La senescencia reconecta la detección del microambiente para facilitar la inmunidad antitumoral

ABSTRACTO

La senescencia celular implica una detención estable del ciclo celular junto con un programa secretor que, en algunos casos, estimula la eliminación inmune de las células senescentes. Utilizando un modelo de cáncer de hígado inmunocompetente en el que la senescencia desencadena el rechazo tumoral mediado por células T CD8, mostramos que la senescencia también remodela el proteoma de la superficie celular para alterar la forma en que las células tumorales detectan los factores ambientales, como lo ejemplifica el interferón tipo II (IFN). En comparación con las células en proliferación, las células senescentes regulan positivamente el receptor de IFN, se hipersensibilizan al IFN microambiental e inducen con mayor fuerza la maquinaria presentadora de antígenos, efectos que también se recapitulan en las células tumorales humanas sometidas a senescencia inducida por terapia. La alteración de la detección de IFN en las células senescentes debilita su eliminación mediada por el sistema inmunológico sin desactivar el estado de senescencia o su programa secretor característico. Nuestros resultados demuestran que las células senescentes tienen una capacidad mejorada para enviar y recibir señales ambientales e implican que cada proceso es necesario para su vigilancia inmune efectiva.

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SIGNIFICADO:

Nuestro trabajo descubre una interacción entre la remodelación de tejidos y los programas de detección de tejidos que la senescencia puede activar en cánceres avanzados para hacer que las células tumorales sean más visibles para el sistema inmunológico adaptativo. Esta nueva faceta de la senescencia establece interacciones de señalización heterotípicas recíprocas que pueden inducirse terapéuticamente para mejorar la inmunidad antitumoral.

INTRODUCCIÓN

La senescencia celular es un programa de respuesta al estrés caracterizado por una detención estable del ciclo celular y un programa secretor capaz de remodelar el entorno tisular (1). En los tejidos normales, la senescencia contribuye a la homeostasis del tejido durante la cicatrización de heridas; sin embargo, en tejidos envejecidos o dañados, la acumulación aberrante de células senescentes puede causar inflamación crónica y reducción de la capacidad regenerativa del tejido (2–4). En el cáncer, se ha demostrado que la senescencia media efectos tanto beneficiosos como perjudiciales sobre la biología de los tejidos. Por un lado, la senescencia proporciona una barrera a la tumorigénesis iniciada por oncogenes y contribuye a la actividad antitumoral de algunas terapias contra el cáncer (5, 6). Por otro lado, la persistencia de células tumorales senescentes después de la terapia puede producir un entorno tisular que promueva la recaída y la metástasis (7, 8). Los fundamentos moleculares de estos resultados biológicos opuestos siguen siendo poco conocidos. Una faceta del programa de senescencia que probablemente contribuya a una biología tan diversa es el fenotipo secretor asociado a la senescencia (SASP; ref. 9). SASP se activa a través de un proceso de remodelación global de la cromatina que evoluciona y está controlado por reguladores epigenéticos clave como BRD4 y factores de transcripción proinflamatorios como NF-κB y C/EBP- (10-12). Esto, a su vez, conduce a la inducción de genes que codifican proteínas remodeladoras de tejidos, como metaloproteinasas de matriz, factores de crecimiento y factores fibrinolíticos que se sabe que desempeñan funciones cruciales en el proceso de cicatrización de heridas (3, 13, 14). Otros componentes de SASP incluyen quimiocinas y citocinas que pueden alterar la composición y el estado de las células inmunitarias dentro del tejido, lo que lleva a la selección y eliminación de las propias células senescentes mediadas por el sistema inmunitario (15, 16). No obstante, la acumulación aberrante de células senescentes en muchos contextos patológicos implica que la eliminación mediada por el sistema inmunológico no es un resultado universal de la senescencia o del SASP y plantea la posibilidad de que mecanismos adicionales dicten los efectos paradójicamente beneficiosos y perjudiciales de la senescencia en la biología de tejidos y la vigilancia inmune. (17-19).

