La inhalación breve de sevoflurano puede reducir la formación de cicatrices gliales después de una lesión cerebral hipóxico-isquémica en ratas neonatales, parte 3

SPC regula positivamente la expresión HIF-1 en el hipocampo

En un estudio anterior, encontramos que el poscondicionamiento con sevoflurano atenuó la astrogliosis y la formación de cicatrices gliales en el hipocampo, y mejoró el deterioro del aprendizaje y la memoria después de la HI.

La cicatrización glial es una enfermedad relacionada con el sistema nervioso. La enfermedad a menudo se asocia con pérdida de memoria y causa una angustia significativa a los pacientes. Sin embargo, debemos darnos cuenta de que existe una fuerte relación entre las cicatrices gliales y la memoria, pero eso no significa que la memoria vaya a decaer inevitablemente.

Durante el tratamiento de las cicatrices gliales, es muy importante una actitud positiva y métodos de tratamiento correctos. Debemos esforzarnos por mantener una actitud optimista, alentar a los pacientes a que se sometan a un tratamiento adecuado y brindarles la ayuda necesaria.

Además, una dieta adecuada y el ejercicio son formas importantes de ayudar a prevenir y tratar las cicatrices gliales. Una dieta rica y equilibrada puede proporcionar suficientes nutrientes para ayudar al cuerpo a recuperarse. El ejercicio adecuado puede promover la circulación sanguínea y el metabolismo y mejorar la inmunidad del cuerpo.

En conclusión, aunque las cicatrices gliales pueden afectar la memoria, una actitud positiva y el tratamiento adecuado pueden ayudarnos a superar las dificultades y mantener un cuerpo sano y una mente alerta. Por tanto, afrontemos los desafíos con actitud positiva y avancemos con valentía. Se puede ver que necesitamos mejorar la memoria, y Cistanche deserticola puede mejorar significativamente la memoria, porque Cistanche deserticola también puede regular el equilibrio de los neurotransmisores, como aumentar los niveles de acetilcolina y factores de crecimiento. Estas sustancias son muy importantes para la memoria y el aprendizaje. Además, Cistanche deserticola también puede mejorar el flujo sanguíneo y promover el suministro de oxígeno, lo que puede garantizar que el cerebro reciba suficientes nutrientes y energía, mejorando así la vitalidad y la resistencia del cerebro.

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Se confirmó que HIF{{0}} es un factor clave en este mecanismo neuroprotector (Yang et al., 2019). Para investigar más a fondo la regulación específica inducida por el sevoflurano, examinamos la expresión de la proteína HIF-1 en el hipocampo 12 , 24 y 48 horas después del SPC. Nuestros resultados revelaron cambios dinámicos en la expresión de HIF-1: 12 horas después del tratamiento, se observó un aumento de la expresión de HIF-1 en los grupos HI y HIS en comparación con el grupo simulado (P <0,0001), pero prácticamente no hubo diferencias entre HIF. y HISgroups (Figura 7A y B).

Veinticuatro horas después del SPC, la expresión de HIF1 disminuyó en el grupo HI en comparación con el grupo HIS (P < 0.001) pero aún aumentó en comparación con el grupo simulado (P <0,001; Figura 7C). .

Cuarenta y ocho horas después de la SPC, la expresión HIF-1 en el grupo HI volvió a un nivel muy bajo y no fue diferente del grupo simulado; sin embargo, la expresión de HIF-1 todavía se mantuvo en un nivel muy alto en el grupo HIS (P < 0.01; Figura 7D). A continuación, examinamos la expresión del ARNm de HIF-1 ( en relación con GAPDH) en el hipocampo 12, 24 y 48 horas después de SPC mediante análisis de PCR en tiempo real.

Los resultados revelaron que la expresión del ARNm de HIF{{0}} alcanzó su punto máximo 24 horas después de HI (P <0,001; Figura 7E), y no hubo diferencias obvias entre los grupos HI y HIS en los tres momentos examinados. Por lo tanto, la regulación dinámica de HIF-1 inducida por sevoflurano probablemente implicó una regulación postraduccional, lo que está en línea con nuestra hipótesis.

