Biomonitoreo de micotoxinas en plasma de pacientes con enfermedad de Alzheimer y ParkinsonⅡ

2. Resultados y Discusión

2.1. Análisis LC-MS/MS

Debido a sus diferentes características fisicoquímicas, las micotoxinas se dividieron para su separación cromatográfica en dos grupos (ver sección de material y métodos). Las siguientes figuras (Figuras 1–4) muestran cromatogramas extraídos superpuestos de micotoxinas en calibradores y una muestra de plasma (codificada como muestras 1–4), antes y después del tratamiento enzimático. Como se puede observar, la OTA aparece en las muestras antes y después del tratamiento enzimático (Figura 1; Figura 3); mientras que STER aparece solo después del tratamiento enzimático (Figura 3). Ninguna de las otras micotoxinas analizadas ha sido detectada en las muestras de plasma.

Cada una de las curvas de calibración empleadas en la cuantificación de micotoxinas cumplió con los criterios definidos previamente durante la validación del método. En las tablas S1 y S2 se presentan ejemplos de las curvas de calibración obtenidas para cada micotoxina. También se ha evaluado la identidad de los compuestos: se observaron transiciones de calificación (q) y cuantificación (Q) para cada micotoxina detectada en cada uno de los individuos y muestras positivas, y el error relativo (RE) obtenido entre los valores de la relación q/Q para cada micotoxina en los calibradores y en las muestras fue inferior al 20 por ciento [32]. Además, los tiempos de retención no difirieron en muestras y calibradores en más del 2,5 % [33] (1,3 % para OTA antes y 1,6 % después del tratamiento enzimático; 0,3 % para OTB y 1,8 % para STER).

2.2. Muestras de plasma

Se reclutaron un total de 93 sujetos, incluidos 25 controles sanos (CNT) y 68 pacientes del servicio de neurología del Hospital San Pedro de La Rioja (España). Los donantes de control eran acompañantes no emparentados de los pacientes sin enfermedades neurológicas aparentes o diagnosticadas. Los pacientes se dividieron por patologías: 44 pacientes con EP y 24 con EA.

Cápsulas de cistanche tubulosa para la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson

El diagnóstico y evolución de la enfermedad de los pacientes reclutados fue realizado por neurólogos expertos según la escala de Hoehn y Yahr (HY) para EP (Tabla S3) y la Escala Global de Deterioro (GDS) para EA (Tabla S4). Todos los pacientes con EA ya mostraban signos clínicos de deterioro cognitivo leve o demencia (de 3 a 7, escala GDS). Los pacientes con EP se subdividieron en dos grupos, ya que la progresión de la enfermedad era diferente entre los pacientes que no mostraban reflejos posturales alterados (1 y 2, escala HY) y otros que ya mostraban reflejos posturales alterados (de 2,5 a 3, escala HY).

Sin embargo, debido al bajo número de muestras, el análisis estadístico de los pacientes con DP se realizó como un solo grupo. El número de sujetos inscritos para cada grupo y subgrupo se informa, junto con el sexo, el rango de edad y la progresión de la enfermedad, en la Tabla 1. La información individual completa sobre los sujetos reclutados para el estudio se proporciona en los materiales complementarios (Tablas S5 y S6).

2.3. Presencia de Micotoxinas

De las 19 micotoxinas evaluadas, solo se detectaron OTA, OTB y STER en las muestras. La OTA estuvo presente antes y después del tratamiento con la mezcla de glucuronidasa/arilsulfatasa, mientras que la OTB solo fue detectable antes y la STER apareció solo después del tratamiento enzimático. Cabe señalar que debido al volumen limitado de algunas muestras, la evaluación después del tratamiento enzimático fue posible solo para 74 de las 93 muestras recolectadas.