Ciertamente, la vigilancia inmune asociada a la senescencia puede tener potentes efectos anticancerígenos, aunque los mecanismos efectores precisos varían según el tejido y el tipo de célula (10, 15, 16, 20). En modelos murinos de carcinoma hepatocelular (CHC), las células tumorales hepáticas que se activan para senescer se eliminan mediante mecanismos inmunodependientes activados por p53 de tipo salvaje (WT) (15). De acuerdo, TP53 está frecuentemente mutado en el CHC humano, particularmente en los tumores de "clase de proliferación" que muestran el peor pronóstico (21, 22). Aunque la inmunoterapia y los fármacos dirigidos a TP53-se están perfilando como estrategias prometedoras para mejorar los resultados de las enfermedades, la base molecular de la respuesta y la resistencia sigue siendo desconocida (23-25). Por lo tanto, comprender los mecanismos por los cuales las células tumorales hepáticas senescentes se vuelven visibles para el sistema inmunológico puede facilitar estrategias para provocar inmunidad antitumoral en el CHC mutado en TP53-que puede extenderse a otros tipos de tumores.

Aquí, nos propusimos establecer principios que modulen el reconocimiento inmunológico y la eliminación de células senescentes para identificar mecanismos de senescencia procesables que puedan explotarse para mejorar el control inmunológico del cáncer. Con este fin, desarrollamos un nuevo modelo "inducible por senescencia" en el que las células de cáncer de hígado pueden cambiar selectivamente a un estado senescente mediante la modulación genética de p53 endógeno. Razonamos que esto imitaría los efectos de las terapias que desencadenan la senescencia (26, 27) y al mismo tiempo evitaría los efectos confusos de las terapias que inducen la senescencia en las células inmunes u otros componentes del entorno tisular. Usando este modelo y luego extendiéndolo a otros sistemas, revelamos que, además del SASP, la senescencia impulsa una remodelación importante del proteoma de la superficie celular y programas de señalización de una manera que se predice que alterará fundamentalmente la forma en que las células perciben y responden a las condiciones ambientales. señales, ejemplificadas aquí a través de hipersensibilidad al IFN microambiental tipo II (IFN). Este proceso permite una regulación positiva más sólida de la maquinaria de procesamiento y presentación de antígenos en las células tumorales senescentes que las hace susceptibles a la vigilancia inmune in vivo. Por lo tanto, nuestros resultados revelan un programa de detección de tejido reconectado en células senescentes que actúa en conjunto con SASP para aumentar su potencial inmunogénico, facilitando así el rechazo de tumores mediado por el sistema inmunológico.

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RESULTADOS

Un p53-modelo de tumor inmunocompetente restaurable para estudiar la vigilancia de la senescencia

Para estudiar cómo la senescencia reprograma los estados celulares y tisulares, explotamos una técnica de inyección hidrodinámica en la vena de la cola (HTVI) (28) para generar un modelo de cáncer de hígado inducible por senescencia controlado por un ARN de horquilla corta (shRNA) p53 restaurable y específico del tumor. Específicamente, se transfectaron hepatocitos hepáticos adultos de ratones Bl/6 inmunocompetentes in vivo con un vector transposasa SB13 de la bella durmiente y dos construcciones de transposones (que codifican NrasG12D-IRES-rtTA y TRE-tRFP-shp53, o "NSP") que se integran en el genoma. . En este sistema Tet-On, la p53 endógena se suprime en presencia de doxiciclina (Dox) mediante la activación de shRNA inducible vinculado a RFP (Fig. 1A), lo que permite el control genético de la senescencia en tumores establecidos. De acuerdo con la coexistencia de mutaciones que inactivan TP53 y activan vías de señalización de proliferación celular (p. ej., cascadas PI3K/AKT y RAS/MAPK) en tumores hepáticos humanos, la cooperación entre RAS oncogénico y la supresión de p53 condujo a la transformación de hepatocitos, y la mayoría ratones que desarrollaron tumores con características poco diferenciadas de 5 a 8 semanas después del HTVI. El perfil transcripcional reveló que estos tumores murinos se parecen a la clase de "proliferación" del CHC humano (Figuras complementarias S1A-S1F), que es la clase típica de CHC humano que alberga mutaciones de TP53 (21, 22, 29).

