La deficiencia de calreticulina altera la biogénesis de los ribosomas y da como resultado un retraso en el desarrollo renal embrionario
Mar 07, 2022
Resumen
La nefrogénesis está impulsada por vías de señalización complejas que controlan el crecimiento y la diferenciación celular. La calreticulina (Calr) chaperona del retículo endoplásmico es bien conocida por su función en el almacenamiento de calcio y en el plegamiento de glicoproteínas. Su papel enriñónEl desarrollo aún no se entiende. Proporcionamos evidencia del papel fundamental de Calr en la nefrogénesis en esta investigación. Mostramos que la deficiencia de Calr da como resultado la formación interrumpida de una zona nefrógena intacta y el retraso de la nefrogénesis, como lo demuestra la alteración en la formación de cuerpos en forma de coma y en forma de s. Usando enfoques proteómicos y transcriptómicos, demostramos que además de una alteración en las proteínas clave de señalización Wnt, embrionarioriñonesde Calr // mostró un deterioro general en la expresión de proteínas ribosómicas que revela alteraciones en la síntesis de proteínas y la nefrogénesis. La inactivación mediada por CRISPR/cas9 confirmó que la deficiencia de Calr está asociada con una deficiencia de varias proteínas ribosómicas y proteínas clave en la biogénesis de los ribosomas. Nuestros datos destacan un vínculo directo entre la expresión de Calr y la biogénesis de los ribosomas.
Introducción
RiñónLa organogénesis se caracteriza por una sucesión de eventos morfogenéticos impulsados por el crecimiento y la diferenciación celular. Durante la nefrogénesis, la transición mesenquimatosa-epitelial (MET) y la ramificación de la yema ureteral (UB), que es el resultado de la inducción recíproca entre la UB y el mesénquima metanéfrico (MM) [1], son las fuerzas impulsoras para la formación de nefronas. Durante este proceso, es necesaria una interacción recíproca y compleja de varias vías de señalización para orquestar la diferenciación epitelial y la formación de la nefrona [1–3]. Entre las vías clave en este proceso, la señalización del factor neurotrófico derivado de la glía (Gdnf) a través de su receptor Ret desempeña un papel central durante un proceso llamado gemación ureteral. La interrupción de esta señalización puede causar uréter ectópico orenalagenesia cuando la señalización está completamente ausente [4]. Aparte de la señalización Gdnf/Ret, se sabe que la señalización canónica Wnt/-catenina coordina múltiples aspectos derenalel desarrollo tanto en el MM como en el UB [5] y la inhibición de la señalización canónica de Wnt en el linaje de la yema ureteral y los progenitores de la nefrona dan como resultadorenalagenesia [6]. El mantenimiento de la reprogramación transcripcional durante la nefrogénesis depende de la accesibilidad a la cromatina [7]. Demostramos que las proteínas de heterocromatina, que se sabe que están involucradas en la regulación epigenética del silenciamiento génico, son indispensables para mantener el equilibrio entre los activadores de ramificación y los inhibidores en la etapa temprana de desarrollo [7].
CISTANCHE MEJORARÁ LA FUNCIÓN RENAL/RENAL
La calreticulina (Calr) es una chaperona promiscua del retículo endoplásmico (ER) con una alta capacidad de unión al calcio y baja afinidad, que son cruciales para el secuestro de Ca2 plus en el ER y diferentes procesos celulares, incluida la transducción de señales, la expresión génica y el tráfico de proteínas. [8,9]. Los mecanismos que abordan el papel de Calr en las enfermedades se basan principalmente en la quelación de Ca2 plus por el dominio C-terminal de unión de Ca2 plus de Calr y su papel en la respuesta de proteína desplegada (UPR) [10,11]. UPR puede desempeñar un papel citoprotector durante un desafío con proteínas mal plegadas o puede ser perjudicial para las células como apoptosis inducida por señalización UPR sostenida. Aunque pocos estudios abordaron el papel potencial de Calr en enfermedades a través de la regulación de la transcripción, la función de chaperona ER de Calr sigue siendo uno de los mecanismos cruciales para el destino de la célula [9,12]. El estrés prolongado del RE y el plegamiento incorrecto de proteínas son prominentes en variosenfermedades renalescomo glomerulopatías, agudaslesión renal, nefropatía diabética,renalfibrosis y crónicaenfermedad del riñon[13,14]. El papel de Calr en el desarrollo embrionario aún no está claro. Calr knockout causa letalidad embrionaria durante la etapa de desarrollo E14.5 debido al deterioro del desarrollo cardíaco [15]. Las consecuencias de la deficiencia de Calr en los mecanismos moleculares deriñónEl desarrollo embrionario, sin embargo, aún no se entiende completamente. En el presente estudio realizamos análisis transcriptómicos y proteómicos comparativos del embriónriñónde los tres genotipos Calr plus/plus, Calr plus // y Calr// y destacó el impacto de la inactivación de Calr en la nefrogénesis y en la expresión de proteínas ribosómicas.
Palabras clave:deficiencia de calreticulina; nefrogénesis; biogénesis ribosomal, Riñón, Renal
2. Resultados
2.1. La anulación de la calreticulina da como resultado anomalías morfológicas e histológicas del riñón y deterioro de la ramificación renal
La desactivación genética de Calr en ratones causa letalidad embrionaria temprana debido a defectos del tabique ventricular [15]. Para investigar si Calr knockout impactariñóndesarrollo, se prepararon embriones de ratón en la etapa E13.5 a partir de ratones preñados Calr plus // (Figura 1A). Los embriones Calr// mostraron una alteración significativa del crecimiento en comparación con Calr plus / plus y Calr plus // y revelaron un deterioro significativo en el desarrollo embrionario. La morfología macroscópica de los embriones y lariñonesmostró disminuciones significativas en el tamaño entre los ratones Calr plus / plus y Calr-//, mostrando los ratones Calr// la mayor anomalía (Figura 1A). Para ilustrar el impacto del nocaut de Calr enriñóndesarrollo y estructura, se sacrificaron embriones en tres diferentes estados de desarrollo (E13.5, E14.5, E16.5) y de los tres genotipos (Calr plus/plus, Calr plus // y Calr//) y seriñonesse obtuvieron. Las secciones de tejido mostraron diferentes etapas de desarrollo de lariñón,que progresa a través de estructuras morfológicas complicadas como lo demuestra la tinción con PAS y HE de secciones de tejido.Riñonesdel mismo estado embrionario con diferentes genotipos mostraron diferentes niveles de desarrollo (Figura 1B). Además, diferencias significativas enriñónSe observaron estructuras especialmente al comparar Calr // con Calr plus / plus y Calr plus //. Estas diferencias también permanecen en etapas avanzadas de nefrogénesis (Figura 1B). Calor//riñonesmuestran un deterioro severo en comparación con Calr plus / plus y Calr plus // (Figura 1B). En la etapa E13.5 el tamaño de la Calr//riñónfue menor y el número de yemas de uréter y ramas de yemas de uréter fueron significativamente menores. Se hicieron observaciones similares en las etapas E14.5 y E16.5. Cultivo de órganos del embrionarioriñonesde los tres genotipos de embriones reveló un trastorno sustancial en la ramificación UB yriñóncrecimiento. Para visualizar elrenalestructuras, los rudimentos cultivados se tiñeron con laminina como marcador de la membrana basal y con lectina de aglutinina (DBA) de Dolichos biflorus para visualizar la UB.
