Biomonitoreo De Micotoxinas En Plasma De Pacientes Con Enfermedad De Alzheimer Y ParkinsonⅢ
Apr 12, 2023
3 Conclusiones
Presentamos los resultados obtenidos en un primer estudio de HBM sobre el análisis de 19 micotoxinas y metabolitos en muestras de plasma de voluntarios sanos y pacientes (AD y PD) en La Rioja (España). Los resultados del estudio sugieren algunas diferencias entre el control y los pacientes en los niveles de OTA y STER. La razón detrás de esta diferencia es desconocida. Varios factores pueden estar influyendo en el resultado observado, como las diferencias en las dietas, el metabolismo alterado debido a la enfermedad o el hecho de que el sexo y la edad pueden tener un papel importante en los niveles de micotoxinas detectados en plasma.
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Todos estos factores de confusión deben evaluarse cuidadosamente con estudios que incluyan un mayor número de individuos. En el presente estudio se han observado diferencias en la OTA entre acompañantes sanos y pacientes, pero las diferencias parecen estar más relacionadas con el género que con la propia enfermedad. Además, la OTA tendió a disminuir con la edad, especialmente en el grupo de DP. Uno de los principales hallazgos es que STER apareció solo después del tratamiento con -glucuronidasa/arilsulfatasa, lo que respalda la hipótesis de que los STER-glucurónidos se forman durante el metabolismo humano. Además, se encontró que los niveles plasmáticos de STER eran más altos en los pacientes, sin diferencias entre patologías. Además, los niveles de STER se correlacionaron positivamente con la edad en las mujeres.
Al interpretar los datos, es importante señalar que el presente estudio no fue diseñado para explicar la patobiología de la EP o la EA, sino para explorar si la presencia de un posible factor de riesgo ambiental puede actuar como agentes perturbadores involucrados en el gen– interacción del entorno. Las muestras del grupo de control coinciden con los datos anteriores obtenidos en una población similar en una región vecina de España y utilizan el mismo análisis LC/MS-MS [35].
Sin embargo, al comparar individuos sanos entre ambos estudios, se debe tener en cuenta que: (i) el rango de edad es diferente, ya que la mayoría de las muestras en el presente estudio se obtuvieron de personas mayores de 60 años, especialmente en los grupos AD y PD , como se esperaba para las enfermedades relacionadas con la edad; y (ii) el número de muestras de control que es bajo en el presente estudio. Además, también se deben tener en cuenta otras limitaciones al interpretar los datos del presente estudio; muchos de los datos estaban muy cerca del LOD y el número de muestras era limitado (especialmente en hombres con AD). En general, nuestros resultados muestran algunas diferencias estadísticamente significativas entre el grupo de control y los pacientes con enfermedades neurodegenerativas, pero también apuntan a algunas respuestas relacionadas con la edad y el sexo que, a su vez, podrían influir en el metabolismo.
4. Materiales y Métodos
4.1. reactivos
LC-MS grade methanol (Honeywell Riedel-de-Haën, Seelze, Germany), LC grade acetonitrile (ACN) (Merck, Darmstadt, Germany), MS grade formic acid (purity > 98%), ammonium formate (both from Fluka Sigma-Aldrich, Mannheim, Germany), and deionized water (>18 MΩ cm−1 de resistividad) purificados en un sistema Ultramatic Tipo I (Wasserlab, Navarra, España) para la preparación de muestras y análisis LC-MS/MS. Los cartuchos Captiva EMR-lipid (3 ml) se obtuvieron de Agilent Technologies (Santa Clara, CA, EE. UU.).
Todas las micotoxinas (material de referencia, pureza mayor o igual al 98 por ciento) se compraron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.) como soluciones de ACN en las siguientes concentraciones AFM1, AFG2 y AFB2: 0. 5 µg/ml; AFG1 y AFB1: 2 µg/mL; OTA-d5 y OTB: 10 µg/mL; STER y DOM-1: 50 µg/mL; NIV, DON, 3-ADON, 15-ADON, NEO, DAS, FUS-X, ZEA y toxinas T-2 y HT-2: 100 µg/mL. Los materiales de referencia se almacenaron a −20 ◦C. Las soluciones madre estándar se prepararon en ACN y se almacenaron a -20 ◦C. La solución de trabajo, que incluye todas las micotoxinas, se preparó diluyendo las correspondientes soluciones madre individuales en ACN. La estabilidad de las soluciones madre estándar y de trabajo en estas condiciones de almacenamiento se evaluó previamente [36].
