Administración mediada por neutrófilos CAR de nanofármacos sensibles al microambiente tumoral para la quimioinmunoterapia del glioblastoma

El glioblastoma (GBM) es uno de los tumores sólidos más agresivos y letales en humanos. Si bien se han desarrollado terapias eficaces, como las células T emergentes del receptor de antígeno quimérico (CAR) y la quimioterapia, para tratar diversos cánceres, su eficacia en el tratamiento del GBM se ha visto obstaculizada en gran medida por la barrera hematoencefálica y la barrera hematoencefálica-tumoral. Los neutrófilos humanos cruzan eficazmente barreras fisiológicas y muestran inmunidad efectora contra patógenos, pero la corta vida útil y la resistencia a la edición del genoma de los neutrófilos primarios han limitado su amplia aplicación en inmunoterapia. Aquí diseñamos genéticamente células madre pluripotentes humanas con activación genética mediada por CRISPR/Cas9- para expresar varias construcciones CAR anti-GBM con CD3ζ específico de T o dominios de señalización específicos de neutrófilos. Los neutrófilos CAR con la mejor actividad antitumoral se producen para administrar y liberar de forma específica y no invasiva nanofármacos que responden al microambiente tumoral para atacar el GBM sin la necesidad de inducir inflamación adicional en los sitios del tumor. Esta quimioinmunoterapia combinatoria exhibe actividades anti-GBM superiores y específicas, reduce la administración de fármacos fuera del objetivo y prolonga la vida útil en ratones hembra con tumores. En conjunto, este sistema biomimético de administración de fármacos CAR-neutrófilos es una plataforma segura, potente y versátil para el tratamiento del GBM y posiblemente otras enfermedades devastadoras.

Beneficios de la cistanche tubulosa-Antitumoral

El glioblastoma (GBM) se caracteriza por una alta tasa de mortalidad, una vida corta y un mal pronóstico con una alta tendencia a la recurrencia1,2. La eficacia terapéutica tanto de la cirugía como de los fármacos de quimioterapia se ve obstaculizada principalmente por la estructura fina del cerebro y la barrera hematoencefálica fisiológica (BHE) o la barrera hematoencefálica-tumoral (BBTB)3–5. En particular, la administración de fármacos al sistema nervioso central (SNC) para el tratamiento de tumores cerebrales es un gran desafío:<1% of administered nanoparticle dose is found to be delivered to a solid tumor based on 376 published datasets6, and 0.8% delivered to brain cancer7. Due to their native capacity to migrate towards inflamed sites, traverse BBB/BBTB, and infiltrate solid tumors, mouse neutrophil-mediated delivery of nanoparticulated chemo drugs has been investigated to enhance targeted drug delivery to the brain tumors for improved therapeutic efficacy8–10. However, an invasive surgical resection of the tumor or tumor microenvironment priming is needed to induce additional inflammation for neutrophil recruitment before neutrophil/chemotherapeutic administration, leading to limited neutrophil recruitment in tumor sites beyond the inflamed surgical margin11. Furthermore, neutrophil-delivered chemotherapeutics were primarily enriched in the spleen, but not in the targeted brain of tumor-bearing mice. While necrosis was not observed in the major organs of experimental mice, there are still concerns regarding off-target tissue toxicity or even systemic toxicity in patients12. Previous studies also focused on mouse neutrophils. The feasibility and safety of using human neutrophils in drug delivery remain elusive since neutrophils have a short lifespan and are prone to apoptosis ex vivo. In addition, massive neutrophil extraction from pre-surgical patients for drug loading may lead to neutropenia or other risks. Thus, a safe and effective human neutrophil-mediated biomimetic drug delivery system that utilizes the natural chemo-attractive GBM microenvironment is urgently needed.

La inmunidad innata y la plasticidad de los neutrófilos contra diversos cánceres12-16, incluido el GBM, fueron menos exploradas que su aplicación como portadores de células en la administración de fármacos8-10. Los neutrófilos circulantes en la sangre albergan el microambiente tumoral hipóxico (TME), donde se convierten en neutrófilos heterogéneos asociados a tumores (TAN), un componente esencial del TME inmunosupresor que contribuye a la progresión del cáncer y la resistencia terapéutica12,17. Al igual que los macrófagos, se encontraron fenotipos antitumorales N1 y protumorales N2 de TAN dentro del TME hipóxico18-21. Se han desarrollado varias estrategias terapéuticas para atacar directamente a los neutrófilos con un enfoque en el agotamiento o la inhibición de los neutrófilos12,22, lo que dio lugar a varios ensayos clínicos (p. ej., el inhibidor de CCR5 Maraviroc en NCT03274804). Por lo tanto, la aplicación directa de neutrófilos no tratados como nanoportador puede representar un riesgo adicional para los pacientes con cáncer en los que los neutrófilos del tráfico de drogas pueden reprogramarse al fenotipo protumoral N2 inmunosupresor dentro de TME después de localizarse en los sitios del tumor13,23. Además, se deben explorar y potenciar las actividades antitumorales intrínsecas de los neutrófilos vírgenes para lograr una eficacia terapéutica optimizada cuando se utilizan como portador de fármacos en combinación con quimioterapéuticos.

Beneficios de la cistanche tubulosa-fortalecer el sistema inmunológico

La modificación del receptor de antígeno quimérico (CAR) ha mejorado significativamente las actividades antitumorales de las células T inmunes o de las células asesinas naturales (NK)24–27. Sin embargo, su eficacia en tumores sólidos todavía es limitada debido en parte a su capacidad de tráfico y penetración tumoral relativamente baja. La presencia de BBB y BBTB fisiológicas impide aún más la eficacia de estas terapias emergentes contra GBM en el cerebro. Especulamos que la combinación de ingeniería CAR y neutrófilos altamente móviles podría mantener su fenotipo antitumoral N1 y producir una excelente eficacia terapéutica en el tratamiento del GBM. Los neutrófilos primarios tienen una vida corta y son resistentes a la edición del genoma28, lo que limita su aplicación en la inmunoterapia dirigida por CAR. Las células madre pluripotentes humanas (hPSC), que son más accesibles a la edición de genes y capaces de diferenciarse masivamente en neutrófilos, podrían proporcionar una fuente ilimitada de neutrófilos CAR de alta calidad para inmunoterapia dirigida en condiciones químicamente definidas y libres de xenos29. Los neutrófilos también fagocitan preferentemente patógenos microbianos con superficies rugosas o largas, como S. aureus y E. coli30, lo que debe tenerse en cuenta para el diseño de nanopartículas en la administración de fármacos mediada por neutrófilos. De hecho, Safari et al. informaron recientemente sobre la fagocitosis preferida de partículas alargadas administradas por vía intravenosa, sin modificación complicada de la superficie, mediante neutrófilos circulantes30. Un diseño tan sencillo y bioinspirado en nanopartículas cargadas de fármacos puede maximizar la carga del fármaco en los neutrófilos y permitir niveles terapéuticos de administración del fármaco en sitios específicos.