La tinción de fluorescencia FL combinada de los cultivosriñónLos rudimentos mostraron un deterioro significativo en la ramificación que acompañaba a la deficiencia de Calr y resultó en un retraso general enriñóndesarrollo (Figura 2A,B). En el momento del aislamiento, la Calr//riñónlos rudimentos mostraron 6-10 puntas UB, mientras que los rudimentos Calr plus / plus y Calr plus // exhibieron 20-30 puntas UB. Los rudimentos cultivados Calr plus / plus y Calr plus // se desarrollaron normalmente durante el período de cultivo (72 h) y mostraron un UB bien ramificado (85 ± 9, n=6 cada uno) así como diferentes estructuras conocidas de en riñón en desarrollo vivo. el cultoriñónagregados pretubulares demostrados,renalvesículas y capuchón mesénquima (Figura 2A,B). En contraste, los rudimentos Calr// no lograron desarrollarse normalmente y mostraron una alteración significativa en la ramificación UB (15 ± 3 n=6) (Figura 2B).
Figura 2. Ratón Calr−/−riñónlos rudimentos muestran una severa alteración en el crecimiento y ramificación UB. (A):Riñónrudimentos de Calr plus / plus Calr plus /- y Calr-/- (E13.5) se aislaron y cultivaron ex vivo durante tres días. Calr-/-riñónlos rudimentos mostraron una alteración general en el crecimiento y una alteración significativa en la ramificación de la yema ureteral. (B): tinción de inmunofluorescencia deriñónrudimentos después de tres días de cultivo. Se realizó una co-tinción de laminina (rojo) y lectina DBA (verde) para visualizar las diferentes estructuras de los rudimentos. La cuantificación de la ramificación se logró contando el número de ramificaciones de la yema ureteral. La cuantificación se presenta como un gráfico de barras con barras de error. Cada barra representa los medios numéricos de la rama ± sd de seis rudimentos cultivados. Diferencias significativas: (*) p < 0.05,="" (***)="" p="">< 0,001.="" 2,5×="" 2,5×="" 2,5×="" int.="" j.="" mol.="" ciencia="" 2021,="" 22,="" 5858="" 4="" of="" 21="" figura="" 2.="" los="" rudimentos="" de="" riñón="" de="" ratón="" de="" calr悆="" muestran="" una="" alteración="" grave="" en="" el="" crecimiento="" y="" la="" ramificación="" de="" ub.="">Riñónrudimentos de Calr plus / plus Calr plus // y Calr / (E13.5) fueron aislados y cultivados ex vivo durante tres días. Calor /riñónlos rudimentos mostraron una alteración general en el crecimiento y una alteración significativa en la ramificación de la yema ureteral. (B): tinción de inmunofluorescencia deriñónrudimentos después de tres días de cultivo. Se realizó una co-tinción de laminina (rojo) y lectina DBA (verde) para visualizar las diferentes estructuras de los rudimentos. La cuantificación de la ramificación se logró contando el número de ramificaciones de la yema ureteral. La cuantificación se presenta como un gráfico de barras con barras de error. Cada barra representa los medios numéricos de la rama ± sd de seis rudimentos cultivados. Diferencias significativas: (*) p < 0.05,="" (***)="" p=""><>
2.2. La deficiencia de Calr se asocia con alteraciones grandes y significativas del transcriptoma
Las investigaciones morfológicas e histológicas mostraron deterioro enriñóndesarrollo en embriones de ratón Calr/ en comparación con Calr plus / plus y Calr plus // . Con el fin de investigar si la inactivación de Calr afectó la expresión de las proteínas y vías clave de la nefrogénesis, se analizaron los transcriptomas completos delriñónSe realizaron rudimentos a partir de los tres genotipos embrionarios. Para evaluar los genes expresados diferencialmente entre Calr plus / plus , Calr plus // y Calr/riñónmuestras, se realizaron pruebas cuantitativas basadas en recuentos de lectura utilizando la prueba exacta de Fisher con un ajuste de Benjamini-Hochberg para pruebas múltiples. Las figuras complementarias S1 y S2 muestran el mapa de calor del análisis comparativo entre las expresiones génicas en elriñónrudimentos de Calr plus / plus , Calr plus // y Calr / . Con el fin de obtener una descripción general completa de los cambios en la expresión génica entre Calr plus / plus y Calr/riñón, se creó un gráfico MA con el cambio de pliegue transformado (FC) de expresión entre Calr plus / plus y Calr / a log2 de transformado nivel de expresión promedio para cada gen en todas las muestras (Figura 3A, Figura complementaria S1). El gráfico MA muestra genes regulados diferencialmente en Calr plus/plus en comparación con Calr/. La clasificación funcional de los genes regulados según el proceso biológico reveló una alteración del proceso de desarrollo en Calr/riñones(Figura 3B, Tabla complementaria S1). Una investigación más detallada de la anotación de la ruta de los genes regulados reveló una aberración de dos procesos principales: la señalización de Wnt y el plegamiento de proteínas, ya que se encontró que la mayoría de las proteínas reguladas estaban involucradas en estas dos rutas principales (Figura 3B). El agrupamiento jerárquico y el agrupamiento de k-medias en los perfiles de expresión confirmaron que el embriónriñónlos transcriptomas de Calr plus / plus y Calr plus // son muy similares pero difieren significativamente de los transcriptomas de Calr / (Figura 3C, Figuras complementarias S1 y S2).