Los resultados analíticos obtenidos para OTA, OTB y STER se resumen en la Tabla 2. Debido a la confirmación de los criterios de identificación (las transiciones q y Q deben estar presentes y compararse con los calibradores RE tanto para la relación q/Q como para el tiempo de retención, que debe ser < 20 por ciento o 2,5 por ciento, respectivamente), se han utilizado muestras con valores superiores o iguales al LOD para el análisis de manejo de datos. Por lo tanto, los cálculos se realizaron adoptando un método de sustitución de límite inferior [34].

Only OTA (77% of the samples) and OTB (13% of the samples) were detected (>LOD) en las muestras procesadas antes del tratamiento enzimático. En cuanto a la presencia de OTA, se encontraron muestras por debajo del LOD en todos los grupos. El nivel máximo de OTA (8,81 ng/mL) correspondió a una mujer de 66 años en el grupo control. Con respecto a la población de control, OTA y OTB estuvieron presentes en el 92 por ciento y el 24 por ciento de las muestras, respectivamente.

Estos resultados están de acuerdo con un estudio reciente realizado en Navarra, una región vecina en España. En ese estudio, la OTA estuvo presente en el 97,3 % y la OTB en el 10 % de las muestras (n=438) [35] medidas con el mismo método que se aplicó en el presente estudio [36]. En el presente estudio, los niveles medios de OTA (2,15 ng/mL) están ligeramente por debajo de los medidos en Navarra (2,87 ng/mL). Los niveles de OTA oscilaron entre LOD y 8,81 ng/mL, mientras que en las muestras de Navarra la concentración de OTA osciló entre LOD y 19,9 ng/mL (con una muestra que alcanzó los 45,7 ng/mL en una mujer de 66-años).

En cuanto al género, y también de acuerdo con el estudio de Navarra [35], se pudo observar que los valores medios de OTA antes del tratamiento enzimático tendían a ser mayores en hombres que en mujeres en todos los grupos. Aunque el porcentaje de muestras positivas para OTA está de acuerdo con estudios previos realizados en España, los niveles medios y máximos de OTA en la población de CNT del presente estudio y el reciente estudio de Navarra [35] son ​​más altos que los de estudios previos de España .

Como esta información se obtuvo antes de 2011, nuestros datos respaldan la necesidad de continuar con el biomonitoreo de los niveles de micotoxinas en la población general. Como se observó previamente [35], la OTB estuvo presente en algunas muestras y siempre coincidió con la OTA (excepto en un hombre CNT). Sorprendentemente, no se detectó OTB en el grupo AD. La OTB es el análogo desclorado de la OTA y no se ha medido en los estudios de biomonitoreo en humanos realizados hasta el momento.

La OTB puede estar presente en muestras humanas, ya que se sabe que está presente en algunas matrices alimentarias, como el vino [37], pero también podría ser un metabolito humano de la OTA [38]. Desafortunadamente, en el presente estudio es imposible discriminar entre las posibles fuentes de OTB o saber si la ausencia de OTB en el grupo AD podría deberse a un patrón de consumo de alimentos diferente de los pacientes o a un metabolismo diferente debido a la enfermedad, o si se debe al bajo número de muestras analizadas. El análisis de los datos después del tratamiento enzimático reveló que aún se detectaba OTA (89 por ciento de las muestras).

Además, como se observó previamente en los donantes sanos de Navarra [35], STER apareció en la mayoría de las muestras (88 por ciento), mientras que OTB ya no se detectó. Al comparar la presencia de OTA antes y después del tratamiento enzimático, el porcentaje de muestras positivas antes del tratamiento enzimático en CNT fue mayor que en pacientes; mientras que, tras el tratamiento enzimático, la presencia de OTA disminuyó para CNT mientras que aumentó en los pacientes con EA y EP. Algunos autores apoyan la hipótesis de que los conjugados de OTA podrían formarse durante el metabolismo humano [39–41].

However, more data are needed to understand and monitor the human metabolism of OTA. In this study, and again in line with the study conducted in Navarra, STER only appeared after treating the samples with β-glucuronidase/arylsulfatase and this mycotoxin was found positive (>LOD) en el 88 por ciento de las muestras analizadas. Estos datos respaldan la hipótesis de que los STER-glucurónidos se forman durante el metabolismo humano [35,42].