Según trabajos anteriores (15), anticipamos que la reactivación de p53 en el sistema anterior desencadenaría la senescencia y activaría la inmunidad antitumoral. En consecuencia, la retirada de Dox desencadenó dramáticas regresiones tumorales durante varias semanas, lo que llevó a una supervivencia prolongada de los animales (Fig. 1B y C). El análisis de los tumores 14 días después de la retirada de Dox reveló la regulación negativa esperada del shRNA de p53 (como lo visualizó el reportero de RFP vinculado) y la acumulación de -galactosidasa asociada a la senescencia (SA- -gal) sin ningún efecto notable en la Efector RAS p-ERK (Fig. 1D). De manera similar, se observó un aumento en la actividad de SA- -gal y los perfiles transcripcionales asociados a SASP, junto con una detención proliferativa concomitante, en células tumorales explantadas de 6 a 8 días después de la restauración de p53 (Figuras complementarias S2A-S2H). Es de destacar que el injerto de estos cultivos (mantenidos en Dox para mantener el silenciamiento de p53) en ratones inmunocompetentes alimentados con Dox produjo tumores secundarios sincrónicos y focales que retrocedieron con una cinética similar a la de los tumores primarios tras la retirada de Dox (Fig. 1B; Fig. Suplementaria S3A-). T3E). Los experimentos de control que utilizaron un sistema Tet-Off o incorporaron un shRNA de p53 constitutivo descartaron la posibilidad de que el propio Dox tuviera algún efecto sobre el comportamiento del tumor en nuestro modelo (Figuras complementarias S3F y S3G). Por tanto, este sistema permite inducir eficientemente la senescencia en las células tumorales sin recurrir a terapias que también puedan alterar el sistema inmunológico del huésped. Dada su flexibilidad adicional, utilizamos el modelo de trasplante ortotópico (en adelante denominado "NSP") para muchos de los estudios mecanicistas que se describen a continuación. Como se anticipó, las marcadas regresiones tumorales mencionadas anteriormente fueron mediadas inmunitariamente. Por lo tanto, los tumores NSP que surgieron después del trasplante en ratones desnudos y Rag2-/-Il2rg-/- (R2G2) inmunocomprometidos sufrieron una respuesta citostática prominente pero no lograron retroceder, y los animales R2G2 mostraron los defectos más profundos (Fig. 1E-G; Suplementario). Figuras S3H y S3I). Como los ratones desnudos tienen deficiencias en la inmunidad adaptativa y R2G2 también está comprometido en aspectos de la inmunidad innata, estos resultados implican que el sistema inmunológico adaptativo es esencial para la regresión tumoral eficiente en el modelo y establece un contexto experimental bien controlado para explorar la base mecanicista de estos efectos.

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La senescencia desencadena un cambio de la evasión inmune tumoral al reconocimiento inmunológico

Para caracterizar los efectos paracrinos supresores de tumores de la senescencia, a continuación caracterizamos los microambientes inmunes de los tumores que albergan p53-suprimidos (denominados "proliferativos") y p53-restaurados (denominados "senescentes"). ) células tumorales después de 1 semana de retirada de Dox, un momento en el que se establece la senescencia, pero los tumores aún no han retrocedido (Figuras complementarias S2, S3 y S4A). Las lesiones que albergan células tumorales senescentes mostraron un aumento de aproximadamente 1,8-veces en el total de células inmunes CD45+ en comparación con los controles en proliferación (Fig. 2A; refs. 15, 16). Los análisis inmunofenotípicos e histológicos (el día 9 después de la retirada de Dox) revelaron que esto implicaba un aumento destacado en el porcentaje de linfocitos (células B, células T CD4 y células T CD8) y una disminución en el porcentaje de Gr1+ células supresoras / neutrófilos derivados de mieloides (CD11b + Gr 1+ Ly6Clo; Fig. 2B; Figs. Suplementarias S4B). Aunque la fracción de macrófagos como porcentaje de la población total de CD45 se mantuvo sin cambios, los números absolutos aumentaron notablemente (Fig. 2A y B; Fig. Suplementaria S4C-S4E). Dentro de la población de células T, las células T CD8 acumuladas mostraron marcadores de experiencia antigénica (CD44+, CD69+) y albergaron una mayor población de células efectoras (CD44+CD62L-; Fig. .2C; ref. 30). Esta remodelación general del entorno inmunológico condujo a un aumento significativo en la proporción CD3:neutrófilos para tumores que albergan células senescentes (Figura complementaria S4F), efectos consistentes con aumentos similares en la proporción CD3:neutrófilos que se han asociado con la reactividad inmune en humanos. tumores hepáticos (31). La remodelación se podría visualizar mediante imágenes en 3D después de la limpieza del tejido (Fig. 2D; Fig. Suplementaria S4G y S4H; Video complementario S1; ref 32).