LA CITANCHE MEJORARÁ LA INFECCIÓN RENAL/RENAL
Nuestros datos de análisis del transcriptoma mostraron que la desactivación de Calr estuvo acompañada de una alteración en la expresión de proteínas clave enriñón(Figuras 3C y 4A, Tabla complementaria S2) junto con las proteínas clave en la señalización de Wnt y una gran cantidad de genes nefrogénicos se regularon a la baja o no se detectaron en Calr /riñónrudimentos (Figura 3C, Figura 4A). Entre otros, los factores de transcripción, como Six1 y Six2, que anteriormente se informó que funcionan en diferentes etapas de la nefrogénesis, se regularon significativamente a la baja en el riñón embrionario Calr //. Osr1 es uno de los genes cuya expresión se requiere para Eya1, Pax2, Six2, Sall1 y GDNF y la expresión de este gen estuvo casi ausente en Calr/. Con el fin de investigar el impacto de la alteración de la señalización Wnt y los genes clave nefrogénicos enriñóndesarrollo en ratones knockout Calr, se realizó tinción de inmunofluorescencia con marcadores del desarrollo embrionario enriñónsecciones de embriones en el estadio E14.5. La tinción confirmó claramente la alteración de los genes investigados en Calr/ (Figura 4B). Además, en comparación con Calr plus / plus y Calr plus // , Calr /riñóncarece de una zona nefrogénica clara (Figura 4B) como lo demuestra la tinción y esto confirma una alteración grave enriñóndesarrollo en embriones Calr/.
2.3. Los análisis proteómicos comparativos identificaron alteraciones significativas en el proteoma del riñón calr/embrionario
Los análisis morfológicos e histológicos mostraron que una restricción de Calr es problemática para el desarrollo embrionario delriñón. Para comprender mejor el papel de Calr enriñóndesarrollo embrionario, se llevaron a cabo amplios análisis de proteoma en embrionesriñonesutilizando dos estrategias. En los primeros experimentos, usamos la electroforesis en gel 2D para comparar el embriónriñónproteomas de Calr plus/plus y Calr plus // embriones de ratón del estadio E13.5. El patrón 2D mostró una alteración significativa en el proteoma de Calr plus //riñones(p < 0.05)="" (figura="" complementaria="" s3a).="" la="" identificación="" de="" las="" proteínas="" diferencialmente="" abundantes="" reveló="" una="" alteración="" en="" la="" expresión="" de="" proteínas="" implicadas="" en="" vías="" de="" estrés="" y="" en="" el="" metabolismo="" del="" arn="" en="" calr="" plus="">riñón(Figura complementaria S3B,C). Para explorar mejor la alteración del proteoma en Calr plus // y Calr悆 / en comparación con Calr plus / plusriñón, realizamos un perfil de proteoma basado en espectrometría de masas (Figura 5, Tablas complementarias S3–S8). Un análisis de superposición mostró una alta reproducibilidad de la detección de proteínas entre genotipos (Figura 5A). El análisis estadístico mostró alteraciones significativas en la expresión de proteínas entre Calr plus / plus frente a Calr悆 / (Figura 5A, Tablas complementarias S3 y S4, Figura complementaria S4A.), Calr plus // frente a Calr/ (Figura 5A, Tablas complementarias S5 y S6, Figura complementaria S4B), y Calr plus / plus vs. Calr plus // (Figura 5A, Tablas complementarias S7 y S8, Figura complementaria S4C). La tinción de inmunofluorescencia confirmó la eliminación de Calr en Calr //riñones. Además, confirmamos los hallazgos proteómicos para dos proteínas reguladas a la baja en Calr /: calbindina 1 (Calb-1) y superóxido dismutasa 1 (Sod1). En el caso de Sod1, tanto los datos proteómicos como transcriptómicos revelaron una inactivación de Sod1 en el embrión Calr悆 //riñóny la tinción de inmunofluorescencia confirmó la deficiencia de Sod1 en el Calr / embrionarioriñón(Figura 5B). Sod1 es una metaloenzima antioxidante que juega un papel importante en la desintoxicación de especies reactivas de oxígeno (ROS) al convertir los radicales libres de superóxido en peróxido de hidrógeno para una mayor desintoxicación por catalasas celulares, evitando así la toxicidad. Calb-1 es la principal proteína fijadora de calcio intracelular en el túbulo convoluto distal (DCT) y juega un papel clave en la reabsorción transcelular de Ca2 plus. Como tampón de Ca2+ intracelular y proteína de tránsito de Ca2+, Calb-1 transporta Ca2+ desde el lado apical al basolateral sin una modificación significativa en la concentración de Ca2+ intracelular. El vínculo entre la inactivación de Calr y la alteración en la expresión de ambas proteínas no está claro y requiere más investigación.
Figura 3. Análisis de expresión génica comparativa de ratones knockout para calreticulina. (A): gráfico MA que muestra genes regulados al alza y a la baja a gran escala en ratones Calr plus/plus frente a Calr/. Las pruebas cuantitativas del cambio de pliegue (basado en el recuento de lectura transformado logarítmicamente normalizado) se realizaron mediante la prueba exacta de Fisher con una corrección de Benjamini-Hochberg (p <0.05) y="" los="" genes="" no="" significativos="" se="" representan="" en="" gris.="" el="" gráfico="" ma="" se="" usa="" para="" mostrar="" los="" genes="" expresados="" diferencialmente="" en="" calr="" plus="" plus="" frente="" a="" calr="" (b):="" distribución="" de="" los="" procesos="" biológicos="" de="" los="" genes="" regulados="" a="" la="" baja="" en="" calr/="" en="" comparación="" con="" calr="" plus="" plus="" -.="" la="" clasificación="" de="" los="" genes="" identificados="" se="" realizó="" mediante="" una="" herramienta="" bioinformática="" david.="" el="" símbolo="" del="" gen="" se="" usó="" para="" categorizar="" las="" anotaciones="" de="" la="" ontología="" del="" gen,="" por="" ejemplo,="" procesos="" biológicos.="" (c):="" análisis="" de="" enriquecimiento="" de="" los="" principales="" genes="" que="" se="" encuentran="" significativamente="" regulados="" entre="" los="" tres="" genotipos="" (calr="" plus/plus,="" calr="" plus="" y="" calr/).="" el="" análisis="" comparativo="" se="" representa="" como="" un="" mapa="" de="" calor="" (fc=""><2 and="" fc="" >="">
2.4. Clasificación de ontologías génicas y análisis de redes de interacción proteína-proteína