In this work, we design and screen four anti-GBM chlorotoxin (CLTX)-CAR constructs with T or neutrophil-specific signaling domains by knocking them into the AAVS1 safe harbor locus of hPSCs via CRISPR/Cas9-mediated homologous recombination and identified an optimized CAR, composed of a 36-amino acid GBM-targeting CLTX peptide27, a CD4 transmembrane domain and a CD3ζ intracellular domain, for neutrophil-mediated tumor-killing. The resulting stable CAR-expressing hPSCs are then differentiated into CAR-neutrophils, which sustain an anti-tumor N1 phenotype and exhibit enhanced anti GBM activities under the hypoxic tumor microenvironment. A biode gradable mesoporous organic silica nanoparticle with a rough surface (R-SiO2) is synthesized and employed to load hypoxia-activated prodrug tirapazamine (TPZ) or clinical chemo-drug temozolomide (TMZ) and JNJ-64619187 (a potent PRMT5 inhibitor under clinical trial NCT03573310) into hPSC-derived CAR-neutrophils, which are unharmed by the nanoparticulated cargo and retain the inherent physiological properties of naïve neutrophils. CAR-neutrophils loaded with drug-containing SiO2 nanoparticles display superior anti-tumor activities against GBM, possibly due to a combination of CAR-enhanced direct cytolysis and chemotherapeutic-mediated tumor killing via cellular uptake and glutathione (GSH)-induced degradation of nanoparticles within the targeted tumor cells. In an in situ GBM xenograft model, hPSC-derived CAR-neutrophils precisely and effectively deliver TPZ-loaded SiO2 nanoparticles to the brain tumors without invasive surgical resection for amplified inflammation, significantly inhibiting tumor growth, and prolonging animal survival, representing a targeted and efficacious combinatory chemoimmunotherapy. Notably, Si content measurement suggests that>El 20% de los nanofármacos administrados llegan a los tumores cerebrales mediante los neutrófilos CAR, en comparación con el 1% de los nanofármacos libres. En resumen, nuestro sistema biomimético de administración de fármacos CAR-neutrófilos es una plataforma segura, potente y versátil para el tratamiento del GBM y otras enfermedades devastadoras.

Beneficios de la cistanche tubulosa-Antitumoral

Resultados

Detección de estructuras CAR específicas de neutrófilos para actividades antitumorales mejoradas

To engineer CAR-neutrophils for targeted drug delivery to brain tumors (Fig. 1a–b), we first designed and tested 4 different CAR structures optimized for anti-tumor activities of hPSC-neutrophils. All CAR structures shared the same extracellular granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor (GM-CSFR) signal peptide (SP), glioblastoma-targeting domain CLTX27, and IgG4 hinge29 (Fig. 2a). CAR #1 is a first-generation T cell-specific CAR that uses the CD4 transmembrane (TM) domain and CD3ζ intracellular signaling domain. CAR #2, CAR #3, and CAR #4 differ from CAR #1 in using a transmembrane domain from neutrophil-specific CD32a (or FcγRIIA), a single-chain transmembrane receptor that is highly expressed in neutrophils (30,000 to 60,000 molecules/cell31) and critical for neutrophil activation31–34. CAR #3 and CAR #4 also include an Fc domain γ-chain of CD32a, which relies on a highly conserved immunoreceptor tyrosine based activation motif (ITAM) to express and signal in neutrophils. Notably, CAR #3 contains a combo signaling domain by fusing CD32aITAM to the CD3ζ intracellular domain. Since primary neutrophils are short-lived and resistant to genome editing, we engineered human pluripotent stem cells (hPSCs) with these different CARs to achieve stable and universal immune receptor expression on differentiated neutrophils by knocking CAR constructs into the AAVS1 safe harbor locus via CRISPR/Cas9-mediated homology-directed repair (Fig. 2b). After nucleofection, single cell-derived hPSC clones were isolated and screened with puromycin for about two weeks. Genotyping identified successfully targeted hPSCs with an average CAR knock-in efficiency of >El 90%, y la mayoría de los clones específicos son heterocigotos (Figuras complementarias 1a-d). La expresión de CAR en hPSC diseñadas se confirmó aún más mediante RT-PCR y análisis de citometría de flujo de CLTX-IgG4 (Figuras complementarias 1e-g). Como se esperaba, las hPSC que expresan CAR retuvieron altos niveles de expresión de marcadores pluripotentes, incluidos OCT4, SSEA4 y SOX2 (Figura complementaria 1f).

Para producir neutrófilos CAR de novo, las hPSC que expresan CAR se diferenciaron primero en progenitores hematopoyéticos multipotentes y luego mieloides con tratamiento con citoquinas específicas de la etapa (Fig. 2c). El empleo posterior de G-CSF y el agonista del ácido retinoico AM580 promovió una sólida producción de neutrófilos36. Al igual que sus contrapartes en sangre periférica (PB), los neutrófilos CLTX-CAR derivados de hPSC presentaron una morfología típica de neutrófilos y marcadores de superficie CD16, CD11b, MPO, CD15, CD66b y CD18 (Figura complementaria 2). A continuación, determinamos los efectos de la expresión de CAR sobre la citotoxicidad antitumoral de los neutrófilos derivados de hPSC al cocultivarlos con células U87MG de glioblastoma (GBM) in vitro. Como se esperaba, los neutrófilos CLTX-CAR derivados de hPSC presentaron una capacidad mejorada para eliminar tumores en comparación con los neutrófilos PB (Fig. 2d), de acuerdo con observaciones previas en células CLTX CAR-T27. Entre estos diferentes CAR, el CAR n.° 1 medió actividades superiores de destrucción de tumores en neutrófilos hPSC. En particular, el CAR #4 basado en cadena β es menos eficaz para desencadenar la destrucción de tumores mediada por neutrófilos, lo que puede deberse a la menor copia de ITAM en comparación con la subunidad ζ y a la menor expresión de los CAR que contienen α en la superficie celular28. Los neutrófilos liberan especies reactivas de oxígeno (ROS) citotóxicas y factor de necrosis tumoral (TNF-) para matar las células diana. La producción de ROS y TNF- (Fig. 2e, f) de diferentes neutrófilos coincidió bien con su aumento de citólisis. Como se esperaba, la producción de ROS y TNF- de diferentes neutrófilos después del cocultivo con células gliales SVG p12 normales se mantuvo tan baja como la del grupo de control negativo (Figuras complementarias 3a, b). Además, solo se observó una mayor citotoxicidad antitumoral de los neutrófilos CAR en la incubación conjunta con células GBM, incluidas U87MG, GBM43 adulta primaria y células SJ-GBM2 pediátricas (Figura complementaria 3c), lo que demuestra la alta especificidad de nuestro CLTX. -AUTO. En particular, los neutrófilos CAR mostraron una alta biocompatibilidad con células gliales SVG p12 normales, hPSC y células derivadas de hPSC (Figura complementaria 3d), lo que coincide con una observación previa de que los neutrófilos primarios inactivados no matan las células sanas. En conjunto, los neutrófilos CAR derivados de hPSC, en particular los neutrófilos CAR portadores de CD3ζ, presentaron una citotoxicidad antitumoral mejorada y produjeron más ROS y TNF-in vitro, destacando su potencial en la inmunoterapia dirigida.