Figura 1. Un modelo de tumor p53-restaurable para estudiar la vigilancia inmune de la senescencia. A, Generación del modelo de cáncer de hígado de ratón p53-restaurable, impulsado por NRAS, utilizando el sistema de transposones de la bella durmiente administrado a través de HTVI. (Creado con BioRender.com.) B, Ultrasonograma representativo de modelos de cáncer de hígado con inyección ortotópica y HTVI en el momento indicado después de la restauración de p53. C, Análisis de supervivencia de ratones en el modelo HTVI. D, Tinción representativa con hematoxilina y eosina (H&E), inmunofluorescencia (IF) y galactosidasa asociada a la senescencia (SA- -gal) de p53-suprimido (p53 desactivado) y restaurado (p53 activado para 14 días) secciones de tumores generadas a partir del modelo HTVI. Barras de escala, 5{{30}} μm. E – G, Inyección ortotópica de células tumorales NSP transducidas con vector GFP-luciferasa en hígados de cepas de ratones inmunocompetentes e inmunodeficientes. E, Cambio de tamaño del tumor medido mediante ecografía tras la restauración de p53. R2G2, Rag2-Il2rg ratón de doble golpe. Los datos se presentan como media ± SEM. n Mayor o igual a 9 para cada cepa. F, Imágenes macroscópicas representativas a los 21 días de p53 dentro o punto final p53 fuera del tumor. G, tinción IHC representativa de células tumorales marcadas con GFP el día 21 tras la restauración de p53. Barras de escala, 100 μm. **, P < 0,01; ***, P < 0,001.

Para identificar los tipos de células inmunitarias específicas responsables de la vigilancia inmunitaria de las células tumorales senescentes, generamos cohortes paralelas de ratones que albergan tumores NSP ortotópicos y examinamos el impacto del agotamiento de varias poblaciones de células inmunitarias en las regresiones tumorales después de la retirada de Dox. Mientras que el bloqueo de anticuerpos dirigidos a neutrófilos/monocitos (Gr1), células asesinas naturales (NK) (NK1.1) y células T CD4 (GK1.5) no tuvo ningún efecto, el agotamiento de las células T CD8 (2.43) y macrófagos (usando clodronato liposomal , que se dirige selectivamente a los macrófagos (CD11b+F4/80+) pero no a las células dendríticas clásicas (CD11b-CD11c+MHC-II+CD103+; refs. 33, 34) con una regresión tumoral marcadamente deteriorada (Fig. 2E; Fig. Suplementaria S4I). Para caracterizar cómo la senescencia tumoral impulsada por p53- da como resultado una inmunidad antitumoral productiva, realizamos un análisis de secuencia de ARN unicelular (scRNA-seq) de células CD45 recién aisladas de NSP en proliferación y senescentes. tumores poco después de la retirada de Dox (8 días; Figuras complementarias S5A y S5B) y utilizó el algoritmo de prueba de abundancia diferencial Milo (35) para capturar los cambios en el estado celular dentro de los tipos de células inmunes que median este proceso (Figuras complementarias S5C-S5F). En línea con su contribución a la regresión tumoral, las subpoblaciones de macrófagos y células T CD8 mostraron cambios marcados en cantidad y estado. En cuanto a las células T, los tumores proliferantes (p53-suprimidos) se enriquecieron significativamente en estados T CD8 que exhiben una alta expresión tanto de marcadores de disfunción (Tox, Tigit, Lag3, Ctla4, Pdcd1/PD1 y Cd160) como de marcadores de activación (Prf1 (Figura 2F y G; Figura complementaria S5G; Tabla complementaria S1). Estas células T CD8 también mostraron niveles altos de Tnfrsf9, un marcador conocido por delinear subconjuntos de células T que tienen la capacidad de revitalizarse en el CHC humano y otros tipos de cáncer (36, 37). En marcado contraste, en las lesiones senescentes (p53-reactivadas), las poblaciones de CD8 T parecían altamente activadas, mostrando niveles bajos de marcadores de disfunción y alta expresión de citocinas efectoras (p. ej., Ifng, Tnf; Tabla complementaria S1). En consecuencia, el perfil transcripcional de los tejidos tumorales en masa mostró firmas inmunes activas y citotóxicas en tumores senescentes en regresión (Figura complementaria S5H; ref. 38).