Los gráficos de volcanes y los análisis de gráficos circulares mostraron que la alteración de la expresión de Calr da como resultado cambios globales en el embrión.riñónproteoma (Figura complementaria S4). Con el fin de obtener más información sobre los mecanismos biológicos asociados con el desarrollo embrionarioriñónAlteración del desarrollo en ratones Calr/, combinamos la bioinformática de DAVID con información sobre la supuesta función de las proteínas que se encuentran en las bases de datos UniProt y GenBank. La clasificación de las proteínas identificadas según su participación en los procesos biológicos dio como resultado veinte categorías, con nueve categorías altamente representadas (Figura complementaria S4D). Una de las categorías principales fue el proceso de desarrollo, con más de 1000 de las proteínas identificadas pertenecientes a este grupo. Dado que las interacciones proteína-proteína son los mecanismos clave para casi todos los procesos biológicos, incluido el desarrollo, la extracción de información sobre posibles interacciones proteína-proteína y la vía de regulación que conecta las proteínas reguladas en Calr plus // y Calr/ embrionarioriñónpodría entregar información significativa sobre los procesos que se ven afectados en condiciones de deficiencia de Calr. Para ello, investigamos las redes de interacción entre las proteínas reguladas utilizando STRING 11.0 (http://string.embl.de, consultado el 24 de marzo de 2021). Un análisis adicional de las proteínas expresadas únicamente en Calr plus / plus y Calr plus // reveló dos fuertes nodos de interacción de proteínas involucradas en dos procesos principales, que son el metabolismo del ARN y la fosforilación oxidativa (Figura complementaria S5A). Esto sugiere que el Calr / embrionarioriñónpuede sufrir una anormalidad en el metabolismo del ARN y escasez de energía. La investigación de las redes de interacción entre las proteínas sobreexpresadas en Calr plus/plus y Calr plus // en comparación con Calr/ respalda fuertemente nuestras suposiciones porque las redes muestran tres fuertes nodos de interacción. Dos de los nodos acumularon proteínas involucradas en el metabolismo del ARN y la fosforilación oxidativa, mientras que el tercer nodo involucra proteínas ribosómicas y reveló una alteración en la formación de ribosomas y el recambio de proteínas (Figura complementaria S5B). Un examen minucioso de las proteínas ribosómicas que se encontraron reguladas mostró una alteración significativa de las proteínas de las subunidades ribosómicas grandes y pequeñas y esto reveló la grave alteración en la biogénesis ribosómica y la síntesis de proteínas (Figura 6A-D).
2.5. Calr Knockout da como resultado una alteración en la expresión de la proteína ribosomal
Los análisis de datos transcriptómicos y proteómicos mostraron una alteración significativa en la expresión de proteínas ribosomales en células embrionarias de ratones Calr/.riñones. Análisis de transferencia Western y cuantificación de MS de embrionesriñónextractos de proteínas de los tres genotipos confirmaron la importante regulación a la baja de Rps10, Rps19 y Rps26riñones(Figura 7A) y Rps12, Rps13, Rps14 Rps15, Rps17 y Rps19 (Figura complementaria S6A,B) en Calr/ . Además, la tinción de embrionesriñónlos cortes confirmaron el alcance de la alteración en la expresión de las proteínas ribosómicas; no se pudo detectar Rps10 o Rps6 en Calr/ embrionarioriñónsecciones (Figura 7B). Con el fin de investigar el vínculo entre la eliminación de Calr y la expresión de la proteína ribosómica, establecimos un modelo de eliminación de Calr in vitro en MDCK.renalcélulas tubulares utilizando el sistema de endonucleasa CRISPR/cas9. Los análisis de western blot confirmaron la regulación a la baja dependiente de la dosis de la expresión de Calr en células MDCK y demostraron un agotamiento significativo de la subunidad ribosómica 40S que codifica las proteínas Rps10 y Rps19, lo que reveló una alteración en la biogénesis de los ribosomas. Además, la expresión de componentes esenciales para la síntesis de proteínas, por ejemplo, elongación, reveló que el factor de iniciación eEIF5a disminuyó significativamente en las células MDCK inactivadas por Calr (Figura 7C). La eliminación de Calr estuvo acompañada de importantes alteraciones morfológicas, proteómicas y transcriptómicas. Nuestras investigaciones in vivo e in vitro destacaron además que estas aberraciones iban acompañadas de una caída significativa en la biogénesis de los ribosomas. La disminución en la expresión de la proteína ribosómica en el knockout de Calrriñónno se limitó a las etapas embrionarias, sino que también se pudo demostrar en células derivadas de adultosriñones, revelando un papel potencial de Calr en la biogénesis ribosomal.
Figura 7. La deficiencia de Calr está asociada con una regulación a la baja en la expresión de proteínas ribosómicas. (A): análisis de transferencia Western de las proteínas ribosómicas Rps10, Rps19 y Rps26 en extractos de proteínas de Calr plus / plus , Calr plus // y Calr // embrionarioriñones. Se recogieron riñones embrionarios de tres ratones Calr plus/- embarazadas diferentes. Después del genotipado, los embriones de la misma madre y genotipo fueron agrupados y sus embrionesriñónlos extractos de proteína se agruparon juntos. Después de la estimación de proteínas, se realizaron análisis de transferencia Western por triplicado para cada proteína investigada. Para el análisis comparativo de las muestras se utilizó ANOVA de una vía. Los resultados se presentan como la media ± sd de al menos tres experimentos independientes. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas cuando p < 0.05.="" (b):="" tinción="" de="" inmunofluorescencia="" contra="" rps10="" y="" rps6="" en="" calr="" plus="" plus="" y="" calr="" ^{tm}="" ecciones="" de="" tejido="" renal="" embrionario="" con="" un="" aumento="" de="" 20×.="" (c):="" análisis="" de="" transferencia="" western="" del="" extracto="" de="" proteína="" de="" las="" células="" mdck="" (izquierda)="" y="" cuantificación="" del="" arnm="" después="" de="" la="" desactivación="" de="" calr="" en="" las="" células="" mdck="" (derecha).="" calr="" se="" eliminó="" utilizando="" el="" sistema="" crispr/cas9="" con="" dos="" sgrna="" diferentes.="" las="" transferencias="" western="" se="" probaron="" con="" anticuerpos="" calr,="" gapdh,="" rps10,="" rps19="" y="" eif5a.="" las="" cuantificaciones="" de="" arnm="" de="" calr="" y="" rps10="" en="" la="" muestra="" sgcalr-2="" se="" realizaron="" mediante="" qpcr.="" la="" regulación="" a="" la="" baja="" de="" calr="" utilizando="" el="" sistema="" crispr/cas9="" reveló="" una="" asociación="" entre="" la="" deficiencia="" de="" calr="" y="" la="" alteración="" en="" la="" expresión="" de="" la="" proteína="" ribosómica.="" diferencias="" significativas:="" (**)="" p="">< 0,01,="" (***)="" p="">< 0,001,="" (****)="" p=""><>