4.2. Asuntoects
Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes antes de la inclusión en el estudio. Un total de 94 sujetos, incluidos 44 pacientes con EP leve, 25 pacientes con demencia no relacionada con la EP y 25 controles sanos, fueron reclutados del servicio de neurología del Hospital San Pedro de La Rioja (España) con aprobación ética ("Estudio de perfiles lipídicos en muestras de suero/plasma de pacientes con enfermedad de Parkinson para la obtención de un patrón clínico diferencial con fines diagnósticos" Ref: CEICLAR PI- 212, aprobado el 4 de abril de 2016) del comité ético local de experimentación humana (CEImLar , Comité Ética de Investigación con medicamentos de La Rioja). Los pacientes fueron diagnosticados por neurólogos experimentados. Los pacientes con EP fueron evaluados por la escala HY modificada (Tabla S3) mientras que los pacientes con demencia no relacionada con la EP fueron evaluados por el GDS (Tabla S4) para determinar el estadio de su enfermedad. Los controles sanos incluyeron cónyuges o acompañantes no emparentados de pacientes sin enfermedades neurológicas o comorbilidades aparentes o conocidas.
4.3. plasmamá
Recolección Las muestras de sangre se obtuvieron en una visita médica. La sangre se recogió en tubos recubiertos con EDTA de 4 ml (Vacutainer, ref. n.º 368171) y el plasma se separó en 2 horas mediante centrifugación a 2200 × g durante 15 minutos a temperatura ambiente. El plasma se extrajo inmediatamente y se transfirió a viales codificados en alícuotas de 0,2 ml para evitar ciclos repetidos de congelación/descongelación y luego se almacenó a -80 ◦C. Se tuvo el cuidado apropiado para evitar la contaminación de las muestras de plasma con células o componentes del sedimento obtenido de la centrifugación.
4.4. Preparación de muestrasción
El tratamiento con plasma antes y después de la hidrólisis enzimática fue como se describe en ArceLópez et al. (2020) [35,36]. De forma concisa, las muestras de plasma (400 µl) se añadieron a un cartucho de lípidos Captiva EMR, que contenía 1200 µl de ACN acidificado (ácido fórmico al 1 por ciento). Se aplicó el vacío y después de 5 min, se separaron dos alícuotas de 400 µL (una para cada uno de los grupos de micotoxinas que se investigarán) del efluente y luego se evaporaron a sequedad (60 ◦C).
Esta metodología se utilizó para la detección de 19 compuestos (micotoxinas y metabolitos), clasificados en dos grupos (según los diferentes programas de elución necesarios para la separación cromatográfica): DOM-1, AFG2, AFM1, AFG1, AFB2, AFB1 , OTB, ZEA, STER, OTA, T-2, HT-2 (grupo I) y NIV, DON, FUS-X, NEO, 3-ADON, 15-ADON y DAS (grupo II). El residuo se reconstituyó con 200 µL de fase móvil en la proporción correspondiente al grupo de micotoxinas que se pretende analizar (40 por ciento B para el grupo I y 5 por ciento B para el grupo II).
Antes del análisis cromatográfico, la solución se agitó (5 min) y se filtró (PVDF, 0,45 µm, Merck Millipore, Irlanda). El procedimiento para la hidrólisis enzimática fue: 400 µL de plasma fueron tratados con 50 µL de una mezcla de enzimas glucuronidasa/sulfatasa (250 U/mL, 0.2 U/mL en PBS; de Helix Pomatia (Sigma Aldrich, Mannheim, Alemania) Después de la agitación, las muestras se incubaron durante la noche (37 ◦C) en un baño de agua y luego, la limpieza de la muestra de plasma, utilizando cartuchos Captiva-EMR, se llevó a cabo de manera similar a la descrita anteriormente.
4.5. Análisis LC/MS-MS
El análisis LC-MS/MS se realizó en un sistema LC serie 1200 acoplado a un 6410 Triple Quadrupole (QqQ) en modo ESI( plus ), ambos de Agilent Technologies (Mannheim, Alemania). La separación se llevó a cabo a 45 ◦C en una columna Ascentis Express C18 de 2,7 µm de tamaño de partícula 150 × 2,1 mm (Supelco Analytical, St. Louis, MO, EE. UU.) con una fase móvil compuesta por formiato de amonio 5 mM y ácido fórmico al 0,1 %. en agua (A) y formiato de amonio 5 mM y ácido fórmico al 0,1 por ciento en metanol/agua 95:5 (B) en condiciones de gradiente.