Figura 1|Esquema de la eficacia mejorada contra el glioblastoma mediante inmunoterapia combinada de neutrófilos CAR y nanofármacos que responden al microambiente tumoral. Se diseñaron células madre pluripotentes humanas con CAR y se diferenciaron en neutrófilos CAR que están cargados con nanopartículas de sílice rugosa (NP de SiO2) que contienen tirapazamina (TPZ) dirigida a la hipoxia u otros fármacos, como una inmunoquimioterapia dual. b Las NPZ TPZ CAR-neutrophil@R-SiO2- administradas sistémicamente atacan primero las células tumorales normóxicas externas mediante la formación de sinapsis inmunológicas y destruyen las células tumorales mediante fagocitosis. Después de la apoptosis, los neutrófilos CAR podrían liberar NP R-SiO2-TPZ, que son superadas por las células tumorales. Posteriormente, los nanoprofármacos responden al microambiente hipóxico del tumor y matan eficazmente las células tumorales. Ortosilicato de tetraetilo TEOS, bis[3-(trietoxisilil)propil]tetrasulfuro de BTES, tirapazamina TPZ, benzotriazinilo BTZ.

Los neutrófilos CAR mantuvieron actividades antitumorales superiores en microambientes tumorales inmunosupresores

Al igual que los macrófagos, se encontraron fenotipos antitumorales N1 y protumorales N2 de neutrófilos asociados a tumores dentro del microambiente tumoral inmunosupresor17. Los neutrófilos N2 protumorales desempeñan funciones fundamentales en la angiogénesis, la metástasis y la inmunosupresión del tumor, pero la focalización terapéutica de este tipo de células ha sido un desafío.

En lugar de una estrategia de agotamiento sistémico22, aquí evaluamos el potencial de la ingeniería CAR para mantener el fenotipo antitumoral de los neutrófilos. Los neutrófilos derivados de CAR hPSC y PB se trataron con hipoxia (3% de O2) y TGF, que contribuyen a la inmunosupresión del microambiente tumoral37,38, para evaluar su actividad sostenida de destrucción de tumores. Mientras que los neutrófilos PB presentaron una citólisis significativamente menor contra las células GBM en condiciones inmunosupresoras, los neutrófilos CAR mantuvieron altas actividades de destrucción de tumores (Figura complementaria 4a). También se realizaron observaciones similares en la liberación de TNF y la generación de ROS (Fig. 4b, c complementaria) de neutrófilos PB o CAR en condiciones inmunosupresoras y normales. Para confirmar aún más el fenotipo de los neutrófilos en condiciones hipóxicas y de TGF, medimos la expresión de N1-iNOS específica y N2-N2-arginasa específica en los neutrófilos aislados mediante citometría de flujo (Figura complementaria). 4d-f). En comparación con la normoxia, la hipoxia inmunosupresora y el TGF disminuyeron significativamente los niveles de expresión de iNOS y aumentaron los niveles de arginasa en los neutrófilos PB, mientras que los neutrófilos CAR retuvieron altos niveles de expresión de iNOS. Estudios anteriores indican que la activación de la vía de señalización Syk-Erk conduce a la producción de ROS39–42. Por lo tanto, detectamos y comparamos la activación de Syk-Erk en neutrófilos no modificados y neutrófilos CAR, y nuestros resultados sugirieron una activación significativamente mayor de la vía Syk-Erk en neutrófilos CAR bajo hipoxia (Figuras complementarias 5a-d), que pueden sostener la producción de ROS sin cambios de los neutrófilos CAR bajo hipoxia. En conjunto, los neutrófilos CAR mantuvieron un fenotipo antitumoral y mantuvieron altas actividades antitumorales en un microambiente tumoral que imitaba condiciones in vitro, destacando su potencial en la inmunoterapia dirigida.

Figura 2|Detección de estructuras del receptor de antígeno quimérico (CAR) específico de neutrófilos con actividades antitumorales mediadas por neutrófilos mejoradas. a Esquema de varias estructuras CAR. b Esquema de la construcción CAR #1 y estrategia de activación dirigida en el locus de puerto seguro AAVS1 de células madre pluripotentes humanas (hPSC). La flecha vertical indica el sgRNA dirigido a AAVS1. Las flechas horizontales rojas y azules indican cebadores para analizar la eficiencia de focalización y la homocigosidad, respectivamente. HDR: reparación por recombinación homóloga. c Esquema de la diferenciación optimizada de neutrófilos de hPSC en condiciones químicamente definidas. d Los ensayos de citotoxicidad contra células de glioblastoma U87MG se realizaron en diferentes proporciones de objetivo de neutrófilo a tumor utilizando los neutrófilos indicados. Los datos se representan como media ± DE de cinco réplicas biológicas independientes, prueba t de Student de dos colas. Se determinó la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) (e) y el análisis ELISA de la liberación de TNF (f) de diferentes neutrófilos después del cocultivo con células U87MG. n=5 muestras biológicamente independientes. Los datos se representan como media ± DE, prueba t de Student de dos colas. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Preparación y caracterización de neutrófilos CAR hPSC cargados con nanopartículas de SiO2 que contienen tirapazamina (TPZ)

Los neutrófilos PB se han utilizado como portadores celulares para administrar imágenes y fármacos terapéuticos en tumores cerebrales8–10, aunque la infiltración dirigida de neutrófilos requiere cirugía o inflamación inducida por luz y la administración de fármacos fuera del objetivo puede ser una preocupación11. Para mejorar aún más las actividades antitumorales de los neutrófilos CAR, preparamos nanopartículas de sílice (SiO2-NP) con una superficie rugosa o lisa para cargar fármacos quimioterapéuticos o de radiación en los neutrófilos. Las imágenes del microscopio electrónico de transmisión (TEM) demostraron que ambas nanopartículas de SiO2 estaban bien dispersas y exhibían una morfología esférica con un tamaño uniforme (Fig. 3a, Fig. Suplementaria 6a). El análisis de la distribución de la composición mediante escaneo TEM (STEM) con espectroscopía de rayos X de energía dispersa (EDS) mostró que el elemento azufre (S) se distribuyó uniformemente dentro de todas las nanopartículas rugosas de SiO2 (R-SiO2) (Fig. 3b). Utilizando isotermas de adsorción-desorción de nitrógeno (N2) y el correspondiente análisis de distribución del tamaño de poro, los tamaños de poro de las NP R y SSiO2 se midieron como 25 nm y 35 nm (Fig. 3c, Fig. Suplementaria 6b), respectivamente. Dada la gran superficie y el gran tamaño de los poros, los fármacos terapéuticos podrían cargarse eficazmente en las NP R- y S-SiO2, como lo ejemplifica la profármaco tirapazamina (TPZ) que responde a la hipoxia (Fig. 3d, Fig. Suplementaria 6c). . Después de la carga de TPZ, no se observaron cambios significativos en la dispersión, la morfología y el tamaño de R-SiO2-TPZ utilizando TEM y análisis dinámico de dispersión de luz (Figura complementaria 6d, e). Los enlaces tetrasulfuro incorporados en las NP R-SiO2 son sensibles a los ambientes reductores y pueden degradarse rápidamente por la gran cantidad de glutatión (GSH) presente dentro de las células tumorales43. A continuación, determinamos la degradabilidad sensible al GSH de las NP R-SiO2-TPZ en presencia de GSH 10 mM, 1 mM y 10 μM, que eran las mismas que las condiciones intracelulares de las células cancerosas, las células normales y los entornos extracelulares43, respectivamente. Tras el tratamiento con GSH 10 mM, la estructura esférica inicial de las NP R-SiO2 –TPZ se destruyó severamente después de 24 horas (Figura complementaria 6f, g). Las nanopartículas se desintegraron completamente en pequeños desechos después de 48 h, lo que resultó en la liberación de TPZ en respuesta a GSH (Fig. 3e). Los restos de NP R-SiO2 no causaron ninguna citotoxicidad significativa en las células analizadas in vitro (Figura complementaria 6h), lo que indica la seguridad relativa de las NP R-SiO2.