3. Discusión
losriñonesse desarrollan a través de la morfogénesis de ramificación, que es un proceso que involucra procesos complejos de crecimiento y diferenciación y es impulsado por las señales que provienen de las células circundantes en el compartimento mesenquimatoso naciente [16]. Durante los últimos años, varios genes y vías clave enriñónse ha identificado el desarrollo. Los factores tróficos, especialmente GDNF, proteínas morfogenéticas óseas (BMP) y factores de crecimiento de fibroblastos (FGF) están involucrados enrenalcrecimiento y diferenciación. Gobiernan la señalización involucrada en la morfogénesis de la ramificación UB así como en el mantenimiento y diferenciación del mesénquima nefrogénico en el embrión.riñón[17]. Calr knockout causa letalidad embrionaria debido al desarrollo cardíaco disfuncional [15]. Se requieren aumentos en la concentración citoplasmática de Ca2 plus en los cardiomiocitos normales para impulsar la miofibrilogénesis cardíaca. Este cambio indispensable en la concentración de Ca2 plus depende de Calr y está ausente en condiciones de deficiencia de Calr [18]. Aún no se ha explorado el papel funcional de la chaperona ER y la proteína de unión a calcio Calr en la nefrogénesis. Con el fin de investigar el papel potencial de Calr en embrionarioriñóndesarrollo y el impacto de la deficiencia de Calr en la nefrogénesis, realizamos un análisis transcriptómico y proteómico comparativo. En general, la deficiencia de Calr resultó en el retraso del desarrollo renal y alteraciones insignificantes del transcriptoma y el proteoma. Además, nuestros datos revelaron que la deficiencia de Calr desencadenó trastornos graves en las vías de nefrogénesis a medida que se identificaron alteraciones significativas de la expresión de proteínas clave de señalización de Wnt (p. ej., Wnt7a, Wnt11, Wnt10b, Fzd10, Fzd9, Prkcb, Prkcq y Kremen2). La señalización inductiva entre el epitelio de la yema ureteral y el mesénquima metanéfrico está regulada principalmente por la señalización de retroalimentación Wnt [19,20]. Si bien Calr es una parte importante de la homeostasis del calcio celular, es simultáneamente una chaperona esencial del RE para el plegamiento y tráfico de glicoproteínas y proteínas involucradas en la señalización celular y la expresión génica [21]. La desactivación de Calr podría provocar la interrupción del plegamiento de proteínas y el estrés del RE, lo que provoca alteraciones en la maquinaria de traducción. Esto puede explicar el retraso observado en el desarrollo renal en ratones homocigotos.
Uno de los aspectos sorprendentes e interesantes que destacan nuestros datos es la alteración en la expresión de proteínas ribosomales. Demostramos un agotamiento casi completo de varias proteínas de las subunidades ribosómicas 40S y 60S. Además, nuestros experimentos in vitro confirmaron la correlación entre la regulación a la baja de Calr y el deterioro de la expresión de la proteína ribosómica. La biogénesis de los ribosomas está bien organizada y se somete a una regulación estricta. Estudios emergentes han demostrado que el ribosoma juega un papel importante no solo en la fisiología celular normal sino también en la reacción a los estímulos y en la patogénesis de las enfermedades. Además, la biogénesis de los ribosomas controla el crecimiento celular, y la proliferación y las alteraciones en los ribosomas se reflejan en la aberración de la proliferación celular, la detención del ciclo celular, la apoptosis y la manifestación patológica [22,23].
Además de su papel en la biogénesis de los ribosomas, se ha descubierto que las proteínas ribosómicas ejercen diversas funciones extraribosómicas, por ejemplo, en el crecimiento y la proliferación celular, en la reparación del ADN y en la diferenciación y el desarrollo celular [24–31]. El deterioro de las funciones de las proteínas ribosómicas se asoció con trastornos hematológicos y metabólicos y podría provocar enfermedades cardiovasculares y cáncer [32-36]. La mutación en genes que codifican proteínas ribosómicas se asocia con anomalías en la eritropoyesis que dan lugar a síndromes clínicos, por ejemplo, anemia de Diamond-Blackfan (DBA) [37] y síndrome 5q [38]. Las mutaciones en el RPS10 están asociadas con la anemia de Diamond-Blackfan y el 30 por ciento de estos pacientes tienen herradura o sigmoide.riñones[39]. Curiosamente, los pacientes de Diamond-Blackfan tienen una mayor probabilidad de desarrollar un síndrome mielodisplásico, que está asociado con la mutación del exón 9 del gen Calr [40-42]. Esta remodelación de la maquinaria de traducción provoca aberraciones masivas en el proceso de desarrollo y afecta no solo a los sistemas urogenital sino también circulatorio y reproductivo, causando finalmente la letalidad embrionaria por deficiencia de calreticulina. Nuestros datos revelaron una biogénesis de ribosomas perturbadora en el embrionario Calr/riñóny destacó un papel sustantivo de Calr en la biogénesis de proteínas. Creemos que una mejor comprensión de las relaciones entre la deficiencia de Calr y la alteración de la expresión de la proteína ribosómica proporcionaría nuevos conocimientos para comprender cómo Calr afecta la biogénesis de los ribosomas y el desarrollo embrionario.riñóndesarrollo y permitir puntos de vista novedosos sobre los procesos que gobiernan el desarrollo de los órganos.
4. Materiales y Métodos
4.1. animales
Se obtuvieron ratones heterocigotos de calreticulina (Calr plus // ) y de tipo salvaje (Calr plus / plus ) con antecedentes genéticos C57BL/6J idénticos del profesor Marek Michalak, Universidad de Alberta, Edmonton, Alberta, Canadá. Los ratones se criaron en condiciones de alojamiento libres de patógenos específicos y se genotiparon como se describió previamente en Michalak et al. [15]. Para nuestro estudio, se sacrificaron ratones Calr plus // preñados en diferentes etapas del desarrollo embrionario (días embrionarios 13.5: E13.5; 14,5: E14.5; y 16.5: E16.5), se recolectaron los embriones y seriñonesfueron disecados. Para el genotipado se utilizó un trozo de la cola del embrión. losriñonesse prepararon adicionalmente para tinción histoquímica o análisis transcriptómico o proteómico. Todos los procedimientos experimentales se realizaron de acuerdo con la legislación alemana sobre cuidado y ética animal (normas NIH) y fueron aprobados por el Comité de Ética local del Centro Médico Universitario de Göttingen, Alemania (33.14-42502-04-11/0598).
