Evaluación in vitro de la fotorreactividad y fototoxicidad de antioxidantes de polifenoles naturales

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Resumen:Los polifenoles son una gran familia de compuestos naturales ampliamente utilizados en productos cosméticos debido a sus beneficiosas propiedades antioxidantes y antiinflamatorias y su capacidad para prevenir el estrés oxidativo inducido por la radiación UV. Dado que estos compuestos presentan cromóforos y se aplican directamente sobre la piel, pueden reaccionar con la luz solar y ejercer efectos fototóxicos. La información científica disponible sobre el potencial fototóxico de estos compuestos naturales es escasa, por lo que el objetivo de este estudio fue evaluar la fotorreactividad y fototoxicidad de cinco compuestos fenólicos.antioxidantescon uso documentado en productos cosméticos. Se validó y aplicó un ensayo estándar de ROS para detectar la fotorreactividad de los antioxidantes fenólicos naturales ácido cafeico, ácido ferúlico, ácido p-cumárico3,4-ácido dihidroxifenilacético (DOPAC) y rutina. El potencial de fototoxicidad se determinó utilizando una línea celular de queratinocitos humanos (HaCaT), según la prueba de fototoxicidad 3T3 Neutral Red Uptake. Aunque todosantioxidantes fenólicos estudiadosabsorbió radiación UV/Vis en el rango de 290 a 700 nm, solo DOPAC pudo generar oxígeno singulete. La generación de especies reactivas de oxígeno es una reacción química en etapa temprana como parte del mecanismo de fototoxicidad. Sin embargo, ninguno de los compuestos estudiados disminuyó la viabilidad de los queratinocitos después de la irradiación, lo que llevó a la conclusión de que no tienen potencial fototóxico. Los datos obtenidos con este trabajo sugieren que estos compuestos son seguros cuando se incorporan en productos cosméticos.

Palabras clave:seguridad fotográfica; fotoreactividad; fototoxicidad; polifenoles;antioxidantes fenólicos naturales; especies de oxígeno reactivas; queratinocitos; protección de la piel; productos cosméticos