2.4. Análisis estadístico

De acuerdo con los resultados analíticos, los cálculos estadísticos se realizaron solo para OTA y STER. OTB no se incluyó en el análisis estadístico porque solo 12 muestras (13 por ciento) fueron mayores o iguales que LOD. Se rechazó la hipótesis de distribución de normalidad (prueba de Shapiro-Wilk), por lo que para el tratamiento estadístico se utilizaron pruebas no paramétricas, que no implican ningún supuesto de distribución. STER se detectó solo después del tratamiento enzimático, por lo tanto, el análisis estadístico para STER se realizó sobre los 74 resultados disponibles obtenidos después de la digestión enzimática. Por otra parte, para la OTA se disponía de dos conjuntos de datos de resultados, el obtenido antes del tratamiento enzimático y el obtenido después del tratamiento enzimático (es decir, OTA antes y después).

Debido a lo incompleto de la OTA después del conjunto de datos (74 registros), se decidió realizar cálculos estadísticos teniendo en cuenta solo la OTA antes del conjunto de datos (93 registros). Para confirmar la decisión de excluir la OTA después del conjunto de datos, se realizó una prueba de rangos con signo de pares emparejados de Wilcoxon para explorar las posibles diferencias entre los resultados emparejados de la OTA antes y después de los conjuntos de datos.

La prueba no resaltó ninguna diferencia significativa cuando se aplicó a los valores de OTAantes y OTAdespués del grupo de población total (n=74, z=−1.438, valor de p=0.1503), lo que confirma que el conjunto de datos completo de OTAbefore se ajusta a las evaluaciones estadísticas. Como se mencionó anteriormente, no se dispone de estudios previos que monitoreen las micotoxinas en muestras de plasma de pacientes con EP o AD. Por lo tanto, para capturar todas las diferencias y asociaciones posibles de los niveles de concentración de OTA y STER entre grupos y subgrupos, se realizó la prueba de suma de rangos de Wilcoxon o la prueba de Kruskal-Wallis para la comparación de múltiples variables.

Además, se exploraron posibles diferencias con significación estadística dividiendo los grupos por sexo y enfermedad (pacientes con EP y EA), teniendo en cuenta también el estadio de la enfermedad (escala HY o GDS). Un resumen de todas las diferencias, que fueron estadísticamente significativas (valor de p < 0.050) al comparar las distribuciones de OTA o STER entre grupos, entre CNT y el grupo de pacientes (en conjunto y como grupo de DP y AD), entre sexos y entre grupos en cada sexo y variable de sexo, se muestran en la Tabla 3.

Se encontró que las diferencias entre los niveles de distribución de OTA eran estadísticamente significativas al comparar el grupo CNT, PD y AD, pero esta diferencia (valor de p=0.0447) está guiada por la comparación PD/AD (p- valor=0.0114), siendo la EP el grupo de pacientes caracterizado por valores más elevados. Al considerar el estadio de la enfermedad, comparando las distribuciones del subgrupo 1 de PD y el subgrupo 2 de PD, no se observaron diferencias, lo que indica que en el grupo de PD, el estadio de la enfermedad no influye en la diferencia en la distribución. En la comparación de género, los niveles de OTA de hombres y mujeres comparados dieron diferencias estadísticas en todos los sujetos o en el grupo de pacientes (PD más EA), mostrando los hombres niveles siempre más altos que las mujeres.

Por lo tanto, las distribuciones de OTA no son diferentes en comparación con los grupos de pacientes y CNT, pero parece que el género podría actuar como un factor impulsor de las diferencias en las distribuciones del nivel de OTA más que la enfermedad diagnóstica. Además, al probar las diferencias de las distribuciones de OTA para hombres y mujeres por separado, entre grupos (CNT, PD, AD) la prueba no mostró ninguna diferencia.