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A continuación, evaluamos la viabilidad de utilizar NP de SiO2-TPZ para cargar fármacos terapéuticos en neutrófilos CAR como una quimioinmunoterapia combinada para lograr una mayor eficacia terapéutica. Después de la centrifugación, medimos la absorción celular de SiO2-TPZ NP por los neutrófilos utilizando un microscopio de fluorescencia y análisis de citometría de flujo (Fig. 3f, g), y detectamos una absorción celular más significativa de R-SiO2-TPZ NP que S-SiO2-. TPZ NP por neutrófilos. El contenido de Si celular en los neutrófilos se midió como 11,3 y 19,1 ng de proteína Si / ug para NP de SiO2 @ TPZ lisos y rugosos (Fig. 3h), respectivamente, mediante espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente (ICP-MS). Dada su alta capacidad de carga en neutrófilos, se emplearon NP R-SiO2-TPZ para experimentos posteriores. Luego buscamos probar las funciones fisiológicas de los neutrófilos CAR después de cargar NP R-SiO2-TPZ. No se observaron cambios en la viabilidad celular (Fig. 3i, Fig. 6i complementaria), la capacidad de migración transwell (Fig. 3j), la quimiotaxis y la velocidad correspondiente (Fig. 3k, l) de los neutrófilos CAR antes o después de cargar R-SiO2. –TPZ NPs, demostrando su alta biocompatibilidad. También se realizó un análisis de carga de nanofármacos dependiente del tiempo y el contenido de carga máximo se alcanzó 1 h después de la incubación de NP celular (Figura complementaria 7a). Más del 95% de los neutrófilos CAR se cargaron con éxito con NP R-SiO2 –TPZ (Figura complementaria 7b). El nivel de expresión de CD11b, una proteína de la superficie de los neutrófilos que media la función de adhesión y migración tras la estimulación de la molécula inflamatoria, no cambió en los neutrófilos CAR con o sin carga de R-SiO2-TPZ (Figura complementaria 7c, d). Los neutrófilos activos liberan superóxido u especies reactivas de oxígeno (ROS) para matar microbios y células tumorales44. Como se esperaba, la generación de ROS por parte de los neutrófilos CAR aumentó significativamente después del tratamiento con N-formilmetionina-leucil-fenilalanina (fMLP), y no se observaron diferencias significativas en la producción de ROS por parte de los neutrófilos CAR antes y después de cargar R-SiO2- TPZ (Figura 3m). En conjunto, nuestros datos demostraron que los neutrófilos CAR cargados con R-SiO2-TPZ mantenían las actividades fisiológicas de los neutrófilos de tipo salvaje y podían migrar activamente hacia estímulos inflamatorios, destacando su potencial en la quimioinmunoterapia dirigida contra el cáncer.

Los neutrófilos CAR cargados con nanopartículas R-SiO2-TPZ matan eficazmente las células de glioblastoma

A continuación, evaluamos el efecto de R-SiO2-TPZ sobre la capacidad de destrucción de tumores de los neutrófilos CAR. La interacción íntima efector-objetivo era un requisito previo para la citólisis mediada por neutrófilos. Como se esperaba, CAR-neutrophils@R-SiO2-TPZ formó sinapsis inmunes con células tumorales en 2 h y exhibió números de interacción efector-objetivo similares a los de los neutrófilos CAR sin fármacos (Fig. 4a, Fig. complementaria 8) . En particular, no se encontraron interacciones observables entre CAR-neutrophils@RSiO2-TPZ y células somáticas no cancerosas (Figura complementaria 8), lo que destaca la especificidad de CLTX-CAR contra los tumores cerebrales. Además, las NP R-SiO2-TPZ se liberaron de los neutrófilos al medio de cultivo (Fig. 9a, b) complementarias 12 h después del cocultivo y entraron en las células tumorales restantes (Fig. 4a). Veinticuatro horas después de la coincubación de neutrófilos CAR cargados con SiO2-TPZ NP con células tumorales, hasta el 95% de las células tumorales contenían R-SiO2-TPZ NP (Fig. 4a, Fig. Suplementaria 9c), lo que indica una exitosa cascada de transporte que involucra a neutrófilos portadores que ejercen su función de célula efectora y sufren apoptosis, liberando así pasivamente R-SiO2-TPZ NP a las células tumorales diana45. También validamos la función de respuesta hipóxica y la citotoxicidad del profármaco TPZ dentro de las células tumorales mediante análisis de espectroscopia de resonancia paramagnética electrónica (EPR) de la generación de radicales a partir de TPZ (Figura complementaria 9d) y análisis de citometría de flujo de TOPRO-3 en el tumor. células (Figura complementaria 9e) bajo hipoxia y normoxia. Para determinar la citólisis de los neutrófilos CAR cargados con R-SiO2 – TPZ NP, implementamos un modelo de desafío tumoral de normoxia-hipoxia in vitro (Fig. 4b). Veinticuatro horas después del cocultivo normóxico, los neutrófilos CAR cargados con R-SiO2- NP TPZ o no exhibieron una citotoxicidad antitumoral similar (Fig. 4c), y ambos fueron mayores que los neutrófilos PB cargados con R -SiO2-TPZ NP o no y R-SiO2- TPZ NP solos. La citotoxicidad mejorada se debe principalmente a la mayor capacidad de los neutrófilos para atacar tumores después de la ingeniería CAR. Después de un cocultivo hipóxico adicional de 12 y 24- h con células tumorales, los neutrófilos CAR cargados con R-SiO 2- TPZ NP mostraron una capacidad antitumoral superior en comparación con otros grupos (Fig. 4d, e). Además, los neutrófilos CAR cargados con NP de R-SiO2-TPZ exhibieron una excelente citólisis contra células tumorales frescas resembradas (Fig. 4f), lo que indica la capacidad antitumoral de R-SiO2-TPZ liberada. Nanopartículas después de la apoptosis de neutrófilos.