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Introducción 

Los polifenoles (PP) constituyen uno de los grupos de productos naturales más numerosos y ampliamente distribuidos en el reino vegetal. La estructura química de los PP se caracteriza por la presencia de uno o más grupos hidroxilo fenólicos, unidos a uno o más sistemas de anillos bencénicos [1]. Los polifenoles exhiben una variedad de actividades biológicas beneficiosas en humanos, que incluyen acción antiviral, antibacteriana, anticancerígena, hepatoprotectora, antiinflamatoria y antioxidante [2–5].como antioxidantes, los polifenoles pueden proteger a los componentes celulares contra los efectos oxidativos dañinos de las especies reactivas de oxígeno (ROS), como el oxígeno singulete, el superóxido y los radicales hidroxilo, lo que limita el riesgo de varias enfermedades asociadas con el estrés oxidativo [6,7]. Debido a sus propiedades químicas, los PP pueden capturar ROS y quelar iones de metales de transición, como el hierro y el cobre, lo que ha atraído el interés de la industria cosmética por su uso en formulaciones para el cuidado de la piel [8-10]. La exposición a los rayos ultravioleta (UV) es uno de los principales factores que inducen el cáncer de piel, y las células cutáneas pueden dañarse directamente por la radiación UV o indirectamente por la sobreproducción de ROS mediada por UV [11]. Estudios experimentales y epidemiológicos han sugerido que los polifenoles protegen la piel de los efectos adversos de la radiación UV a través de múltiples vías [12]. Por lo tanto, varios compuestos pertenecientes a esta familia ya se utilizan como ingredientes en una serie de productos cosméticos comerciales disponibles en el mercado [13]. El aumento de la demanda de cosméticos naturales por parte de los consumidores instó a la industria a desarrollar formulaciones que utilicen extractos naturales con ingredientes activos, como los polifenoles, como una solución prometedora y eficaz para el cuidado de la piel [13]. Sin embargo, los cromóforos presentes en la estructura de los polifenoles tienen la capacidad de absorber la radiación UV/Vis y sufrir reacciones químicas que resultan en una cascada de eventos que pueden resultar en reacciones fototóxicas [14]. La fototoxicidad se define como una respuesta tóxica provocada por sustancias químicas fotorreactivas administradas por vía tópica o sistémica después de la exposición del cuerpo a la luz ambiental [15]. Los ingredientes y excipientes farmacéuticos activos para administración sistémica, formulaciones clínicas para aplicación tópica, parches dérmicos y otros, tienen potencial fototóxico y pueden causar reacciones fototóxicas notables. En consecuencia, las agencias reguladoras, la FDA de EE. UU., la EMA de la UE y la ICH, brindan pautas de seguridad fotográfica, presentando métodos de prueba y estrategias de evaluación [15–17]. La evaluación de la seguridad de los productos cosméticos es obligatoria según la legislación de la Unión Europea [18]. La evaluación de seguridad requerida incluye estudios toxicológicos relevantes sobre ingredientes cosméticos, incluida una evaluación de toxicidad fotoinducida [18]. Dado que se prohibieron las pruebas en animales para productos cosméticos, en los últimos años se han propuesto varias pruebas de seguridad fotográfica in vitro, incluido el análisis del espectro UV, una prueba de fototoxicidad de absorción de rojo neutro 3T3 (3T3 NRU PT) y una especie de oxígeno reactivo ( ROS) ensayo [18-20]. El ensayo ROS fue diseñado para la evaluación de la fotorreactividad de fármacos, cuyo principio es monitorear las reacciones fotoquímicas en los productos químicos de prueba expuestos a la luz solar simulada [19,20]. A través de estas reacciones fotoquímicas, se pueden generar ROS, como el anión superóxido y el oxígeno singulete, y estos procesos fotoquímicos pueden desencadenar la fototoxicidad inducida por fármacos [19,20]. Los altos niveles de ROS pueden causar citotoxicidad a través del daño del ADN, los lípidos y las proteínas por el estrés oxidativo.https://www.voachinese.com/a/us-lawmakers-united-condemn-russias-ukraine-invasion-20220224/6458599.htmlLa metodología in vitro 3T3 NRU-PT utiliza la línea celular de fibroblastos de ratón Balb/c 3T3 y la captación de rojo neutro como criterio de valoración de la citotoxicidad. A continuación, la fototoxicidad se determina por la reducción relativa de la viabilidad de las células expuestas al producto problema en presencia y ausencia de luz que simula la luz del sol. Los estudios informados en la literatura concluyeron que esta prueba es demasiado sensible, prediciendo erróneamente los riesgos de seguridad de las fotografías en animales y humanos, lo que lleva a una gran cantidad de falsos positivos en comparación con los resultados in vivo [21–23]. Teniendo en cuenta esta limitación, nuestro grupo propuso una modificación de la metodología 3T3 NRU-PT basada en el uso de una línea celular de queratinocitos humanos (HaCaT) [24]. Dado que esta metodología utiliza células de queratinocitos humanos, representa un modelo más realista, dado que estas son el tipo de células más abundantes presentes en la capa externa de la piel, donde se aplican compuestos tópicos y se exponen a la radiación solar [24]. El objetivo del presente estudio fue estimar el potencial de toxicidad fotoinducida de los polifenoles naturales ácido p-cumárico, ácido cafeico, ácido 3,4-dihidroxifenilacético (DOPAC), ácido ferúlico y rutina (Figura 1), que ya se utilizan como ingredientes cosméticos o se están considerando por sus interesantes propiedades químicas y antioxidantes [25–27]. Se validó e implementó un ensayo ROS para la evaluación exploratoria de la fotoseguridad de los compuestos, y su citotoxicidad y fototoxicidad se evaluaron más a fondo utilizando una línea celular de queratinocitos humanos (HaCaT).

2. Resultados y Discusión 

La consideración inicial para la evaluación del potencial fotorreactivo es si un compuesto absorbe fotones en cualquier longitud de onda entre 290 y 700 nm. Un compuesto que tiene un coeficiente de extinción molar (MEC) superior a 1000 L mol-1 cm-1 en cualquier longitud de onda entre 290 y 700 nm se considera lo suficientemente fotorreactivo para provocar fototoxicidad directa [15]. Los espectros de absorción de los ácidos cafeico, p-cumárico y ferúlico, DOPAC y rutina en DMSO en luz UV-visible se muestran en la Figura 2. Todos los compuestos absorben en el rango espectral de 200 a 700 nm, con una longitud de onda máxima en o por encima de 290 nm y con MEC normalmente superior a 4000 L mol-1 cm-1 (Tabla 1). Los polifenoles son compuestos biológicos que contienen sistemas conjugados π con grupos hidroxilo fenólicos. Las transiciones electrónicas de los orbitales moleculares de tipo π son responsables del espectro UV-visible de este grupo de compuestos [28]