LA CITANCHE MEJORARÁ EL DOLOR DE RIÑÓN/RENAL
4.2. Tinción histoquímica
Para la tinción histológica del embriónriñones, el extirpadoriñonesse fijaron durante la noche en una solución de formaldehído tamponado al 4 por ciento y posteriormente se incluyeron en bloques de parafina. Las secciones embebidas en parafina fueron desparafinadas y rehidratadas y teñidas con solución de hematoxilina Gill III y solución de eosina Y (Merck, Darmstadt, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
4.3. Cultivo de órganos ex vivo de riñón embrionario
El cultivo de órganos ex vivo se llevó a cabo de acuerdo con Davies et.al [43]. Se sacrificaron ratones preñados en la etapa E13.5 del desarrollo embrionario, se recolectaron los embriones y seriñonesfueron disecados. Después del genotipado, 6riñónlos rudimentos de cada genotipo (Calr plus / plus , Calr plus // y Calr/ ) se sembraron en una membrana de PET transparente con un tamaño de poro de 0,4 µM (24 pocillos, BD Falcon). La membrana se colocó en un pocillo de una placa de 24 pocillos, que contenía 400 µLriñónmedio de cultivo (KCM, DMEM, FCS inactivado al 10 por ciento). Esto habilitó lariñóncontactar con el médium sin ahogarlo. En estas condiciones, fue posible mantener elriñóncultivadas a 37 ◦C y 5 por ciento de CO2 durante al menos 144 h.
4.4. Tinción de inmunofluorescencia de los riñones cultivados y análisis inmunohistológico de las secciones de riñón
el embrionarioriñonesfueron cultivadas ex vivo durante 72 h, posteriormente, lariñónlos rudimentos se fijaron en metanol frío a t 20 ◦C durante 30 min. El paso de fijación fue seguido por 3 pasos de lavado, cada uno de los cuales fue de 5 min en PBS. El anticuerpo primario anti-laminina monoclonal de conejo (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE. UU.) se diluyó en PBS y se incubó a 4 ◦C durante la noche. el cultoriñónlos rudimentos se lavaron en PBS durante 4 h y se añadió el anticuerpo secundario (Molecular Probes Alexa Fluor 555 cabra anti-conejo IgG (1:500)) durante la noche a 4 ◦C. El UB se tiñó con aglutinina de lectina Dolichos biflflorus (DBA) durante al menos 3 h. Después de la incubación, elriñonesse lavaron en PBS durante 3 h y se incluyeron para el análisis microscópico. Inmunotinción de embriones desparafinados y rehidratadosriñónSe realizaron secciones para detectar la expresión y distribución de varias proteínas. Las secciones se trataron con una solución de recuperación de antígeno (ácido cítrico 1,8 µM y citrato de sodio 8,2 µM) precalentada en un vaporizador de alimentos durante 25 min. Las secciones se bloquearon con suero de cabra al 10 por ciento en PBS durante 1 h y se incubaron durante la noche a 4 ◦C con los anticuerpos primarios (se usaron los siguientes anticuerpos primarios: monoclonal de conejo anti-Calbindin-1, anti-Wt1, anti- Six2, anti-Pax2, anti-Calr (Abcam, Cambridge, Reino Unido), anticuerpo monoclonal de conejo anti-Rps6, antiRps10 (Invitrogen) y anticuerpo monoclonal de conejo anti-Sod1 (Abnova, Taipei, Taiwán).Los anticuerpos primarios se detectaron con fluorescencia. anticuerpos secundarios marcados (Molecular Probes Alexa Fluor 555 cabra anti-anticuerpo IgG de ratón y Alexa Fluor 555 cabra anti-conejo IgG) durante 1 h a temperatura ambiente. Para los controles negativos, las secciones de tejido se incubaron solo con el anticuerpo secundario. Los portaobjetos se montaron con cubreobjetos en medio de montaje Vectashield con DAPI para contrateñir los núcleos (Vector Laboratories, Burlingame, CA, EE. UU.).
4.5. Cultivo de células
Canino Madin-Darbyriñón(MDCK) se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC) y se propagaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), 10 % de suero bovino fetal (FBS), 1 % de penicilina/estreptomicina y 1 % de L-glutamina a 37 ◦C en una atmósfera con un 5 por ciento de CO2-. Las células se cultivan en matraces T25 y se dividen dos veces en una semana. Para el pase de células, las células MDCK se tripsinizaron durante un corto período de tiempo para evitar la alteración de la estructura celular.
4.6. Generación de Células Knockout
Las secuencias de sgRNA de Calr (XM8622117) para la especie canis lupus se diseñaron utilizando la herramienta en línea BlueHeronBio (Origene, Herford, Alemania). La secuencia de ARNsg 50 GTAGATGGCGGGTTCGGCAG 30 se insertó en el plásmido pLenti-Cas-Guide (plásmidos Addgene n.° 3931646) con enzimas de restricción BamHI y BsmBI para generar la construcción pLenti-Cas9-Calr que se confirmó posteriormente mediante secuenciación de Sanger. Para eliminar a Carl en las células MDCK, se realizó la transfección transitoria pLenti-Cas9-Calr. Un día antes de la transfección, se sembraron 200000 células/ml en placas de 6 pocillos con medio MEM. Antes de la transfección, el medio de cultivo se cambió a medio Opti-MEM libre de FCS. Se usó Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.) para transfectar las células. La mezcla de ADN de plásmido de lipofectamina se preparó con OptiMEM según el protocolo del instructor. Para la transfección de placas de 6 pocillos, se añadieron 4 µg de ADN plasmídico a 250 µL de medio Opti-MEM por separado y se incubaron durante 10 min a temperatura ambiente. Posteriormente, la mezcla de ADN se añadió a la mezcla de Lipofectamine 2000 y se incubó durante 30 min antes de añadirse a las células. El éxito de la transfección se evaluó usando Western blot.