Para investigar más a fondo nuestra hipótesis de que SPC reduce la astrogliosis después de una lesión por HI en ratas neonatales mediante la regulación positiva de DJ-1 para inhibir la ubiquitilación de HIF-1, examinamos la expresión de las proteínas VHL y DJ-1 (Figura 8A).

La proteína VHL interactúa físicamente con DJ{{0}} (Parsanejad et al., 2014), como se analizó en una pantalla de espectrometría de masas imparcial y se confirmó en un modelo de PD. Nuestros hallazgos indicaron que DJ-1 podría inhibir la ubiquitilación dependiente de VHL y estabilizar la expresión de HIF-1. Además, nuestros resultados mostraron que la expresión de VHL disminuyó cuando la expresión de DJ-1 aumentó en el grupo HIS en comparación con el grupo HIS. Grupo HI (P <0,05; Figura 8B y C).

El inhibidor de HIF-1 YC-1 atenúa la mejora del aprendizaje y la memoria inducida por el sevoflurano

La EHI neonatal produce muchos efectos negativos a largo plazo; Una de las disfunciones más graves es el deterioro del aprendizaje y la memoria. Abundante evidencia ha demostrado que el SPC puede proteger contra el daño del HI y mejorar la función de aprendizaje y memoria (Wang et al., 2019a; Xue et al., 2019; Yanget al., 2019).

Inyectamos YC{{0}}, un inhibidor de HIF-1, para verificar si el mecanismo protector del sevoflurano está relacionado con HIF-1. El laberinto acuático de Morris se utilizó para evaluar el aprendizaje y el reconocimiento en los días 29 a 34 después de la cirugía (Figura 9A). Hubo diferencias manifiestas en la latencia de escape entre los grupos HI y HIS (P <0.0001). El tratamiento con YC-1 aumentó notablemente la latencia de escape después de la exposición al sevoflurano (P <0,01; Figura 9B).

En la prueba de sonda espacial, el grupo HIS obtuvo mejores resultados que HI (P < {{0}}.01) y HIS + YC-1 (P < 0,05; Figura 9C). Sin embargo, el grupo de inyección de YC-1 no mostró una mejora marcada en comparación con el grupo de HI. Aparte de esto, no se observó deterioro motor según los resultados de las pruebas de velocidad de natación o suspensión (P > 0,05; Figura 9D y E).

Los resultados de las pruebas de campo abierto no revelaron diferencias en el tiempo pasado en el centro ni en la distancia total recorrida entre los grupos (P > 0.05; Figura 9F-H), lo que indica que no hubo divergencia en la actividad locomotora ni en el comportamiento de ansiedad entre los cuatro grupos.

Discusión

En este estudio se utilizó el modelo clásico de Rice-Vannucci para evaluar los efectos del SPC en la HIE en ratas P7 (Jevtovic-Todorovicet al., 2003; Grandvuillemin et al., 2017). Nuestros resultados mostraron que: (1) el SPC mejoró el aprendizaje y la memoria a largo plazo en la HIE neonatal al atenuar la astrogliosis excesiva del hipocampo y las cicatrices gliales; (2) el sevoflurano puede inducir la neuroprotección observada al estabilizar la expresión de HIF-1 mediante la inhibición de su ubiquitilación; y (3) la inhibición de la ubiquitilación de HIF-1 por sevoflurano puede inducirse mediante la regulación positiva de DJ-1, que se ha demostrado que es neuroprotector en la EP (Parsanejad et al., 2014) y está regulado por SPC.

Las cicatrices gliales afectan la alineación neuronal y la generación de sinapsis en el cerebro en desarrollo. Aquí, encontramos que el sevoflurano regula positivamente la proteína protectora del cerebro DJ-1, reduce el nivel de ubiquitinación de HIF-1, mejora la cicatrización glial y afecta las funciones de aprendizaje y memoria a largo plazo para ejercer protección cerebral. La mayoría de los bebés nacidos vivos Los que sobreviven a la EHI sufren una disfunción neurológica grave, como parálisis cerebral, epilepsia y, especialmente, deterioro del aprendizaje y la memoria a largo plazo (Edwards et al., 2010; Descloux et al., 2015).