Todos los compuestos probados presentaron MEC superiores a 1000 L mol-1 cm-1, lo que significa que todos son posibles compuestos fototóxicos que vale la pena estudiar [15]. Antes de realizar el ensayo de ROS, se evaluó el simulador solar y se optimizaron las condiciones experimentales para garantizar que los valores medidos de oxígeno singulete (SO) y anión superóxido (SA) estuvieran cerca de los mencionados en la literatura [29]. La optimización del ensayo de generación de ROS se realizó utilizando controles positivos y negativos y se realizó un estudio de viabilidad utilizando productos químicos de referencia. Bajo las condiciones experimentales utilizadas, todas las sustancias probadas en el estudio de factibilidad cumplieron los criterios de aceptación dando valores para SO y SA dentro de los rangos de valores admisibles [29].

El ensayo ROS se llevó a cabo para los compuestos polifenólicos, y la capacidad de las sustancias probadas para generar ROS, a la concentración de 200 µM, se muestra en la Tabla 2. Tabla 2. Los resultados se obtuvieron para los compuestos probados usando el ensayo ROS.

Los resultados obtenidos muestran que, a excepción del DOPAC, todos los compuestos pueden clasificarse como no fotorreactivos. Aunque estas sustancias mostraron una absorción de luz UV-visible y una MEC superior a 1000 L mol-1 cm-1, no generaron ROS en las condiciones probadas, ni SO ni SA. Sorprendentemente, DOPAC fue capaz de inducir la generación de especies de SO y, por lo tanto, se clasificó como fotorreactivo, a pesar de que este compuesto tiene el valor de MEC más bajo en el rango UV-visible entre todos los compuestos estudiados. Se necesitan más estudios para comprender los resultados obtenidos por DOPAC, que también pueden ser importantes, en un futuro próximo, para establecer una correlación entre la estructura química de un compuesto y su capacidad de ser fotorreactivo. Se evaluó la citotoxicidad del DMSO utilizado para la evaluación de los efectos fototóxicos, en presencia y ausencia de irradiación, después de 1h de exposición. Para la placa no irradiada, el DMSO no mostró una diferencia estadísticamente significativa con respecto a los controles negativos. Sin embargo, para la placa irradiada, hubo una diferencia significativa entre el 1 por ciento de DMSO y el control con solvente en relación con los controles negativos (p < 0.0001),="" lo="" que="" justificó="" el="" uso="" del="" control="" con="" solvente="" en="" todos="" los="" experimentos="" para="" garantizar="" que="" las="" diferencias="" en="" la="" viabilidad="" celular="" sólo="" se="" atribuyeron="" a="" los="" compuestos="" en="" estudio.="" para="" garantizar="" la="" viabilidad="" del="" ensayo="" de="" fototoxicidad="" con="" una="" línea="" celular="" de="" queratinocitos="" humanos="" (hacat),="" se="" analizaron="" 5-metoxipsoraleno,="" clorhidrato="" de="" clorpromazina="" y="" quinina="" como="" controles="" positivos,="" y="" ácido="" acetilsalicílico,="" hexaclorofeno="" y="" laurilsulfato="" de="" sodio="" como="" controles="" negativos.="" [24].="" los="" resultados="" obtenidos="" del="" ensayo="" de="" fototoxicidad="" que="" compara="" la="" viabilidad="" celular="" de="" las="" células="" hacat,="" irradiadas="" y="" no="" irradiadas,="" en="" presencia="" de="" los="" compuestos="" (poli)fenólicos="" probados="" se="" muestran="" en="" la="" figura="" 3.="" los="" rangos="" de="" concentración="" de="" los="" productos="" químicos="" probados="" en="" presencia="" (irr="" plus="" )="" y="" la="" ausencia="" (irr−)="" de="" luz="" se="" determinaron="" en="" experimentos="" de="" búsqueda="" de="" rango="" de="" dosis,="" considerando="" la="" concentración="" máxima="" de="" 1000="" µm.="" se="" utilizó="" una="" serie="" de="" dilución="" geométrica="" y="" se="" ajustó,="" cuando="" fue="" necesario,="" en="" función="" de="" la="" concentración-respuesta="" en="" presencia="" y="" ausencia="" de="" irradiación.="" dentro="" del="" rango="" de="" concentración="" probado="" (12.5;="" 31.25;="" 62.5;="" 125;="" 250;="" 500="" y="" 1000="" µm)="" ninguna="" de="" las="" sustancias="" de="" prueba="" indujo="" una="" disminución="" del="" 50="" por="" ciento="" en="" la="" viabilidad="" celular,="" por="" lo="" tanto,="" no="" fue="" posible="" calcular="" los="" valores="" ic50="" y="" pif="" correspondientes="" .