El análisis estadístico de los niveles de STER entre el grupo de CNT y de pacientes mostró distribuciones estadísticamente diferentes (valor p < 0.0001), siendo los valores de CNT inferiores. El grupo CNT/PD/AD mostró distribuciones estadísticamente diferentes (p-value=0.0001) y la diferencia también se confirmó comparando CNT/PD y CNT/AD (p-value < 0.0001 en ambos casos), con una valor medio más bajo en el grupo AD.

Por tanto, en los niveles de STER la distribución del grupo CNT siempre fue diferente en las comparaciones con pacientes y grupos de enfermedad. Al comparar las distribuciones de género, entre hombres y mujeres, se destacó cualquier diferencia estadística, los niveles de STER en los grupos individuales de hombres y mujeres fueron diferentes en todas las comparaciones (CNT/PD/AD, CNT/grupo de pacientes, CNT/PD, CNT/AD), y los hombres y mujeres en el grupo CNT siempre fueron más bajos que en los grupos de pacientes.

Esto sugiere que el diagnóstico de la enfermedad puede influir en las distribuciones de los niveles de STER. También se investigaron las diferencias entre los niveles de concentración de OTA y STER comparando las distribuciones de los dos grupos de pacientes (PD y AD) en cada sexo (en hombres y mujeres) y comparando la escala de enfermedad, GDS en el grupo de pacientes con AD y la escala HY en el grupo de pacientes con EA, y no se planteó ninguna diferencia estadística. Ni la distribución OTA ni la distribución STER mostraron ninguna diferencia, además de comparar la escala HY como la variable binaria HY_d=0 (subgrupo PD 1, escala HY en el rango 1–2) y HY{{6 }}d=1 (PD Subgrupo 2, escala HY en el rango 2.5–3).

Así, comparando el comportamiento de distribución de OTA y STER, se señala que las diferencias de OTA están dentro del género (con M > W) y dentro de los grupos de pacientes (PD > AD), y en todas las comparaciones se presentó una marcada diferencia estadística. En cuanto a STER, se registran diferencias en las distribuciones para comparar CNT y grupo de pacientes (grupo de pacientes > CNT), y todas las valoraciones siempre probaron una diferencia estadística. Por otro lado, las dos micotoxinas investigadas no enfatizaron ninguna diferencia a través de la exploración dentro de los subgrupos de pacientes y/o el estadio de la enfermedad.

Hasta donde sabemos, no hay otros estudios disponibles para comparar los niveles de micotoxinas en pacientes con enfermedades neurodegenerativas. Sin embargo, algunos autores han sugerido la necesidad de evaluar más a fondo el papel de las micotoxinas en el deterioro de las manifestaciones clínicas de los trastornos del espectro autista [43,44].

De hecho, los autores destacaron diferencias estadísticamente significativas al comparar las micotoxinas (DON, DOM-1 en orina y AFM1, OTA y FB1 en plasma) entre los grupos de niños autistas y de control. Los resultados del presente estudio también están en línea con un estudio más reciente de nuestro grupo [45], en el que se encontró que la incidencia de OTA y las concentraciones plasmáticas eran más altas en los niños del grupo de control que en los niños con trastornos del espectro autista o déficit de atención con hiperactividad.

En cuanto a la influencia del sexo, y según los resultados de este estudio, en la mayoría de los estudios publicados, los niveles plasmáticos de OTA en hombres eran más altos que en mujeres [46]; aunque Warensjö et al. (2020) en adolescentes suecos [47], y Coronel et al. (2011) [48] no encontraron diferencias en los niveles plasmáticos de OTA entre hombres y mujeres. Finalmente, para evaluar la relación entre los niveles de OTA y STER en plasma y la variable edad, se calculó el coeficiente de correlación de rangos (rho) de Spearman.