Sin embargo, el tratamiento actual de la EHI se centra principalmente en el tratamiento sintomático (Yuan, 2009). Sólo unos pocos tratamientos, como la hipotermia moderada en todo el cuerpo, pueden proporcionar neuroprotección y mejorar los resultados a largo plazo.

La aplicación del anestésico inhalado sevoflurano después de la EHI neonatal proporciona neuroprotección que puede revertir el daño causado por la EHI, como se ha verificado en estudios con animales (Lai et al., 2016; Kim et al., 2017). La influencia de los anestésicos en el desarrollo del sistema nervioso también ha sido un tema candente de investigación durante muchos años (Archer et al., 2017).

Los efectos de los anestésicos inhalados en el cerebro dependen de la concentración. Los tratamientos de baja concentración y de corta duración tienen efectos protectores sobre el cerebro lesionado, mientras que los tratamientos de alta concentración y de larga duración pueden dañar el tejido cerebral. Sin embargo, aún no se ha aclarado el mecanismo subyacente a la protección contra el daño cerebral.

Por lo tanto, exploramos los mecanismos potenciales del sevoflurano para mejorar la función de aprendizaje y memoria. Los astrocitos son componentes clave del sistema nervioso central en la respuesta a la lesión, incluida la asfixia neonatal (Zhao y Rempe, 2010). En la fase aguda posterior al daño por HI, estas células gliales se activan y comienzan a proliferar.

La proliferación de células gliales es crucial para sellar el sitio de la lesión, remodelar la estructura del tejido del hipocampo y controlar temporal y espacialmente la respuesta inmune local; sin embargo, esta respuesta se vuelve perjudicial en la fase crónica (Pekny y Nilsson, 2005; Pekny et al., 2014). De hecho, esta hipertrofia excesiva de los astrocitos perjudica las estructuras anatómicas del hipocampo.

Más específicamente, nuestros resultados de inmunofluorescencia mostraron que los astrocitos alrededor de la capa piramidal CA1 y CA3, así como en la región DG (especialmente el borde entre la capa de células granulares y el hilio), destruyeron gravemente la estructura normal del tejido. Los procesos de andamios gliales crecieron hasta convertirse en el conjunto de neuronas regulares.

Los resultados morfológicos ilustraron que estas glías radiales que expresan excesivamente GFAP reorientaron sus procesos en una malla densa, que formó una estructura similar a una pared que obstruyó el desarrollo de la sinapsis y perjudicó directamente el aprendizaje y la memoria espacialmente dependientes (Wanner et al., 2008). La prueba del laberinto de agua de Morris, En este estudio se combinó una prueba de comportamiento clásica utilizada para detectar el aprendizaje y la memoria relacionados con el hipocampo (Wu et al., 2018) con resultados de tinción de inmunofluorescencia para proporcionar nueva evidencia de que el sevoflurano podría mejorar el aprendizaje y la memoria al reducir la astrogliosis excesiva y las cicatrices gliales.

No solo disminuyó la intensidad de la inmunofluorescencia de los astrocitos hipertróficos neurocan y GFAPin después del SPC, sino que también disminuyeron los niveles de expresión de proteínas. Mientras tanto, la tinción de Nissl reveló una arquitectura del hipocampo más densa y regular, un citoplasma hipercromático, muy poca pérdida neuronal y una marcada atrofia celular después del SPC.

La tinción de Golgi también proporcionó evidencia de que el SPC podría elevar el número de espinas dendríticas. Otro hallazgo novedoso de este estudio es que SPC reguló positivamente la expresión de los marcadores sinápticos PSD95 y GAP43 en el hipocampo en comparación con el grupo HI.

Este fenómeno indica que, además de atenuar las cicatrices gliales, el sevoflurano puede facilitar la formación de sinapsis en el hipocampo, lo que mejora directamente las funciones de aprendizaje y memoria (Zhanget al., 2015; Lu et al., 2017).