="" por="" el="" contrario,="" se="" pudo="" percibir="" un="" aumento="" dosis-dependiente="" de="" la="" viabilidad="" de="" las="" células="" irradiadas="" en="" presencia="" de="" las="" sustancias="" ensayadas,="" posiblemente="" debido="" a="" los="" efectos="" fotoprotectores="" de="" estos="" antioxidantes="" frente="" al="" daño="" oxidativo="" inducido="" por="" la="" radiación="" dando="" lugar="" a="" un="" mayor="" porcentaje="" de="" células="" viables="" en="" comparación="" con="" el="" control="" (células="" irradiadas="" sin="" tratar).="" se="" describe="" en="" la="" literatura="" que="" la="" radiación="" uv="" conduce="" a="" la="" generación="" de="" ros,="" una="" sobreproducción="" de="" óxido="" nítrico="" y="" el="" agotamiento="" de="" las="" defensas="" antioxidantes="" en="" los="" queratinocitos="" [30].="" por="" estas="" razones,="" los="" polifenoles="" con="" capacidad="" antioxidante="" se="" han="" estudiado="" como="" agentes="" fotoprotectores.="" aunque="" la="" mayoría="" de="" los="" estudios="" se="" centraron="" en="" la="" capacidad="" fotoprotectora="" de="" los="" polifenoles,="" no="" estudiaron="" su="" potencial="" fototóxico.="" estudios="" previos="" confirmaron="" la="" capacidad="" de="" los="" ácidos="" cafeico,="" ferúlico="" y="" p-cumárico="" para="" eliminar="" ros="" y="" especies="" reactivas="" de="" nitrógeno="" (rns).="" además,="" la="" protección="" contra="" los="" efectos="" nocivos="" de="" la="" radiación="" uv="" también="" se="" estableció="" in="" vivo="" o="" en="" células="" de="" la="" piel="" para="" estos="" tres="" compuestos="" fenólicos="" [31–34].="" estos="" datos="" pueden="" explicar="" el="" aumento="" del="" porcentaje="" de="" células="" viables="" cuando="" se="" exponen="" a="" la="" irradiación="" en="" presencia="" de="" los="" compuestos="" en="" estudio.="" la="" rutina,="" como="" los="" ácidos="" cafeico,="" ferúlico="" y="" p-cumárico="" dieron="" resultados="" negativos="" en="" el="" ensayo="" de="" generación="" de="" ros="" y="" no="" indujeron="" fototoxicidad="" en="" la="" línea="" celular="" hacat.="" existe="" cierta="" información="" contradictoria="" en="" la="" literatura="" sobre="" el="" potencial="" fototóxico="" de="" la="" rutina,="" de="" ahí="" el="" interés="" de="" los="" resultados="" obtenidos.="" la="" evaluación="" del="" potencial="" fototóxico="" utilizando="" un="" sistema="" de="" células="" de="" queratinocitos="" (hacat),="" mostró="" que="" la="" rutina="" demostró="" fototoxicidad="" [35].="" por="" el="" contrario,="" utilizando="" una="" configuración="" experimental="" que="" emplea="" electroforesis="" capilar="" con="" detección="" electroquímica="" y="" uv="" para="" probar="" la="" fototoxicidad="" de="" extractos="" y="" componentes="" de="" plantas="" en="" términos="" de="" consumo="" de="" oxígeno="" y="" generación="" de="" especies="" reactivas="" de="" oxígeno="" tras="" la="" irradiación="" con="" luz="" visible,="" fue="" posible="" concluir="" que="" la="" rutina="" era="" no="" fototóxico="" [36],="" lo="" que="" concuerda="" con="" los="" resultados="" obtenidos="" en="" este="" trabajo="" donde="" la="" rutina="" no="" mostró="" fotorreactividad="" ya="" que="" no="" generó="" so="" ni="" sa="" en="" el="" ensayo="" de="" generación="" de="" ros.="" por="" otro="" lado,="" en="" este="" trabajo="" también="" se="" demostró="" que="" la="" rutina="" por="" sí="" sola="" no="" presenta="" potencial="" fototóxico="" en="" la="" línea="" celular="" hacat.="" estos="" hallazgos="" contradictorios="" resaltan="" la="" importancia="" de="" usar="" condiciones="" de="" prueba="" estandarizadas="" y="" también="" el="" uso="" de="" una="" fuente="" de="" luz="" adecuada="" para="" evitar="" resultados="" engañosos.="" curiosamente,="" y="" a="" pesar="" de="" la="" similitud="" estructural="" entre="" dopac="" y="" los="" otros="" pp="" estudiados,="" dopac="" generó="" so="" en="" el="" ensayo="" de="" generación="" de="" ros="" y="" se="" clasificó="" como="" fotorreactivo.="" sin="" embargo,="" cuando="" se="" probó="" en="" la="" línea="" celular="" hacat,="" dopac="" demostró="" no="" ser="" fototóxico.="" por="" los="" resultados="" obtenidos,="" el="" dopac="" parece="" ser="" fotorreactivo="" pero="" no="" fototóxico,="" por="" lo="" que="" no="" se="" espera="" que="" se="" produzcan="" reacciones="" fototóxicas="" tras="" la="" aplicación="" tópica="" de="" este="">