Luego realizamos un análisis de secuenciación de ARN (RNA-seq) en células tumorales para dilucidar el posible mecanismo molecular subyacente a la citólisis antitumoral mejorada de neutrófilos mediante la expresión de CAR y R-SiO2-NP TPZ. El análisis de expresión génica demostró que, en comparación con el control y las NP R-SiO2-TPZ, los neutrófilos CAR cargados con o sin R-SiO2-NP TPZ disminuyeron significativamente la expresión de genes de citoplasma y membrana en células tumorales ( Fig. 10a complementaria, Fig. 4g), lo que respalda aún más su fagocitosis de células tumorales tras el cocultivo. Si bien todos los grupos experimentales aumentaron el estrés oxidativo celular en las células tumorales, los neutrófilos CAR cargados con R-SiO2-TPZ superaron a otros grupos en la activación de la señalización del estrés oxidativo. Además, los neutrófilos CAR cargados con R-SiO2-TPZ promovieron significativamente la apoptosis y disminuyeron la proliferación en las células tumorales. Para comprender mejor las actividades antitumorales mejoradas de los neutrófilos CAR cargados con R-SiO2-TPZ, aplicamos un inhibidor de la fagocitosis, citocalasina D y un eliminador de especies reactivas de oxígeno (ROS), N-acetilcisteína (NAC) y un inhibidor de ROS GSK2795039 para el cocultivo tumor-neutrófilo. La citólisis de células tumorales por neutrófilos CAR se redujo significativamente con citocalasina D 5 μM, NAC 5 mM y GSK2795039 100 nM (Figura complementaria 10b, c), lo que indica el papel destacado de la fagocitosis y ROS en las células tumorales mediadas por neutrófilos CAR. asesinato. El 40 %-50 % restante de lisis de células tumorales en presencia de neutrófilos y NAC o GSK2795039 indica la participación de un mecanismo independiente de ROS en la destrucción de tumores mediada por neutrófilos que merece una mayor investigación.

Figura 3|Preparación y caracterización de neutrófilos CAR hPSC cargados con nanopartículas de SiO2 que contienen tirapazamina (TPZ). a – e Se muestran imágenes de mapeo elemental de microscopio electrónico de transmisión (TEM) (a) y espectroscopía de dispersión de energía (EDS) (b) de nanopartículas rugosas de SiO2. c Se muestra la isoterma de adsorción-desorción de nitrógeno de nanopartículas rugosas de SiO2 junto con el gráfico de distribución del tamaño de poro de Barrett-JoynerHalenda (BJH). Los triplicados biológicos se realizaron de forma independiente. El contenido de carga de TPZ en nanopartículas de SiO2 (d) y la liberación de TPZ sensible al glutatión (GSH)-- (e) se midieron en el momento indicado. n=3 muestras biológicamente independientes. Análisis de varianza unidireccional (ANOVA) para (e). Imágenes de fluorescencia (f) y análisis de citometría de flujo (g) de neutrófilos cargados con SiO2-TPZ suave y rugoso. Los triplicados biológicos se realizaron de forma independiente. h Se midió el contenido de SiO2 celular en neutrófilos CAR derivados de hPSC. n=5 muestras biológicamente independientes, prueba t de Student de dos colas. Viabilidad celular (i), n=3 muestras biológicamente independientes, transmigración (j), n=5 muestras biológicamente independientes, capacidades de quimioatracción (k, l), n=20 muestras biológicamente independientes, y Se mostró la capacidad de generación de ROS (m) de neutrófilos CAR derivados de hPSC cargados con o sin SiO2-TPZ rugoso, n=5 muestras biológicamente independientes, prueba t de Student de dos colas. PMA: acetato de miristato de forbol. Todos los datos de esta figura se representan como media ± DE. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Evaluación funcional de neutrófilos CAR cargados con nanofármacos utilizando modelos biomiméticos de glioblastoma in vitro

Para evaluar más a fondo las actividades de los neutrófilos CAR cargados con R-SiO 2- TPZ NP, implementamos un modelo de tumor de barrera hematoencefálica (BBB) ​​basado en Transwell utilizando células endoteliales microvasculares cerebrales humanas (Fig. 5a, Fig. complementaria .11a). Como se esperaba, los neutrófilos CAR cargados con R-SiO 2- TPZ NP exhibieron una excelente capacidad de transmigración en el modelo BBB in vitro (Fig. 5b), matando efectivamente las células tumorales específicas después de la transmigración en condiciones tanto normóxicas como hipóxicas (Fig. 5c). , d) y liberando más citoquinas inflamatorias (Fig. 5e) que pueden atraer otras células efectoras para matar las células tumorales. Además, los neutrófilos CAR no afectaron significativamente la viabilidad de las células endoteliales después de la transmigración (Figura complementaria 11b). Los neutrófilos CAR cargados con R-SiO 2- TPZ NP conservaron una excelente capacidad de transmigración durante el segundo experimento de transmigración (Fig. 5f) y una capacidad antitumoral superior en comparación con otros grupos (Fig. 5g). Luego se empleó un modelo de esferoide tumoral tridimensional (3D) para evaluar la capacidad de penetración tumoral de los neutrófilos CAR cargados con R-SiO 2- TPZ NP (Fig. 5h). Los neutrófilos CAR migraron gradualmente hacia el centro del esferoide tumoral y se distribuyeron uniformemente en el esferoide después de 8 h de incubación (Fig. 5i). Se observó un alto grado de colocalización entre los neutrófilos CAR y las NP R-SiO2-TPZ (Figuras complementarias 12a-c), lo que demuestra que las NP R-SiO2-TPZ estaban encapsuladas de manera estable en el CAR. -neutrófilos durante la infiltración tumoral antes de su citólisis. Sin administración mediada por neutrófilos, las NP de R-SiO2-TPZ solo se encontraron en la capa exterior de los esferoides tumorales. En comparación con las NP de R-SiO 2- TPZ y los neutrófilos CAR, los neutrófilos CAR cargados con NP de R-SiO 2- TPZ exhibieron una citolisis antitumoral superior en el modelo de tumor 3D (Fig. 5j). Las NP CAR-neutrophils@R-SiO2 también se pueden emplear para administrar otros fármacos, incluida la temozolomida clínica (TMZ) y JNJ- 64619187, en modelos de tumores 3D y matar eficazmente las células GBM (Figuras complementarias 12d-f). En conjunto, los neutrófilos CAR combinados y los nanofármacos mostraron excelentes actividades antitumorales en un microambiente tumoral biomimético que imita las condiciones in vitro, destacando el potencial terapéutico de la quimioinmunoterapia combinatoria basada en neutrófilos.

cistanche tubulosa-mejora el sistema inmunológico

Distribución in vivo de nanopartículas de R-SiO2-TPZ administradas por neutrófilos CAR

In addition to improving the direct tumor-killing ability, we hypothesize that CAR engineering of hPSC-neutrophils will significantly enhance their targeted delivery of therapeutic drugs without additional surgery- or light-induced inflammation11. To test this hypothesis, we employed a mouse xenograft model of glioblastoma and an in vivo imaging system to determine the trafficking and biodistribution of R-SiO2-TPZ NP-loaded CAR-neutrophils. We fluorescently labeled SiO2 NPs with a near-infrared dye Cyanine 5 (Cy5) and then performed fluorescence imaging 3 h and 24 h after systemic administration (Fig. 6a). Three hours after intravenous injection, R-SiO2-TPZ NPs traveled to the whole body of tumor-bearing mice and emitted strong fluorescence with or without neutrophil-mediated delivery (Fig. 6b). CAR-neutrophil-delivered R-SiO2-TPZ NPs accumulated in the brain tumor site within 24 h, whereas free R-SiO2-TPZ NPs were still evenly distributed across the whole body (Fig. 6b). To further quantify the biodistribution of R-SiO2-TPZ NPs in various organs, inductively coupled plasma-optical emission spectrometry (ICP-OES) analysis of Si content was performed on the harvested organs 24 h post-injection. CAR neutrophil-delivered R-SiO2-TPZ NPs were significantly enriched in the mouse brain (Fig. 6c), although a low-level delivery to the liver and spleen was observed. Si content measurement also demonstrated that >El 20 % de los nanofármacos administrados fueron administrados a tumores cerebrales mediante neutrófilos CAR, en comparación con el 1 % mediante nanofármacos libres, lo que concuerda con informes anteriores6. La entrega dirigida de R-SiO 2- NP de TPZ al cerebro del huésped a través de BBB por parte de los neutrófilos CAR también se confirmó mediante análisis histológico (Fig. 6d). Por el contrario, las NP de R-SiO2-TPZ solas se acumularon principalmente en el hígado y el bazo. En conjunto, nuestros datos demostraron una administración dirigida mejorada de R-SiO2-NPZ por parte de los neutrófilos CAR sin la necesidad de inducir inflamación adicional en el sitio del tumor, lo que destaca la viabilidad y seguridad de la quimioinmunoterapia basada en neutrófilos en el tratamiento del cáncer.