El SPC atenuó la cicatrización glial y la proliferación excesiva de astrocitos en la EHI neonatal durante el desarrollo. El número de dendritaspinas puede elevarse después del SPC, lo que proporciona evidencia de que el sevoflurano puede inducir la formación de sinapsis después de la HI (Roberts et al., 2010). La aplicación de YC-1, un inhibidor de HIF1, revirtió el efecto terapéutico inducido por SPC, lo que indica que la protección de la formación de sinapsis está altamente relacionada con HIF-1.

Como factor de transcripción crucial, HIF-1 tiene varios genes diana que realizan funciones distintas, como procesos implicados en la supervivencia celular, el transporte y el metabolismo de la glucosa y la angiogénesis, después de la isquemia (Ostrowski y Zhang, 2020). Además, HIF{{ 2}} la expresión está estrictamente regulada por varios mecanismos. Estudios anteriores demostraron que HIF-1 no puede existir consistentemente en el tejido cerebral a un nivel alto y efectivo debido a la vía de degradación por ubiquitilación dependiente de oxígeno (Hirayama y Koizumi, 2017).

Por lo tanto, encontrar una manera de mantener los niveles de expresión de HIF puede extender sus efectos protectores después de la HI. Recientemente, se ha propuesto una nueva modalidad de tratamiento, en la que se aplica un poscondicionamiento hipóxico leve después de un período de lesión por HI para aliviar el daño cerebral (Zhan et al., 2012). Se ha verificado que el poscondicionamiento hipóxico reduce la activación de la glial, incluidos los astrocitos y la microglía.

Además, se han observado disminuciones en los marcadores inflamatorios después del poscondicionamiento hipóxico (Teo et al., 2015). Se demostró que el mecanismo potencial subyacente a esta protección está estrechamente relacionado con el mantenimiento de la expresión HIF-1 (Zhu et al., 2014). En la actualidad, el poscondicionamiento de la hipoxia es casi imposible de aplicar en la práctica clínica como tratamiento perjudicial convencional y tiene muchos peligros potenciales. Además, las diferencias individuales en la tolerancia a la hipoxia dificultan la estandarización del control de la dosis del tratamiento poscondicionamiento de la hipoxia (Zhan et al., 2012).

En el caso de la EHI neonatal, es muy probable que un poscondicionamiento inexacto del tratamiento de hipoxia cause una lesión secundaria. Por el contrario, el sevoflurano es más seguro, más suave y más controlable en la práctica clínica y, como se demostró en nuestra investigación, también puede regular positivamente la expresión de HIF-1.

De manera similar a su papel neuroprotector en la EP, DJ-1 parece desempeñar un papel esencial en el SPC en nuestra investigación. El sustrato mejor definido de VHL, un complejo de ubiquitina ligasa E3 ampliamente conocido, es HIF-1 (Zhang et al., 2018). Se ha verificado que DJ-1 interactúa con VHL y puede disminuir eficazmente la expresión de VHL, lo que induce la estabilización de HIF-1 (Parsanejad et al., 2014).

Nuestra hipótesis es que el sevoflurano protege el cerebro contra el daño hipóxico al regular positivamente DJ-1 e inhibir la actividad de ubiquitilación de VHL. Nuestros nuevos hallazgos obtenidos a partir de PCR en tiempo real y análisis de transferencia Western respaldan esta hipótesis. Primero, la diferencia en HIF-1 entre los grupos SPC y HI no fue el resultado de alteraciones transcripcionales.

En segundo lugar, la expresión de VHL disminuyó mientras que la expresión de DJ-1 aumentó en el grupo SPC. En tercer lugar, la estabilización del HIF-1 protegió la formación de sinapsis y la función de aprendizaje y memoria y revirtió la dastrogliosis y la cicatrización glial. Por lo tanto, lo más probable es que el sevoflurano regule HIF-1 mediante la inhibición de la ubiquitilación por VHL a través de una interacción DJ-1. Un estudio anterior demostró que HIF-1 desempeña funciones esenciales en la regulación de las células progenitoras neurales y en la promoción de respuestas. a la hipoxia (Cunningham et al., 2012).