Figura 2. La senescencia desencadena un cambio tumoral de evasión inmunitaria a reconocimiento inmunitario. A, Imágenes representativas de tinción con CD45 y GFP que marcan células inmunitarias y células tumorales, respectivamente, en tumores p53-suprimidos y p53-restaurados (7 días después de la restauración de p53). A la derecha, la cuantificación del área de tinción con CD45+ se calculó a partir de 3 campos aleatorios por ratón. Cada punto representa un ratón. B, Análisis de citometría de flujo del panorama inmunológico global en un modelo de tumor hepático ortotópico NSP. El inmunofenotipado de los tumores senescentes se realiza 9 días después de la retirada de Dox, un momento en el que el estado senescente está completamente establecido, aunque precede a la regresión masiva del tumor. G-MDSC, células supresoras granulocíticas derivadas de mieloides; M-MDSC, células supresoras monocíticas derivadas de mieloides. Los datos se combinan a partir de 2 experimentos independientes, con n=7 en el grupo proliferativo y n=9 en el grupo senescente. Tenga en cuenta que, a medida que aumenta el número absoluto de células CD45+ en las lesiones tumorales NSP senescentes (A), también lo hacen los números totales de los tipos de células indicados. C, análisis de citometría de flujo de células T CD8. Los datos se combinan a partir de 2 experimentos independientes, con n=11 en los grupos proliferantes y n=10 en los grupos senescentes. Los experimentos se realizaron 9 días después de la retirada de Dox. D, Imágenes representativas de limpieza de tejido de los tumores hepáticos ortotópicos NSP. Las células T, los neutrófilos y la vasculatura se marcan mediante tinción con CD3, MPO y CD31, respectivamente. Las muestras se recolectaron 9 días después de la retirada de Dox. E, Cambio en el tamaño del tumor medido mediante ultrasonido tras la restauración de p53 en ratones después de agotar tipos de células inmunitarias específicas mediante anticuerpos o fármacos. F, izquierda, gráfico de proyección y aproximación múltiple uniforme (UMAP) de células T CD8 aisladas de tumores p53-proliferantes suprimidos (PRO) y p{{30}}reactivados (SEN). Derecha, análisis de enriquecimiento del conjunto de genes de genes marcadores de agotamiento de células T en células T CD8+ de tumores proliferantes (p53-suprimidos) versus senescentes (p53-reactivados). NES: puntuación de enriquecimiento normalizado; Pval, valor P. G, gráfico UMAP de la expresión de genes seleccionados (Cd8a, Cd44, Tnfrsf9, Cd69, Tox y Fasl) entre células T CD8 aisladas de células senescentes (p{{40}}reactivadas) y en proliferación (p{ {41}}tumores suprimidos). H, Imágenes representativas de inmunofluorescencia de células T CD8 y tinción de macrófagos F4/80-positiva en el tumor hepático ortotópico NSP. Se recogieron muestras de tumores 9 días después de la retirada de Dox. Los datos se presentan como media ± SEM. Todas las barras de escala, 100 μm. Se utilizó una prueba t de Student de dos colas. *, P < 0,05; **, P < 0,01.

Los cambios en el compartimento de los macrófagos proporcionaron evidencia adicional de que la senescencia de las células tumorales desencadenó un cambio de evasión inmune a vigilancia. Por lo tanto, scRNA-seq, inmunofenotipado e histología indicaron que los fenotipos de macrófagos asociados a tumores pasaron de F4/80lo; Estados CD11chi (grupo 8), incluidas poblaciones de PD-L1+ inmunosupresoras (características de los tumores de HCC humanos con mal pronóstico; refs. 39, 40) a F4/80hi; Estados CD11c- (grupo 0), definidos por la alta expresión de una firma genética de presentación de antígeno (Figuras complementarias S5E-S5J y S6A y S6B; Tabla complementaria S1). Es de destacar que estos F4/80hi asociados a la senescencia; Los macrófagos CD11c- fueron particularmente sensibles al tratamiento con clodronato liposomal (Figuras complementarias S6C-S6E), lo que también resultó en una reducción significativa en la fracción de células T CD8 activas pero no en las células T CD4 (Figuras complementarias S6F y S6G), lo que indica un CD8 Respuesta inmune dependiente de T que implica cooperación con macrófagos. En consecuencia, los análisis histológicos confirmaron que las células T CD8 acumuladas y los macrófagos F4/80+ se coenriquecían con frecuencia después de la inducción de la senescencia en los tumores (Fig. 2H; Fig. Suplementaria S4D). En conjunto, estos análisis biológicos y moleculares respaldan un modelo en el que la senescencia de las células tumorales induce un cambio abrupto de la evasión inmune a la vigilancia inmune mediada por cambios en los macrófagos y los estados de las células T CD8, lo que conduce a una inmunidad antitumoral productiva y, en última instancia, al rechazo del tumor.