La quimioinmunoterapia combinada de neutrófilos CAR y nanopartículas R-SiO2-TPZ exhibió excelentes actividades antiglioblastoma in vivo

Para determinar la eficacia terapéutica de los neutrófilos CAR cargados con R-SiO2-TPZ NP, se estableció un modelo de xenoinjerto in situ de glioblastoma en ratones NOD.Cg-RAG1tm1MomIL2rgtm1Wjl/SzJ (NRG) utilizando células U87MG que expresan luciferasa. A los ratones portadores de tumores se les administraron por vía intravenosa 5 × 106 neutrófilos por semana (Fig. 7a), y se midió y cuantificó la carga tumoral en los huéspedes (Fig. 7b, c). En comparación con los ratones tratados con PBS o PB-neutrófilos, el tratamiento con CAR-neutrófilos y CAR neutrophil@R-SiO2–TPZ NP ralentizó eficazmente el crecimiento del tumor. Los neutrófilos CAR @ R-SiO2 – TPZ NP mostraron una citotoxicidad antitumoral mucho mayor que cualquier otro grupo experimental. Por el contrario, los neutrófilos PB promovieron significativamente el crecimiento tumoral en el cerebro, lo que provocó la muerte de ratones portadores de tumores ya en el día 23 (Fig. 7d), lo que sugiere que los neutrófilos no diseñados pueden presentar riesgos adicionales. Luego medimos la liberación de citoquinas humanas en el plasma de diferentes grupos de ratones experimentales (Fig. 7e). Todos los grupos experimentales sin PBS produjeron TNF e IL-6 detectables en el plasma desde el día 5 hasta el día 26, lo que sugiere la activación de los neutrófilos humanos tras la estimulación tumoral. De acuerdo con la mayor tasa de crecimiento tumoral observada, los neutrófilos no modificados liberaron gradualmente más IL-6 y TNF, lo que puede provocar síndrome de liberación de citocinas en los pacientes y requiere estudios de seguridad más profundos con bloqueadores de IL-646,47 . En particular, las NP de CAR-neutrophils @ RSiO2 – TPZ mostraron una disminución de la capacidad de producción de citoquinas en momentos posteriores (día 19 y día 26), lo que sugiere un riesgo potencialmente bajo de síndrome de liberación de citocinas en pacientes tratados con quimioinmunoterapia basada en CAR-neutrófilos. La biocompatibilidad de los neutrófilos CAR combinados y las NP R-SiO2-TPZ se evaluó mediante la medición semanal del peso corporal y el seguimiento de los cambios patológicos en los órganos principales de los ratones. No se observaron diferencias en los pesos corporales entre los ratones tratados con CAR neutrophils @ R-SiO2 – TPZ NP y cualquier otro grupo experimental (Fig. 7f), lo que indica una toxicidad sistémica mínima y una excelente biocompatibilidad de CAR-neutrophils @ R-SiO2 – TPZ NP dentro 28 días de tratamiento. El análisis histológico de órganos principales cortados de ratones el día 30 mostró que los ratones tratados con CAR-neutrophils@R-SiO2–TPZ NP no causaron anomalías notables ni daños a órganos en el corazón, el hígado, el bazo, los pulmones y los riñones (Fig. 13), lo que confirma aún más la seguridad de los neutrófilos CAR combinados y las NP R-SiO2-TPZ.

Figura 4|Los neutrófilos CAR cargados con nanopartículas de R-SiO2-TPZ matan eficazmente las células de glioblastoma. Se mostraron imágenes representativas de sinapsis inmunológicas indicadas por la acumulación de actina F polarizada en la interfaz entre los neutrófilos CAR y las células tumorales a las 6, 12 y 24 h. Las nanopartículas de R-SiO2-TPZ liberadas por los neutrófilos CAR tras la fagocitosis de las células tumorales fueron absorbidas por las células tumorales. Los triplicados se realizaron de forma independiente. b Esquema del ensayo de citotoxicidad antitumoral mediada por neutrófilos. La citotoxicidad contra células de glioblastoma U87MG se realizó en diferentes proporciones de neutrófilo a objetivo tumoral utilizando los neutrófilos indicados a las 24 h (c), 36 h (d), 48 h (e) y 72 h (f). n=3 muestras biológicamente independientes. Los datos se representan como media ± DE, análisis de varianza unidireccional (ANOVA). g El análisis de secuenciación masiva de ARN se realizó en células U87MG en diversas condiciones. El mapa de calor muestra los niveles de expresión de genes seleccionados de citoplasma, membrana, estrés oxidativo, apoptosis y relacionados con la proliferación en las células de glioblastoma indicadas. n=2 muestras biológicamente independientes. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Figura 5|Evaluación funcional de neutrófilos CAR cargados con nanopartículas R-SiO2-TPZ utilizando modelos de glioblastoma biomimético (GBM) in vitro. a Esquema de nuestro modelo tumoral in vitro de GBM con barrera hematoencefálica (BBB), que se compone de células endoteliales en la membrana de inserción celular y células tumorales en el fondo del mismo transwell. b Se muestra el análisis de migración de Transwell de neutrófilos a las 12 h. Se midió y cuantificó la citotoxicidad anti-GBM de los neutrófilos indicados a las 24 h (c) y 36 h (d). Se realizó un análisis ELISA de IL-6 y TNF liberados de los neutrófilos indicados a las 36 h. f Se muestra la segunda migración de diferentes neutrófilos a las 48 h. g Se midió y cuantificó la citotoxicidad anti-GBM de los neutrófilos indicados a las 60 h. h – j El esquema del modelo de tumor tridimensional (3D) infiltrado con neutrófilos in vitro se muestra en (h). Se mostraron imágenes fluorescentes representativas de neutrófilos infiltrados en los modelos de tumores 3D. Se usó DAPI para teñir el núcleo celular y CD45 para teñir los neutrófilos. Barras de escala, 200 μm. Los triplicados biológicos se realizaron de forma independiente. j La correspondiente capacidad de destrucción de tumores de los neutrófilos indicados se midió y cuantificó utilizando un kit de citotoxicidad. Los datos se representan como media ± DE de cinco réplicas biológicas independientes, análisis de varianza unidireccional (ANOVA). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Si bien las NP CAR-neutrophil@R-SiO2–TPZ ralentizaron significativamente el crecimiento tumoral en ratones xenoinjertados, la diferencia en la supervivencia animal en grupos experimentales de CAR-neutrófilos, SiO2-TPZ NP y CAR-neutrophil@R-SiO2–TPZ NP es insignificante (p > 0.05), lo que posiblemente se deba a la muerte de los neutrófilos de vida corta durante la preparación e inyección de las células. Luego nos centramos en estos tres grupos y determinamos si la reducción del tiempo de preparación celular y el aumento de las dosis de neutrófilos CAR y nanofármacos harían alguna diferencia en la supervivencia de los animales (Fig. 7g). Cuando se administraron sistémicamente 6 veces, las NP CAR-neutrophil @ R-SiO2 –TPZ superaron a los otros dos grupos en la extensión de la vida útil de los ratones con tumores (Fig. 7h), mientras que la diferencia en la supervivencia animal en grupos de CAR-neutrófilos y SiO2– Los NP de TPZ siguieron siendo insignificantes. Si bien se observó una curva de supervivencia similar del grupo R-SiO2- TPZ entre estos dos estudios independientes en animales, se redujo el tiempo de aislamiento celular y preparación para la inyección de un total de ~4 horas a 1 hora durante los primeros 4 neutrófilos. Las dosis condujeron a una mejor supervivencia de los animales en los grupos de neutrófilos CAR antes del día 32. En conjunto, nuestros datos demostraron la importancia de la preparación de neutrófilos y la optimización de la dosis en futuras aplicaciones clínicas de la terapia con neutrófilos.