El volumen de inyección fue de 20 µL y la elución en gradiente se llevó a cabo a un caudal de 0,4 mL/min. Los parámetros de adquisición de datos se describen en Arce-López et al. (2020) [36]. Las muestras fueron analizadas y agrupadas en secuencias analíticas. Cada secuencia incluía, junto con las muestras, ocho calibradores emparejados por matriz.
Estos calibradores se emplearon en la elaboración de curvas de calibración, que sirvieron para la cuantificación de micotoxinas en las muestras analizadas en la misma secuencia. Los criterios de aceptación para las curvas de calibración fueron: un mínimo de seis puntos, un coeficiente de determinación (R2 ) > 0.99 y una concentración retrocalculada para cada calibrador que no difiera (expresada como RE) del valor nominal por más del 15 por ciento (20 por ciento para el nivel LOQ) [32]. Además, los tiempos de retención no deben diferir en más del 2,5 % entre las muestras y los calibradores [33]. Dependiendo del volumen de plasma disponible, no todas las muestras pudieron ser analizadas después del tratamiento enzimático.
4.6. Validación de métodos analíticos
Validación de ambos procedimientos (antes y después de la hidrólisis enzimática) siguiendo las directrices de la FDA y la UE como se describe en Arce-Lopez et al. (202{{10}}) [35,36]. Los valores LOD fueron: 1,35 ng/mL para DOM-1; 0.35 ng/mL para AFG2, 0.18 ng/mL para AFM1; 0.07 ng/mL para AFG1 y AFB2; 0.04 ng/mL para AFB1; 2,70 ng/mL para HT-2; 0,40 ng/mL para OTA y OTB; 0,20 ng/mL para T-2 y STER; 1,80 ng/mL para ZEA; 9,10 ng/mL para VNI; 1,94 ng/mL para DON; 1,95 ng/mL para FUS-X; 0,18 ng/mL para NEO; 0,70 ng/mL para 3-ADON; 1,20 ng/mL para 15-ADON y 0,15 ng/mL para DAS.
Los valores de recuperación (en condiciones de precisión intermedia) antes del tratamiento enzimático fueron del 68,8 por ciento para STER al 97,6 por ciento para DAS (RDS menor o igual al 15 por ciento para todas las micotoxinas) y no se encontraron diferencias después del tratamiento enzimático. También se evaluaron los efectos de la matriz antes y después del tratamiento enzimático, y no hubo diferencias en la mayoría de las micotoxinas, obteniendo valores de RDS menores o iguales al 15 por ciento para todas ellas. La estabilidad después de dos ciclos de congelación y descongelación se evaluó en dos niveles de concentración (6 y 30xLOQ) (tres repeticiones por nivel). Todas las micotoxinas fueron estables (RSD < 15 por ciento) (Tabla S7).
4.7. Análisis Estadístico y Manejo de Datos
Al tratar datos analíticos con estadísticas, es importante dilucidar el tipo de distribución que caracterizó el conjunto de datos. Los descriptores y las pruebas de paquetes que se utilizarán son diferentes si tenemos datos con distribución normal o con distribución no normal. Se utilizó la prueba de Shapiro-Wilk para verificar la distribución normal de los niveles de concentración de micotoxinas investigadas.
Como se rechazó la hipótesis de normalidad, se utilizó un conjunto de pruebas no paramétricas (que no implica ningún supuesto de distribución) para el tratamiento estadístico. Para evaluar las posibles diferencias entre los niveles de concentración de OTA y STER en grupos y subgrupos, se utilizó la prueba de suma de rangos de Wilcoxon (estadística de dos muestras de Mann-Whitney) [49]. En estadística, la prueba de suma de rangos de Wilcoxon es una prueba no paramétrica utilizada para probar si es probable que dos muestras se deriven de la misma población verificando que para dos valores X e Y seleccionados al azar de las dos poblaciones, la probabilidad de que X sea mayor que Y es igual a la probabilidad de que Y sea mayor que X.