La senescencia remodela los programas de detección de tejidos y el panorama de la superficie celular

A continuación, nos propusimos explotar el modelo anterior para comprender los mecanismos moleculares responsables de hacer que las células tumorales senescentes sean visibles para el sistema inmunológico. La inducción de senescencia implica un programa de remodelación de la cromatina que silencia genes proliferativos y activa muchos genes que codifican factores SASP, siendo este último programa dependiente en gran medida del lector potenciador BRD4 (10). Por lo tanto, realizamos experimentos de perfiles transcripcionales en células NSP en condiciones de proliferación (p53-suprimida) versus senescentes (p53- restaurada) en ausencia y presencia de JQ1, un fármaco que inhibe la función BRD4 (Tabla complementaria S2). ). De acuerdo con las expectativas, la restauración de p53 redujo drásticamente la expresión de genes proliferativos e indujo la expresión de factores SASP bien conocidos (Fig. 3A; Fig. Suplementaria S7A; ref. 7), incluidas varias citocinas que se sabe que estimulan las células T (Cxcl16, Il18). ) o activación y reclutamiento de macrófagos (Csf2, que codifica la proteína GM-CSF) o previamente vinculados a la senescencia (Igfbp7, Igfbp3, Pdgfa). Como se anticipó en trabajos anteriores (10), muchas de las transcripciones de codificación de SASP reguladas positivamente (aproximadamente 65%) dependían de BRD4- (Figura complementaria S7B). De manera similar, las células senescentes secretaron una variedad de factores de crecimiento y moduladores inmunes, según lo evaluado mediante ensayos de citoquinas multiplexadas, incluidos los atrayentes de células T y macrófagos CCL5, CXCL9 y GMCSF, así como el factor de remodelación de la vasculatura VEGF (Figura complementaria). .S7C). Por lo tanto, la senescencia en las células tumorales NSP p53-restauradas se asocia con una SASP robusta, consistente con la marcada remodelación del ecosistema inmunológico caracterizada anteriormente.

Sorprendentemente, el examen de la localización subcelular de genes expresados ​​diferencialmente (DEG) reveló que las células tumorales senescentes no sólo aumentaron su expresión de factores SASP secretados ("extracelulares", EC), sino que también mostraron cambios importantes en los niveles de expresión de transcritos que codifican proteínas de superficie. ("membrana plasmática", PM; Fig. 3B). De hecho, el 25% del total de DEG regulados positivamente codificaron proteínas PM, un enriquecimiento significativo que se desvió de la distribución aleatoria (15%; Fig. 3B). Los PM-DEG dinámicos se vincularon a la transducción de señalización de la proteína tirosina quinasa (Nrp1, Egfr), la actividad del receptor de citoquinas (Ifngr1), los receptores de la matriz extracelular (Itgb3, Cd44) y los transportadores de iones (Slc12a1, Slc24a3) y capturaron moléculas conocidas asociadas a la senescencia ( Cd44, Vcam1 e Itgb3), lo que sugiere que las células senescentes pueden tener una capacidad mejorada para interactuar y detectar su entorno (Fig. 3C; Fig. complementaria S7D; refs. 41–43). Curiosamente, JQ1 mitigó el aumento asociado a la senescencia en la expresión de muchas de estas proteínas PM, lo que sugiere que su inducción puede ser parte del programa más amplio de remodelación de la cromatina acoplado a SASP (Fig. 3D; ref. 10). Es de destacar que también se produjeron cambios profundos en la transcripción de genes que codifican proteínas PM en células tumorales de NSP deficientes en p53- tratadas con la combinación de fármacos inductores de senescencia trametinib y palbociclib (Figura complementaria S7E, panel superior; Tabla complementaria S2; ref. 20) y en una serie de 13 líneas de cáncer humano mutantes TP53 WT y TP53- genéticamente diversas derivadas de cánceres de hígado, mama, pulmón y colon inducidos a senescencia por varios desencadenantes (Fig. 3E; Fig. complementaria. S7F; referencia 44). Esto fue particularmente sólido para los PM-DEG regulados al alza (pero no a la baja), que recuerdan los efectos observados para los factores EC SASP (Fig. 3E; Fig. complementaria S7E, panel inferior). Por lo tanto, la expresión marcadamente alterada de las proteínas de la superficie celular que observamos en nuestro modelo se extiende más allá de la senescencia inducida por p53-y puede ser un sello distintivo del estado senescente.