Discusión

Se ha demostrado que los neutrófilos de ratón son un potente portador para administrar nanofármacos de manera eficiente a tumores cerebrales inflamados posoperatorios8,9. Aún así, la viabilidad y seguridad del uso de neutrófilos humanos en la administración de fármacos siguen siendo difíciles de alcanzar. La gran cantidad de neutrófilos de ratón (10 veces mayor que el número total de neutrófilos circulantes en ratones11) utilizada en estos estudios para lograr un beneficio terapéutico puede dificultar aún más su traducción clínica, ya que la extracción de grandes cantidades de neutrófilos de pacientes con cáncer puede provocar neutropenia y plantear otros riesgos. Para abordar estos desafíos, aprovechamos el poder de las hPSC autorrenovables para obtener neutrófilos humanos de novo ilimitados29. Desarrollamos un potente sistema de administración de fármacos mediado por neutrófilos bioinspirado con ingeniería CAR29 y utilizamos neutrófilos CAR humanos diseñados como nanoportadores con sorprendentes actividades antitumorales. Las NP de SiO2 rugosas funcionan mejor que las NP de SiO2 suaves en portadores de neutrófilos CAR, lo que coincide con observaciones previas de que los neutrófilos fagocitan preferentemente patógenos microbianos rugosos30. Se informó que los neutrófilos promueven la proliferación y progresión de las células de glioma48. Observamos un efecto protumoral similar de los neutrófilos no modificados en nuestro estudio con animales, lo que destaca la necesidad de ingeniería CCAR u otras modificaciones en los neutrófilos para garantizar su seguridad en la administración de fármacos y otras aplicaciones terapéuticas. En particular, nuestra administración de fármacos mediada por neutrófilos CAR depende únicamente de la capacidad quimioatrayente nativa del GBM, pero no de las señales inflamatorias posquirúrgicas amplificadas, lo que sugiere la alta especificidad y el potencial terapéutico de nuestro sistema de administración de fármacos para erradicar los gliomas profundamente infiltrados. que no se puede eliminar mediante cirugía. Dado que la resección quirúrgica y la quimioterapia/radioterapia adyuvante son las principales intervenciones clínicas para GBM12, el tratamiento combinado con nanoportadores de neutrófilos CAR y cirugía/radioterapia puede lograr una eficacia terapéutica óptima y merece una mayor investigación. Las construcciones CAR específicas de células T y NK se han utilizado ampliamente para mejorar las actividades antitumorales de las células T y NK, pero no se han descrito CAR específicas de neutrófilos que mejoren las funciones antitumorales de los neutrófilos. Anteriormente se informó que los receptores inmunes quiméricos CD4ζ y CD4 mejoran la citólisis de neutrófilos contra células transfectadas con VIHenv in vitro. Aún así, la eficiencia de la lisis fue de solo ~10 % con una relación efector-objetivo (E:T) de 10:128. Fc RIIA (CD32a) es un receptor transmembrana monocatenario de baja afinidad para IgG monomérica que se expresa altamente en neutrófilos (30,000 a 60,000 moléculas/célula31), y su ligación induce Fc - funciones dependientes en los neutrófilos, como la liberación del contenido de los gránulos, la movilización de Ca2+, la citotoxicidad antitumoral y la fagocitosis49. Dado el papel destacado de CD32a en la activación y función de los neutrófilos, diseñamos y probamos construcciones CAR basadas en CD32a. Sin embargo, nuestros resultados demostraron que CD3ζ media una citólisis significativamente mejor que CD32a cuando se expresa en neutrófilos derivados de hPSC, lo que puede deberse en parte a las copias más altas de ITAM en CD3ζ que en CD32a: tres y una copias, respectivamente, y niveles de expresión más altos de ζ que en la superficie celular de los neutrófilos28. Al igual que CD32a, Fc RIII (CD16b) es otro receptor de baja afinidad para IgG monomérica y se expresa a un nivel mucho más alto que CD32a en los neutrófilos31. Si bien el entrecruzamiento de CD16b solo induce la movilización y desgranulación de Ca2+, pero no la fagocitosis y la citólisis en neutrófilos28,50, seguirá siendo de interés en futuros estudios realizar una comparación sistemática de las capacidades de CD3ζ- y CD16b. -CAR para desencadenar y mejorar las funciones antitumorales de los neutrófilos.

Figura 6|Distribución in vivo de nanopartículas (NP) R-SiO2-TPZ administradas por neutrófilos CAR. a Esquema de NP de CAR neutrophil@R-SiO2 y NP de R-SiO2 marcadas con Cy5- administradas por vía intravenosa para un estudio de seguimiento celular in vivo. Se implantaron estereotácticamente 5 × 105 células U87MG que expresan luciferasa (Luci) en el prosencéfalo derecho de ratones NRG. Después de 4 días, los ratones fueron tratados por vía intravenosa con PBS, 5 × 106 Cy5-CAR neutrophil@R-SiO2 NP y R-SiO2 NP marcados. b La biodistribución dependiente del tiempo de los neutrófilos Cy5+ en todo el cuerpo, el cerebro y otros órganos se determinó y cuantificó mediante imágenes de fluorescencia en las horas indicadas. c La biodistribución de CAR neutrophil@R-SiO2 NP y R-SiO2 NP en ratones a las 24 h después de la inyección se analizó mediante espectrometría de emisión óptica de plasma acoplado inductivamente (ICP-OES) basada en el elemento Si, y los datos se expresaron como porcentaje. de dosis inyectada por gramo de tejido (%ID/g). n=5 muestras biológicamente independientes. Los datos se representan como media ± DE. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. d Se mostraron imágenes de fluorescencia representativas de CD45 y SiO2 en los xenoinjertos de glioblastoma indicados aislados de ratones con tumores. Barras de escala, 100 μm. Los triplicados biológicos se realizaron de forma independiente.