Con el mismo propósito, se utilizó una prueba de Kruskal-Wallis donde el cotejo de variables implicaba más de una distribución [50]. Para evaluar la correlación entre los niveles de micotoxinas y la edad (variable cuantitativa) se utilizó el coeficiente de correlación de rangos de Spearman (o rho de Spearman). Todas las pruebas se realizaron con un nivel de significación del 5 por ciento. Los resultados se informan junto con el nivel de significación estadística y el valor p. Todos los análisis se realizaron con el software STATA14 (Stata/IC 14.0, Copyright 1985–2015 StataCorp LP). En cuanto al manejo de datos para la configuración del conjunto de datos, las variables cuantitativas y cualitativas fueron tratadas de la siguiente manera: nivel de OTA y STER. Variable cuantitativa, variable no negativa expresada en valores en ng/mL.
Los valores se asignaron de la siguiente manera: Valor=0 ng/mL; cuando se encontró el resultado analítico derivado del análisis
Se utilizó una variable cuantitativa para escalar el diagnóstico de los pacientes con EP (Tabla S3). Además, se definió una variable binaria (HY_d=0 y HY_d=1): HY_d=0 para PD pacientes que puntuaron en la escala HY en el rango 1-2 (reflejos posturales no alterados); HY_d=1 para pacientes con EP que puntuaron en la escala HY en el rango de 2,5 a 3 (reflejos posturales deteriorados). escala GDS. Se utilizó una variable cuantitativa para escalar el diagnóstico de los pacientes con EA (Tabla S4).
El mecanismo de Cistanche para tratar la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson
Cistanche es una hierba china tradicional que se ha utilizado durante muchos años por sus posibles beneficios para la salud. En estudios recientes, se ha encontrado que Cistanche puede tener efectos neuroprotectores y puede ser eficaz en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer (EA) y la enfermedad de Parkinson (EP).
El mecanismo de Cistanche en el tratamiento eficaz de la EA y la EP se atribuye a sus componentes activos, como el equinacósido, el acteósido y los cistanósidos. Se cree que estos compuestos tienen propiedades antioxidantes y antiinflamatorias que pueden reducir el estrés oxidativo y la inflamación en el cerebro, que están asociados con el desarrollo y la progresión de enfermedades neurodegenerativas.
Cistanche también puede promover el crecimiento de las células nerviosas y mejorar la función cognitiva al aumentar los niveles del factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), una proteína que juega un papel crucial en el crecimiento y mantenimiento de las neuronas. Además, se ha demostrado que Cistanche reduce las placas de -amiloide, que son características distintivas de la enfermedad de Alzheimer, y disminuye la acumulación de -sinucleína en el cerebro, que está asociada con la enfermedad de Parkinson.
En general, los beneficios terapéuticos potenciales de Cistanche en el tratamiento de la EA y la EP son prometedores, pero se necesitan más estudios para dilucidar sus mecanismos de acción exactos y confirmar su eficacia y seguridad en entornos clínicos.
Referencias
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Beatriz Arce-López 1 , Lydia Alvarez-Erviti 2 , Barbara De Santis 3 , María Izco 2 , Silvia López-Calvo 4 , Maria Eugenia Marzo-Sola 4 , Francesca Debegnach 3 , Elena Lizarraga 1 , Adela López de Cerain 5,6 , Elena González-Peñas 1,† y Ariane Vettorazzi 5,6,* ,†
1 Departamento de Tecnología y Química Farmacéutica, Grupo de Investigación MITOX, Facultad de Farmacia y Nutrición, Universidad de Navarra, 31008 Pamplona, España; barce@alumni.unav.es (BA-L.); elizarraga@unav.es (EL); mgpenas@unav.es (EG-P.)
2 Laboratorio de Neurobiología Molecular, Centro de Investigaciones Biomédicas de La Rioja (CIBIR), Piqueras 98, 3ª Planta, 26006 Logroño, España; laerviti@riojasalud.es (LA-E.); mizco@riojasalud.es (MI)
3 Laboratorio Nacional de Referencia para Micotoxinas y Toxinas Vegetales, Istituto Superiore di Sanità, 00161 Roma, Italia; barbara.desantis@iss.it (BD); francesca.debegnach@iss.it (DF)
4 Servicio de Neurología, Hospital San Pedro, Piqueras 98, 26006 Logroño, España; slcalvo@riojasalud.es (SL-C.); memarzo@riojasalud.es (MEM-S.)
5 Department of Pharmacology and Toxicology, Research Group MITOX, School of Pharmacy and Nutrition, Universidad de Navarra, 31008 Pamplona, Spain; acerain@unav.es 6 IdiSNA, Navarra Institute for Health Research, 31008 Pamplona, Spain