3. Materiales y Métodos

3.1. reactivos

3,4-Ácido dihidroxifenilacético (DOPAC), ácido cafeico, ácido transferúlico, ácido p-cumárico, rutina, clorhidrato de clorpromazina, fosfato de hidrógeno disódico dodecahidrato, fosfato de sodio monobásico monohidrato, rojo neutro (NR) y sulfóxido de dimetilo (DMSO) se adquirieron de Sigma-Aldrich (Madrid, España). El clorhidrato de quinina, la benzocaína, el diclofenaco y la eritromicina se adquirieron de Acofarma (Madrid, España). La línea celular de queratinocitos humanos inmortalizados (HaCaT) se obtuvo de Cell Lines Service (CLS) (Eppelheim, Alemania). Medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con 4,5 g/L de D-glucosa, L-glutamina, HEPES 25 mM y DMEM con 4,5 g/L de D-glucosa, L glutamina, HEPES 25 mM sin rojo fenol, solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS), suero fetal bovino (FBS) y tripsina EDTA se adquirieron de Gibco Life Technologies (Waltham, MA, EE. UU.). El etanol fue suministrado por Aga (Lisboa, Portugal). N, N-dimetil-4-nitroguanidina (RNO), imidazol y Nitro Blue Tetrazolium (NBT) se adquirieron de Alfa Aesar (Kandel, Alemania).

3.2. Absorción espectral 

El espectro de absorción de cada compuesto estudiado se determinó en el rango de 290 a 700 nm, según la directriz de prueba 101 de la OCDE, utilizando un espectrofotómetro Jasco V650 UV/VIS [37]. Las sustancias se disolvieron en DMSO para obtener una concentración final de 10 µg/mL y los espectros de absorción se midieron usando cubetas de cuarzo transparentes UV (longitud de camino=10 mm). Cada espectro se corrigió para la absorción de línea de base específica del solvente. Los coeficientes de extinción molar (MEC) se calcularon utilizando los picos de absorción más altos de 290 a 700 nm [15].

