamiento con plasma. Para evitar el sobreentrenamiento, se realizó un reentrenamiento durante 2 días. El otro procedimiento fue el mismo que el de la primera sesión.

Imágenes de tejido cerebral

En 1 mes (n=4) y 4 meses (n=3) después de la inyección de plasma de sangre de cordón humano o inyección de solución salina, los animales fueron sacrificados y luego perfundidos con 4 por ciento de paraformaldehído (PFA) y PBS a través de la ventrículo izquierdo. Los grupos jóvenes (n=5) y falsos (n=4) se usaron como controles. Sus cerebros estaban

extraído y crioprotegido. Cada cerebro se seccionó en un criotomo con un espesor de 30 μm. A

realizar la inmunohistoquímica, la unión no específica se bloqueó con suero de cabra normal al 5 por ciento en 0, 3 por ciento Triton X-100 durante 40 min. El anticuerpo primario contra Doublecortin (DCX; 1:400, Cell Signaling, #4604S) se aplicó durante la noche a 4 grados y luego se usó PBS para lavar [31]. Se usó el anticuerpo secundario Alexa Fluor 488 (1:2000, Invitrogen, #A11008) para la detección de DCX. Las imágenes se tomaron con un microscopio de fluorescencia (Nikon Eclipse 80i) y se analizaron con Image J [32].

análisis estadístico

El análisis estadístico se realizó utilizando las funciones básicas de R y lme4, un paquete de R para Linear

Modelos de Efectos Mixtos o Modelo Lineal Generalizado

(GLM) seguido de una prueba post-hoc de LSD [33]. Los datos se presentan como medias ± error estándar y un valor de p de <0.05 se="" consideró="">

Material suplementario

Cifras complementarias.

http://www.thno.org/v09p0001s1.pdf

Expresiones de gratitud

Agradecemos a AccureHealth Inc. por proporcionar el sensor electroquímico miniaturizado. Este estudio fue financiado en parte por la subvención del Instituto para la Promoción de la Tecnología de la Información y las Comunicaciones (IITP) financiada por el Gobierno de Corea (MSIT) (2017M3A9B4025699).

Conflicto de intereses

Los autores han declarado que no existe ningún interés en competencia.