Todos los rho con significación estadística (valores p < 0.050) se resumen en la Tabla 4. En general, se encontraron correlaciones negativas y positivas débiles: OTA y STER se correlacionan débilmente con la edad. En particular, los niveles de OTA disminuyen con la edad (correlaciones negativas, rho < 0), y el valor de rho aumenta cuando se selecciona el grupo de TP o el grupo de hombres; además, el valor de rho es aún mayor cuando se seleccionan los valores de hombres en el grupo DP. Por el contrario, las correlaciones STER son positivas y estadísticamente significativas cuando se selecciona el grupo de mujeres.

Para representar las correlaciones observadas, los diagramas de dispersión OTA/hombres en el grupo de pacientes con EP y STER/mujeres en todos los sujetos se informan en la Figura 5. Muestran el diagrama de dispersión de dos variables para toxinas y edad, y la línea ajustada ayuda a visualizar la correlación.

El mecanismo de Cistanche para tratar la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Alzheimer

Cistanche es una hierba china tradicional que se ha utilizado durante muchos años por sus posibles beneficios para la salud. En estudios recientes, se ha encontrado que Cistanche puede tener efectos neuroprotectores y puede ser eficaz en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer (EA) y la enfermedad de Parkinson (EP).

El mecanismo de Cistanche en el tratamiento eficaz de la EA y la EP se atribuye a sus componentes activos, como el equinacósido, el acteósido y los cistanósidos. Se cree que estos compuestos tienen propiedades antioxidantes y antiinflamatorias que pueden reducir el estrés oxidativo y la inflamación en el cerebro, que están asociados con el desarrollo y la progresión de enfermedades neurodegenerativas.

Cistanche también puede promover el crecimiento de las células nerviosas y mejorar la función cognitiva al aumentar los niveles del factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), una proteína que juega un papel crucial en el crecimiento y mantenimiento de las neuronas. Además, se ha demostrado que Cistanche reduce las placas de -amiloide, que son características distintivas de la enfermedad de Alzheimer, y disminuye la acumulación de -sinucleína en el cerebro, que está asociada con la enfermedad de Parkinson.

En general, los beneficios terapéuticos potenciales de Cistanche en el tratamiento de la EA y la EP son prometedores, pero se necesitan más estudios para dilucidar sus mecanismos de acción exactos y confirmar su eficacia y seguridad en entornos clínicos.

continuará...

Beatriz Arce-López 1 , Lydia Alvarez-Erviti 2 , Barbara De Santis 3 , María Izco 2 , Silvia López-Calvo 4 , Maria Eugenia Marzo-Sola 4 , Francesca Debegnach 3 , Elena Lizarraga 1 , Adela López de Cerain 5,6 , Elena González-Peñas 1,† y Ariane Vettorazzi 5,6,* ,†

1 Departamento de Tecnología y Química Farmacéutica, Grupo de Investigación MITOX, Facultad de Farmacia y Nutrición, Universidad de Navarra, 31008 Pamplona, ​​España; barce@alumni.unav.es (BA-L.); elizarraga@unav.es (EL); mgpenas@unav.es (EG-P.)

2 Laboratorio de Neurobiología Molecular, Centro de Investigaciones Biomédicas de La Rioja (CIBIR), Piqueras 98, 3ª Planta, 26006 Logroño, España; laerviti@riojasalud.es (LA-E.); mizco@riojasalud.es (MI)

3 Laboratorio Nacional de Referencia para Micotoxinas y Toxinas Vegetales, Istituto Superiore di Sanità, 00161 Roma, Italia; barbara.desantis@iss.it (BD); francesca.debegnach@iss.it (DF)

4 Servicio de Neurología, Hospital San Pedro, Piqueras 98, 26006 Logroño, España; slcalvo@riojasalud.es (SL-C.); memarzo@riojasalud.es (MEM-S.)

5 Department of Pharmacology and Toxicology, Research Group MITOX, School of Pharmacy and Nutrition, Universidad de Navarra, 31008 Pamplona, Spain; acerain@unav.es 6 IdiSNA, Navarra Institute for Health Research, 31008 Pamplona, Spain