3.3. Ensayo de especies reactivas de oxígeno (ROS) 

Se estableció el protocolo de ensayo de ROS y los estudios de validación se realizaron de acuerdo con el procedimiento descrito en la literatura [19,29]. Las soluciones madre de todas las sustancias probadas se prepararon a una concentración de 10 mM en DMSO y se usaron el mismo día, protegidas de la luz. Brevemente, la generación de oxígeno singulete (SO) se detectó mediante la medición espectrofotométrica del blanqueo de p-nitrosodimetilanilina (RNO) a 440 nm usando imidazol como aceptor selectivo de oxígeno singulete. Las muestras que contenían el producto químico analizado (200 µM), RNO (50 µM) e imidazol (50 µM) en tampón de fosfato de sodio 20 mM (PB, pH 7,4) se colocaron en un tubo, se mezclaron con un mezclador vórtex y se sometieron a ultrasonidos. protegido de la luz, durante 10 min. La mezcla se transfirió a una celda de alto rendimiento de vidrio de cuarzo Hellma y se comprobó la precipitación bajo un microscopio antes de la exposición a la luz. A continuación, las muestras se irradiaron con un simulador solar termostático Fitoclima S600PL (Aralab, Portugal), equipado con ocho lámparas Repti Glo (20 W) UV-Vis, durante 90 min a 25 ◦C. Después de la irradiación, se volvió a leer la absorbancia a 440 nm. La generación de anión superóxido (SA) se detectó al observar la reducción de nitroazul de tetrazolio (NBT) a monoformazán (NBT plus), cuya formación puede monitorearse espectrofotométricamente a 560 nm. Se irradiaron muestras que contenían los compuestos probados (200 µM) y NBT (50 µM) en NaPB 20 mM, y la reducción de NBT se midió por el aumento de absorbancia a 560 nm de la misma manera que para la determinación de SO. Los experimentos se realizaron por triplicado. Dado que el simulador solar utilizado era diferente a los modelos recomendados, fue necesario validar las condiciones de irradiación. Se realizó un ensayo de ROS para garantizar que las condiciones de irradiación cumplieran los criterios recomendados utilizando controles positivos (quinina) y negativos (sulisobenzona) y compuestos químicos de referencia [29]. De acuerdo con el resultado (media de determinaciones por triplicado) del ensayo ROS, los compuestos polifenólicos probados se clasificaron como sustancias fotorreactivas cuando se midió un valor de SO de 25 o más y/o un valor de SA de 20 o más; a su vez, se determinó como sustancia no fotorreactiva cuando se registraron valores menores a 25 para SO y menores a 20 para SA [29].