4.7. Análisis del transcriptoma
Para las investigaciones del transcriptoma, se usaron 3 ratones Calr plus // preñados. Se recolectaron embriones (8–10/ratones preñados) y seriñonesestaban aislados. Después del genotipado,riñonesdel mismo genotipo y la misma madre se agruparon y procesaron para la extracción de ARN. Los ARN totales se aislaron de Calr plus / plus , Calr plus // y Calr / embrionarioriñonesutilizando el método Trizol (Invitrogen) según las recomendaciones del fabricante. A continuación, las muestras se trataron con ADNasa I (Sigma) para eliminar la contaminación por ADN. La calidad del ARN se determinó mediante electroforesis microfluídica Agilent 21{{10}}0 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.). Para la secuenciación, las muestras de ARN se prepararon utilizando el "TruSeq RNA Sample Prep Kit" de acuerdo con el protocolo del fabricante (Illumina, San Diego, CA, EE. UU.). La secuenciación de lectura única (50 pb) se realizó con un HiSeq 2000 (Illumina, San Diego, CA, EE. UU.). Las secuencias se alinearon con la secuencia de referencia del genoma de Mus Muscullus (ensamblaje del genoma Ensembl 3.2.1; https://www.ensembl.org/info/genome/genebuild/assembly.html, consultado el 24 de marzo de 2021) utilizando la alineación STAR software (Cold Spring Labarotory, Cold Spring Harbor, EE. UU.) (versión 2.3.0e, https://github.com/alexdobin/STAR, consultado el 24 de marzo de 2021) [44] que permite 2 discrepancias en 50 bases. Se utilizaron el paquete SAMtools (versión 0.1.18) y HTSeq (versión 0.6.1p1) para el filtrado de visitas únicas y el conteo [45,46]. Los genes candidatos se filtraron a un mínimo de cambio de 2-veces y el valor de p corregido por FDR < 0,05.="" la="" anotación="" de="" genes="" se="" realizó="" utilizando="" mus="" muscullus="" de="" ensembl="" v78="" (www.ensembl.org,="" consultado="" el="" 1="" de="" marzo="" de="" 2019)="" a="" través="" del="" paquete="" biomart="" (versión="" 2.24.0)="" [47].="" go="" análisis="" de="" enriquecimiento="" de="" los="" genes="" candidatos="" se="" realizó="" con="" el="" paquete="" goseq="" (versión="" 1.2)="" [48]="" utilizando="" parámetros="">
4.8. Lisis Renal, Extracción de Proteínas y Electroforesis en Gel Bidimensional (2-DE)
Para la electroforesis en gel 2D, se utilizaron embriones de 6 hembras Calr plus // preñadas (8–10 embriones/hembra). Para la extracción de proteínas por electroforesis en gel 2D (2-DE), elriñonesde embriones en la misma etapa embrionaria y del mismo genotipo y hembra (8–10 embriones/hembra preñada), se agruparon, se rompieron con un tampón de lisis (9,5 M de urea, 2 por ciento de CHAPS (p/v), 2 por ciento de anfolitos (p /v), 1 por ciento de DTT) y agitado en vórtice. Tras añadir tampón de telisis, las muestras se incubaron a 4 ◦C durante 30 min. Para eliminar los restos celulares se realizó una centrifugación a 13,000× g y 4 ◦C durante 30 min. El sobrenadante se volvió a centrifugar durante 30 min adicionales a 13,000× g y 4 ◦C para obtener la máxima pureza. Se recogieron los sobrenadantes y se desecharon los sedimentos y las muestras resultantes se usaron inmediatamente o se almacenaron a –80 ◦C hasta su uso. Para reducir la contaminación salina y enriquecer las proteínas, se realizó la precipitación con metanol-cloroformo según Wessel y Flügge [49]. El sedimento se secó y se disolvió en el tampón de lisis. La concentración de proteína total se determinó utilizando el ensayo de proteína Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.) según Bradford. Se utilizó BSA (Sigma, Steinheim, Alemania) como estándar. Para garantizar la reproducibilidad experimental, generamos geles por triplicado de cadariñónpiscina. La separación de proteínas en 2D se llevó a cabo como se describió anteriormente [50]. Los geles 2-DE se tiñeron con tinción de gel fluorescente Flamingo (Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. Después de la tinción, los geles se escanearon a una resolución de 50 µm en un escáner Fuji FLA-5100. Las imágenes digitalizadas se analizaron utilizando Delta 2D 3.4 (Decodon, Braunschweig, Alemania). Para la visualización de proteínas, los geles 2-DE se tiñeron adicionalmente durante la noche con azul de Coomassie coloidal, Roti-Blue (Roth, Karlsruhe, Alemania).
4.9. Análisis espectrométrico de masas e identificación de proteínas
Se extirparon puntos significativamente regulados de los geles y se realizaron digestión tríptica en gel y extracción de péptidos como se describió previamente por Dihazi et al. [51]. Brevemente, las manchas de gel se enjuagaron dos veces en bicarbonato de amonio 25 mM (amBic) y una vez en agua, se encogieron con acetonitrilo (ACN) al 100 por ciento durante 15 min y se secaron en un SpeedVac (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) durante 20–30 min. Todos los puntos extirpados se incubaron con 12,5 ng/µl de tripsina de grado de secuenciación (Roche Molecular Biochemicals, Basel, CH) en amBic 25 mM durante la noche a 37 ◦C. La extracción de péptidos se llevó a cabo dos veces usando primero ACN al 50 por ciento/ácido trifluoroacético (TFA) al 1 por ciento y luego ACN al 100 por ciento. Todos los extractos se agruparon y el volumen se redujo usando SpeedVac. Los péptidos trípticos se sometieron a secuenciación espectrométrica de masas usando un espectrómetro de masas Q-TOF Ultima Global (Micromass, Manchester, Reino Unido) equipado con un aerosol ESI Z de nanoflujo. La identificación de proteínas se llevó a cabo con el motor de búsqueda Mascot contra las bases de datos MSDB y Swissprot utilizando una tolerancia de masa peptídica y tolerancia de fragmentos de 0,5 Da.