HIF-1 es un regulador intrínseco de la multipotencia de las células progenitoras neurales y de los resultados del desarrollo tras la diferenciación. Investigaciones adicionales demostraron que HIF-1 promovía la diferenciación de células madre neurales en neuronas e inhibía su diferenciación en células gliales mediante la regulación de las vías de señalización Notch y Wnt en la zona subventricular (Lie et al., 2005; Morris et al., 2007; Kuwabara et al., 2009; Mazumdaret al., 2010).

En el hipocampo de ratas neonatales, HIF-1 también puede proporcionar neuroprotección al modular los resultados de la diferenciación de las células progenitoras neurales para atenuar la astrogliosis excesiva. Sin embargo, el mecanismo específico aún no se ha aclarado y requiere más investigación. El estudio actual tuvo varias limitaciones. En primer lugar, no se observaron ni registraron cambios dinámicos en la activación de los astrocitos.

En segundo lugar, no se investigó el mecanismo definitivo por el cual HIF1 reduce la astrogliosis. En tercer lugar, aunque se ha observado que la activación de los astrocitos y la microglía ocurre simultáneamente, nuestro estudio se centró en los astrocitos en lugar de la activación de la microglía o la reacción inflamatoria posterior, lo que sería extremadamente valioso de investigar.

En segundo lugar, el rendimiento de las ratas hembra en la prueba de comportamiento fue ligeramente mejor que el de las ratas macho, y el aumento de células gliales de las ratas hembra también fue ligeramente menor que el de las ratas macho.

Sin embargo, los resultados de las pruebas de comportamiento de los dos sexos no mostraron diferencias estadísticas después del poscondicionamiento con sevoflurano. El mecanismo específico que subyace a los efectos específicos del sexo en el desarrollo después de la HI será investigado en nuestra investigación futura. Además, los métodos genéticos como la eliminación del gen que codifica DJ-1 serían beneficiosos para demostrar si los efectos neuroprotectores del tratamiento con SPC resultan de la inhibición de la ubiquitilación de HIF-1.

Independientemente, nuestros hallazgos indican que el sevoflurano alivia la astrogliosis y la formación de cicatrices gliales en el hipocampo de la rata, y reduce el deterioro del aprendizaje y la memoria después de una lesión HI al estabilizar la expresión de HIF-1. Este mecanismo puede estar relacionado con la regulación positiva inducida por sevoflurano de la proteína neuroprotectora DJ-1, reduciendo así VHL, la ubiquitinligasa de HIF-1. Estos hallazgos proporcionan nuevos objetivos para el tratamiento de la encefalopatía hipóxica isquémica neonatal.

Contribuciones de los autores: Concepción y diseño del estudio: PZ y QSG; implementación experimental: QSG, YHZ y ZYW; análisis de datos: QSG; suministro de reactivos/materiales/herramientas de análisis: HX, CL; redacción en papel:QSG; conocimientos estadísticos, obtención de financiación, apoyo administrativo, técnico o material y supervisión: PZ. Todos los autores aprobaron la versión final del artículo.

Conflictos de intereses: Los autores declaran que no tienen ningún conflicto de intereses. Apoyo financiero: Este estudio fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China, Nos. 81671311, 81870838; el Programa Clave de Investigación y Desarrollo de la Provincia China de Liaoning, No.2018225004; y el Fondo Científico Destacado del Hospital Shengjing de China, n.º 201708 (todos a PZ). Las fuentes de financiación no tuvieron ningún papel en la concepción y el diseño del estudio, el análisis o la interpretación de los datos, la redacción del artículo ni en la decisión de enviar este artículo para su publicación.

Acuerdo de licencia de derechos de autor: el acuerdo de licencia de derechos de autor ha sido firmado por todos los autores antes de su publicación. Declaración de intercambio de datos: los conjuntos de datos analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a solicitud razonable. Verificación de plagio: verificado dos veces por iThenticate. Revisión por pares: revisada por pares externos .

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