3.4. Cultivo de células 

Las células HaCaT se mantuvieron a 37 ◦C en una atmósfera humidificada de 95 por ciento de aire y 5 por ciento de CO2 en la incubadora en DMEM con 10 por ciento de FBS y 1 por ciento de antibióticos. Con un microscopio invertido, se observó la confluencia celular y, si las células alcanzaban una confluencia del 70-80 por ciento, se realizaba un subcultivo para evitar la muerte celular. Para ello se aspiró el medio de cultivo, se lavaron las células con DPBS, se añadieron 2 mL de tripsina al 0,25 por ciento y se incubaron durante 7 a 8 min a 37 ◦C en atmósfera de CO2 al 5 por ciento. Después de que las células se desprendieran, se añadió un medio nuevo para bloquear la acción de la tripsina. Para el conteo de células, se colocaron 10 µL de suspensión celular en una cámara de Neubauer donde se contaron las células. A continuación, la suspensión celular obtenida se subdividió en nuevos matraces con medio de cultivo celular nuevo. Para la congelación de células, se usó DMSO (5 por ciento v/v) como crioconservante para evitar la formación de cristales durante la fase de almacenamiento. Para determinar el tiempo necesario para que las células se dupliquen, se sembraron 1 × 106 células en cinco matraces de 75 cm2 y se incubaron durante 24 h a 37 ◦C en una atmósfera con 5% de CO2 hasta alcanzar la adherencia completa. Luego, las células de cada matraz se contaron a diferentes tiempos. Los resultados se trazaron en un gráfico que representaba el número de células frente al tiempo, a partir del cual se calculó el tiempo de duplicación utilizando un análisis de regresión lineal. El tiempo de duplicación calculado obtenido fue de 20,43 h, lo cual es consistente con los valores reportados en la literatura, lo que confirma que las células utilizadas se encontraban en condiciones normales de crecimiento [38]. 3.5. Ensayo de fototoxicidad Para el estudio de la fototoxicidad se siguió un protocolo previo implementado en nuestro laboratorio [24]. Se ajustó la altura de la lámpara UVA/UVB Osram (240V E27) para irradiar las células con una dosis de radiación UVA de 1,7 mW/cm2 (Radiómetro Cosmedico, UVM-7), según directriz de la OCDE [23] . Durante la irradiación (10 min), las placas se mantuvieron dentro de un recipiente de espuma de poliestireno que contenía un sistema de refrigeración por agua y se controló la temperatura durante todo el procedimiento. En resumen, para realizar el ensayo de captación de NR, se sembraron células HaCaT (2 × 104 células/pocillo) y se incubaron a 37 ◦C en una atmósfera con un 5 % de CO2 durante 24 h. Posteriormente, se retiró el medio, se agregaron diferentes concentraciones de las sustancias de prueba y las células se incubaron en las mismas condiciones durante 1 hora. Una placa se mantuvo en la oscuridad mientras que la otra placa se irradió durante 10 min con una temperatura entre 29 y 32 ◦C. Posteriormente, el medio de las células se reemplazó con DMEM fresco sin rojo fenol y se incubó durante 18 a 22 h. Después de este período de incubación, las células de ambas placas se lavaron con DPBS y se añadió DMEM completo que contenía 50 µg/ml de NR a cada pocillo y se incubaron durante 3 h. Después de la incubación con NR, se eliminó la solución de NR y se añadió una solución desorbente de NR (50 por ciento de etanol: 1 por ciento de ácido acético: 49 por ciento de agua destilada) para extraer el tinte de NR de las células. Para el procedimiento de lectura, la absorbancia se midió a 540 nm. Dentro de cada placa, se probaron los controles de DMSO. Los datos de viabilidad celular obtenidos de cada placa se expresaron como la relación de absorbancia de las células tratadas con respecto a las células de control con disolvente y se usaron además para estimar los valores de IC50 usando un análisis de regresión lineal. El valor del factor de fotoirritación (PIF) para cada sustancia de prueba se calculó como la relación entre el valor IC50 de las células irradiadas (Irr plus) y el valor IC50 de las células no irradiadas (Irr−). Según la directriz de la OCDE, un índice PIF inferior a 2 predice la ausencia de un efecto fototóxico, un índice PIF entre 2 y 5 predice un efecto fototóxico probable y un índice PIF superior a 5 predice un efecto fototóxico [23]. Los compuestos probados se evaluaron en un rango de concentraciones: 12,5; 31,25; 62,5; 125; 250; 500 y 1000 µM. 3.6. Análisis estadístico Todos los datos se presentan como media ± desviación estándar (DE) de al menos tres experimentos independientes realizados por triplicado. Para confirmar la normalidad y homogeneidad de la varianza, se utilizó la prueba de normalidad ómnibus de D'Agostino-Pearson y, posteriormente, el análisis de varianza de una vía (ANOVA), seguido de la prueba post hoc de Dunnett (comparación con células de control negativo con solvente), fue realizado. Los gráficos se generaron con el software GraphPadPrism para Windows (versión 6.0, GraphPad Software, Inc. (San Diego, CA, EE. UU.).

4. Conclusiones

En este estudio, se utilizaron un ensayo de especies reactivas de oxígeno (ROS) y un ensayo de fototoxicidad de absorción de rojo neutro 3T3 (3T3 NRU-PT) para examinar el comportamiento de los antioxidantes fenólicos naturales cuando se exponen a la radiación que imita la luz solar para examinar su fotorreactividad y fototoxicidad. potencial. Los resultados obtenidos permitieron concluir que, aunque la rutina y los ácidos cafeico, pcumárico y ferúlico absorben la radiación de luz UV-visible y presentan MEC superiores a 1000 L mol−1cm−1, se clasifican como no fotorreactivos. Además, estos compuestos no indujeron fototoxicidad cuando se probaron usando la línea celular HaCaT. Los datos encontrados sugieren queestos antioxidantespor sí mismos no se espera que causen fototoxicidad y, por lo tanto, pueden considerarse seguros para su uso en formulaciones cosméticas. Por otro lado, se pudo observar un aumento en la viabilidad de las células expuestas a la radiación en presencia de estos antioxidantes revelando un posible efecto fotoprotector que podría ser interesante de estudiar para sustentar su uso como posibles agentes fotoprotectores en formulaciones cosméticas. En el caso del DOPAC, este compuesto mostró ser fotorreactivo, aunque no se observó fototoxicidad en el ensayo 3T3 Neutral Red Uptake. Sin embargo, se deben realizar más estudios para comprender los mecanismos detrás de la fotorreactividad de DOPAC, para garantizar su fotoseguridad y también para comprender el papel y la relación entre la estructura química y el potencial de un compuesto para ser fotorreactivo. Contribuciones de los autores: Análisis formal, BA; Escritura—Preparación del borrador original, BA; Conceptualización IFA, HC y JG: Recursos, IFA, HC, JMSL y JG; Redacción: revisión y edición, IFA, HC, JMSL y JG; Supervisión, IFA, HC y JG; Adquisición de fondos, IFA, HC, JMSL y JG Todos los autores leyeron y aceptaron la versión publicada del manuscrito. Financiamiento: esta investigación no recibió financiamiento externo. Declaración de la Junta de Revisión Institucional: No corresponde. Declaración de consentimiento informado: No corresponde. Datos Declaración de Disponibilidad: Todos los datos presentados en este estudio están contenidos en el artículo. Agradecimientos: Este trabajo es financiado por fondos nacionales de FCT-Fundação para a Ciência ea Tecnologia, IP, en el ámbito del proyecto UIDP/04378/2020, UIDB /04378/2020 de la Unidad de Investigación en Biociencias Moleculares Aplicadas-UCIBIO y el proyecto LA/P/0140/2020 del AssociateLaboratory Institute for Health and Bioeconomy-i4HB y UIDB/00081/2020 subvencionado por FCT/MCTES (PIDDAC). Conflictos de interés: Los autores declaran no tener conflicto de interés. Disponibilidad de muestra: No aplica.