Figura 7|Las actividades antitumorales in vivo de la combinación de neutrófilos CAR y nanopartículas (NP) R-SiO2-TPZ se evaluaron mediante inyección intravenosa. a Esquema de PBS, PB-neutrófilos, CAR-neutrófilos y CAR-neutrophil@ R-SiO2-TPZ NP administrados por vía intravenosa para un estudio de eliminación de tumores in vivo. Se implantaron estereotácticamente 5 × 105 células U87MG que expresan luciferasa (Luci) en el prosencéfalo derecho de ratones NRG. Después de 4 días, los ratones fueron tratados por vía intravenosa con los neutrófilos indicados semanalmente durante un mes. La carga tumoral dependiente del tiempo se determinó (b) y se cuantificó (c) mediante imágenes bioluminiscentes (BLI) en los días indicados. Los datos son media ± DE para ratones en (b) (n=5), análisis de varianza unidireccional (ANOVA). d Se mostró la curva de Kaplan-Meier que demuestra la supervivencia de los grupos experimentales indicados (n=5). El factor de necrosis tumoral humano (TNF) y la IL-6 liberados en la sangre periférica (e) y el peso corporal (f) de diferentes grupos de ratones se midieron en los días indicados. Los datos son media ± DE, n=5 muestras biológicamente independientes. g, h Se evaluó la actividad antitumoral de frecuencias de dosificación aumentadas de neutrófilos CAR y RSiO2-TPZ NP. g Esquema de neutrófilos CAR administrados por vía intravenosa, NP R-SiO2-TPZ y NP CAR-neutrophil@ R-SiO2-TPZ para un estudio de destrucción de tumores in vivo. h Se mostró la curva de Kaplan-Meier que demuestra la supervivencia de los grupos experimentales indicados (n=5). Las curvas de Kaplan-Meier se analizaron mediante la prueba de rangos logarítmicos. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

También presentamos aquí una plataforma de administración de fármacos para neutrófilos hPSC modular y versátil que puede rediseñarse y ajustarse en el futuro para respaldar otros esfuerzos basados ​​en neutrófilos para tratar otras enfermedades humanas. En primer lugar, la ingeniería CAR es más accesible en las hPSC que en las células T inmunes primarias y los neutrófilos. Solo requiere una edición del genoma una sola vez para lograr una expresión estable y homogénea de varios CAR29. Además de los CLTX CAR, también construimos líneas estables de hPSC que expresan un CAR anti-fluoresceína universal (FITC)51 o anti-PD-L1 CAR52, los cuales podrían aprovecharse para obtener neutrófilos CAR nanoportadores universales dirigidos a tumores sólidos. También se pueden realizar otras modificaciones genéticas, como la fibrosis dirigida a los CAR anti-FAP53, para dirigir los nanoportadores de neutrófilos para tratar enfermedades degenerativas fatales, incluidos los traumatismos cerebrales y la fibrosis cardíaca. Además, las hPSC que expresan CAR también podrían adaptarse fácilmente para producir células CAR-T o CAR-NK29, y las combinaciones de estas inmunoterapias con nanoportadores de neutrófilos CAR pueden lograr beneficios terapéuticos antitumorales óptimos. Finalmente, nuestro sistema de nanofármacos bioinspirado que responde al glutatión tumoral (GSH) es una plataforma modular y versátil para cargar fármacos radioactivos o quimioterapéuticos prometedores en neutrófilos CAR para la administración dirigida de fármacos, como lo ejemplifican el TMZ clínico, JNJ64619187 y el profármaco TPZ. Los estudios futuros sobre la prueba de otras nanopartículas pueden producir una carga optimizada del fármaco en los neutrófilos y lograr la máxima eficacia terapéutica in vivo.

Si bien hemos demostrado el concepto terapéutico del uso de neutrófilos CAR para administrar de manera específica y eficiente medicamentos quimio a los tumores cerebrales en toda la BBB, existen algunas limitaciones en este estudio. En primer lugar, la inoculación de células tumorales de 4- días puede no ser suficiente para establecer tumores que imiten el escenario clínico para la investigación terapéutica, y es necesario trabajar en el futuro con diferentes períodos de inoculación de tumores para recapitular las diferentes etapas del desarrollo del glioblastoma y la respuesta terapéutica en diferentes pacientes54,55. En segundo lugar, los ratones inmunodeficientes que utilizamos aquí carecen de inmunidad adaptativa, y se necesitan otros modelos preclínicos con un sistema inmunológico intacto, como perros con glioma espontáneo56, para evaluar mejor la seguridad y eficacia de los neutrófilos CAR producidos in vitro. En particular, se necesita un perfil de toxicidad fuera del objetivo de los neutrófilos CAR con o sin carga de nanofármacos en animales infundidos, incluido el síndrome de liberación de citoquinas, neurotoxicidad y toxicidades fuera del tumor observadas en las células CAR-T57, a pesar de su corta vida útil. de neutrófilos. Si bien se dispone de enfoques viables, como la ingeniería de hPSC de donantes universales hipoinmunógenos58–61 y el almacenamiento de bibliotecas de hPSC homocigotas de antígeno leucocitario humano (HLA)62, para evitar el riesgo potencial de enfermedad de injerto contra huésped (EICH), se pueden utilizar modelos animales preclínicos con una Todavía se necesitan sistemas inmunológicos intactos para evaluar el potencial de traducción de nuestras terapias con neutrófilos. Finalmente, se observó una citotoxicidad antitumoral limitada y una extensión de la vida útil de los animales con nanofármacos CAR-neutrófilos. Por lo tanto, la exploración futura de fármacos de quimioterapia o radiosensibilizadores más eficaces y terapias combinadas con CAR-T clásico y resección quirúrgica es esencial para lograr la máxima eficacia antitumoral de las terapias con neutrófilos CAR. Por ejemplo, un estudio reciente sobre diseño basado en mecanismos ha llevado a un fármaco KL-50 más eficaz que supera la resistencia adquirida como se observa en el fármaco clínico TMZ63 y, por lo tanto, puede incorporarse a nuestra plataforma modular de nanofármacos CAR-neutrófilos para un potencial mejor eficacia terapéutica. También se puede ampliar la vida útil de los neutrófilos a 5 días mediante el tratamiento CLON-G (caspasas-permeabilización de la membrana lisosomal-oxidante-inhibición de la necroptosis más factor estimulante de colonias de granulocitos64) y/o utilizar un sistema de liberación controlada de fármacos a más largo plazo en los neutrófilos CAR. lograr una eficacia antitumoral sostenida in vivo después de la apoptosis de neutrófilos. En conjunto, nuestros hallazgos demostraron claramente que los neutrófilos CAR cargados con R-SiO2-TPZ podrían mantener el fenotipo antitumoral N1 y matar eficientemente las células tumorales en diversas condiciones similares a nichos tumorales in vitro. También se podrían producir neutrófilos CAR funcionales en grandes cantidades a partir de hPSC diseñadas para administrar con precisión nanofármacos sensibles al microambiente tumoral para atacar el GBM in vivo, lo que conduciría a una quimioinmunoterapia combinatoria con actividades anti-GBM sólidas y específicas y una administración mínima de fármacos fuera del objetivo que vida útil prolongada en ratones portadores de tumores.

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