LA CITANCHE MEJORARÁ LA INSUFICIENCIA RENAL/RENAL
4.10. Extracción de proteínas, SDS-PAGE, digestión tríptica en gel y análisis de espectrometría de masas
Para la cuantificación espectrométrica de masas de la alteración de proteínas en el Calr/riñón, las muestras del mismo genotipo y la misma madre se juntaron. Para generar suficientes grupos y asegurar la replicación biológica y experimental, utilizamos 6 Cal plus // preñadas diferentes con 8–10 embriones/ratones. el embrionarioriñonesde los tres genotipos se recolectaron de los embriones y la extracción de proteína se llevó a cabo utilizando el tampón de lisis como se describe anteriormente. Los extractos de proteínas se separaron mediante SDS-PAGE, los geles se tiñeron con Coomassie Blue, cada carril se extirpó y se cortó en 20 rebanadas de igual tamaño y las rebanadas se sometieron a digestión en el gel con tripsina. Para el análisis espectrométrico de masas, las muestras se enriquecieron en una precolumna C18 de fase inversa autoempaquetada (0.15 mm ID × 20 mm, Reprosil-Pur120 C{{11} }AQ 5 µm, Dr. Maisch, Ammerbuch-Entringen, Alemania) y separados en una columna C18 de fase reversa analítica (0.075 mm DI × 200 mm, Reprosil-Pur 120 C{ {21}}AQ, 3 µm, Dr. Maisch) utilizando un gradiente lineal de 30 min de 5 a 35 % de acetonitrilo/0,1 % de ácido fórmico (v:v) a 300 nl min-1). El eluyente se analizó en un espectrómetro de masas Q Exactive híbrido cuadrupolo/orbitrap (ThermoFisher Scientific, Dreieich, Alemania) que estaba equipado con una fuente FlexIon nanoSpray y funcionaba con el software Excalibur 2.4 usando un método de adquisición dependiente de datos. Cada ciclo experimental tenía la siguiente forma: se adquirió un escaneo de MS completo en el rango de 350 a 1600 m/z con una configuración de resolución de 70, 000 FWHM y objetivo de AGC de 106 y un tiempo de llenado máximo de 60 ms . Hasta los 12 precursores peptídicos más abundantes de los estados de carga de 2 a 5 por encima de un umbral de intensidad de 2 × 104 se aislaron secuencialmente con un ancho de aislamiento de 2,0 FWHM, se fragmentaron con nitrógeno con una configuración de energía de colisión normalizada del 25 por ciento y se obtuvieron los espectros de iones del producto resultante. se registró con una configuración de resolución de 17 500 FWHM y había un objetivo de AGC de 2 × 105 y un tiempo de llenado máximo de 60 ms. Los valores m/z del precursor seleccionado luego se excluyeron durante los siguientes 15 s. Se adquirieron dos réplicas técnicas por muestra. Las listas de picos se extrajeron de los datos sin procesar utilizando el software Raw2MSMS v1.17 (Instituto Max Planck de Bioquímica, Martinsried, Alemania). La identificación de proteínas se logró utilizando el software MASCOT 2.5.1 (Matrixscience, Londres, Reino Unido). Las proteínas se identificaron frente al proteoma de referencia de ratón UniProtKB v2017.09 (16930 entradas de proteínas) junto con un conjunto de 51 contaminantes comúnmente identificados en nuestro laboratorio. La búsqueda se realizó con tripsina como enzima y yodoacetamida como agente bloqueador de cisteína. Se permitieron hasta dos clivajes trípticos perdidos y la oxidación de metionina como modificación variable. Las tolerancias de búsqueda se establecieron en 10 ppm para la masa precursora y 0,05 Da para las masas de los fragmentos y se especificó ESI-QUAD-TOF como tipo de instrumento. Se usó el software Scaffold versión 4.8.9 (Proteome Software Inc., Portland, OR, EE. UU.) para validar las identificaciones de péptidos y proteínas basadas en MS/MS. Se aceptaron las identificaciones de péptidos si podían establecerse con una probabilidad superior al 95,0 por ciento mediante el algoritmo Percolator. Las identificaciones de proteínas se truncaron a una tasa de descubrimiento falso del 1 por ciento en un mínimo de 2 péptidos identificados con confianza. Los aciertos de proteínas que contenían péptidos similares y, además, no se pudieron diferenciar basándose únicamente en el análisis de MS/MS se agruparon para satisfacer los principios de parsimonia. Las proteínas que compartían pruebas peptídicas significativas se agruparon en grupos. Las abundancias de proteínas se estimaron mediante sus recuentos espectrales después de la normalización de las sumas totales entre todas las réplicas.
4.11. Análisis de Western Blot
Los análisis de transferencia Western se realizaron de acuerdo con Towbin et al. [52]. Se separaron cantidades iguales de proteínas (50–75 µg) mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, Reino Unido). Las membranas se bloquearon en leche descremada en polvo al 5 % en un tampón TBST (20 mM Tris-HCl, pH 7. 4 150 mM NaCl 0,1 % Tween 20) y se incubaron con anticuerpos primarios (anti-Calr, anti -Rps10, anti-Rps19, anti-Rps26 y anti-eIF5A) durante la noche a 4 ◦C. Para visualizar las bandas de proteínas, se utilizaron anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia. Con el fin de confirmar una carga igual de proteínas, las transferencias se trataron con anticuerpos anti-Actb o anti-GAPDH (Sigma, Taufkirchen, Alemania).
4.12. Bioinformática
La clasificación de las proteínas identificadas según sus funciones principalmente conocidas y postuladas se llevó a cabo utilizando la bioinformática DAVID (http://david.abcc. ncifcrf.gov, consultado el 21 de febrero de 2019) [53,54]. Se utilizaron símbolos genéticos para investigar y categorizar las anotaciones de ontología génica (GO) (procesos biológicos y funciones moleculares). El análisis de red de las interacciones proteína-proteína conocidas y previstas de las proteínas identificadas se realizó mediante STRING (herramienta de búsqueda para la recuperación de genes/proteínas que interactúan) [55].
4.13. Análisis estadístico
Para {{0}}DE, las imágenes digitalizadas se analizaron y la coincidencia de puntos entre geles y la normalización se realizaron con Delta2D 3.4 (Decodon, Braunschweig, Alemania). Delta2D calcula un valor de "calidad de punto" para cada punto detectado. Este valor muestra qué tan cerca representa un punto la forma de campana gaussiana 3D "ideal". En función de la relación de volumen de puntos promedio, los puntos cuya expresión relativa cambió al menos 2-veces (aumento o disminución) por triplicado entre las muestras comparadas se consideraron significativos. Para analizar la importancia de la regulación de proteínas, se realizó la prueba t de Student y se asumió la significancia estadística para valores de P menores que 0.05. Todas las transferencias se cuantificaron utilizando el software ImageJ. Los datos fueron recopilados con el paquete de software GraphPad Prism, versión 8 (San Diego, CA, EE. UU.). El software se usó para la presentación gráfica y el análisis por distribución t de Student o ANOVA unidireccional. Los resultados se presentan como la media ± sd de al menos tres experimentos independientes. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas cuando p < 0,05.="" las="" puntas="" de="" las="" yemas="" ureterales="" y="" las="" nefronas="" se="" contaron="" manualmente="" y="" los="" datos="" se="" compilaron="" con="" el="" paquete="" de="" software="" graphpad="" prism,="" versión="">