Referencias

1. Zillich, OV; Schweiggert-Weisz, U.; Eisner, P.; Kerscher, M. Polifenoles como ingredientes activos para productos cosméticos. En t. J. Cosmet. ciencia 2015, 37, 455–464. [Referencia cruzada]
2. Jelena, CH; Jorge, R.; Justina, G.; Neda, MD; Natasa, S.; Arturo, B.; Giuseppe, G. Efectos beneficiosos de los polifenoles en enfermedades crónicas y envejecimiento. En Polifenoles: Propiedades, Recuperación y Aplicaciones; Galanakis, CM, Ed.; Woodhead Publishing: Kidlington, Reino Unido, 2018; págs. 69–102.
3. Cory, H.; Passarelli, S.; Szeto, J.; Támez, M.; Mattei, J. El papel de los polifenoles en la salud humana y los sistemas alimentarios: una mini revisión. Frente. Nutrición 2018, 5, 87. [Referencia cruzada]
4. Fraga, CG; Croft, KD; Kennedy, HACER; Tomás-Barberán, FA Los efectos de los polifenoles y otros bioactivos en la salud humana. Función de alimentos. 2019, 10, 514–528. [Referencia cruzada]
5. Bertelli, A.; Biagi, M.; Corsini, M.; Baini, G.; Cappellucci, G.; Miraldi, E. Polifenoles: De la teoría a la práctica. Alimentos 2021, 10, 2595. [Referencia cruzada]
6. Chen, K.; Lu, P.; Beeraka, Nuevo México; Sukocheva, OA; Madhunapantula, SV; Liu, J.; Sinelnikov, MI; Nikolenko, VN; Bulyguin, KV; Mikhaleva, LM; et al. Mutaciones mitocondriales y mitoepigenética: Centrarse en la regulación de las respuestas inducidas por el estrés oxidativo en los cánceres de mama. Semin. Cáncer Biol. 2020. [Referencia cruzada] [PubMed]

7. Forman, HJ; Zhang, H. Dirigirse al estrés oxidativo en la enfermedad: Promesa y limitaciones de la terapia antioxidante. Nat. Rev. Descubrimiento de Drogas. 2021, 20, 689. [Referencia cruzada] [PubMed]
8. Boo, YC ¿Pueden los compuestos fenólicos de las plantas proteger la piel de las partículas suspendidas en el aire? Antioxidantes 2019, 8, 379. [CrossRef]
9. Jesumani, V.; Du, H.; Pey, P.; Aslam, M.; Huang, N. Estudio comparativo sobre la actividad protectora de la piel del extracto rico en polifenoles y el extracto rico en polisacáridos de Sargassum vachellianum. PLoS ONE 2020, 15, e0227308. [Referencia cruzada] [PubMed]
10. Saraf, S.; Kaur, CD Fitoconstituyentes como nuevas formulaciones cosméticas fotoprotectoras. Farmacogn. Rev. 2010, 4, 1–11. [Referencia cruzada]