Figura 3. La senescencia remodela los programas de detección de tejidos y el paisaje de la superficie celular. A, Análisis de enriquecimiento del conjunto de genes (Reactome) de datos de secuencia de ARN de células tumorales hepáticas NSP en proliferación (PRO, p53 desactivado) versus senescentes (SEN, p53 activado durante 8 días) in vitro. NES: puntuación de enriquecimiento normalizada. B, Localización subcelular de DEG (P <0.05; cambio de veces> 2) en todos los genes detectados [transcripciones por millón de kilobases (TPM)> 1] de RNA-seq. C, Análisis de ontología genética (GO) de DEG que codifican proteínas PM reguladas positivamente en células senescentes. TM, transmembrana. D, Análisis transcriptómico de todos los DEG (proliferativos versus senescentes) en presencia o ausencia de tratamiento con JQ1. El grupo C1 (en rojo) contiene los genes específicos de la senescencia sensibles a JQ1, y el grupo C4 (en azul) contiene los genes específicos de la proliferación sensibles a JQ1. E, Metanálisis del conjunto de datos RNA-seq de SENESCopedia mediante la localización subcelular de DEG (igual que la Fig. 2D) y la prueba exacta de Fisher para examinar el enriquecimiento relativo de EC/PM-DEG regulados hacia arriba y hacia abajo desviados de la distribución aleatoria. Consulte también las figuras complementarias S7E y S7F. F, Análisis por espectrometría de masas (MS) del proteoma enriquecido con PM en células proliferativas y senescentes. El nivel de proteína se normaliza a la expresión media de la proteína de todas las muestras. Los controles son las muestras sin etiquetado de biotina que sirve como fondo. Los cuadros rojo y azul representan proteínas enriquecidas en células senescentes y en proliferación, respectivamente. n=6 para los grupos experimentales senescentes y proliferantes, y n=3 y 4, respectivamente, para su control. G, Distribución de proteínas PM anotadas con GeneCards reguladas al alza y a la baja perfiladas por MS. Carolina del Norte, sin cambios. H, Gráfico de volcán de proteínas PM anotadas en GeneCards perfiladas por MS.

Para validar la remodelación global de los factores PM en la senescencia a nivel de proteína, realizamos proteómica de superficie en células tumorales NSP senescentes y proliferantes isogénicas, utilizando un método de enriquecimiento de etiquetado con biotina, en el que las proteínas de la superficie celular se marcaron con biotina impermeable a la membrana. purificado y sometido a espectrometría de masas (Fig. 3F; Fig. complementaria S7G; ref. 45). Se observó una fuerte correlación entre las réplicas biológicas en cada condición (Figura complementaria S7H), y las proteínas detectadas se enriquecieron para las proteínas PM anotadas en un 60 % después de la inducción de la senescencia inducida por p53-. De 887 proteínas que se detectaron de manera reproducible, más del 50% se expresaron diferencialmente. La mayoría de las proteínas expresadas diferencialmente se correlacionaron bien con la direccionalidad observada en nuestros datos de perfiles transcripcionales, aunque algunas se expresaron diferencialmente sin un cambio correspondiente en los niveles de transcripción (Figura complementaria S7I).

Beneficios de cistanche para hombres: fortalece el sistema inmunológico.

Las proteínas de la superficie celular anotadas detectadas mediante espectrometría de masas tras la inducción de la senescencia incluyeron varias previamente vinculadas a la senescencia (p. ej., CD44 y VCAM1), varios receptores de factores de crecimiento y citocinas (p. ej., EGFR, ICAM1 e IFNGR1) y otros factores menos caracterizados (Fig. 3F – H; Figura complementaria S7J y S7K). Es de destacar que el conjunto de proteínas enriquecidas en la superficie celular identificadas en nuestro modelo mostró una superposición limitada con las identificadas en fibroblastos humanos que experimentan senescencia inducida por oncogenes (46), lo que sugiere heterogeneidad entre los tipos de células o desencadenantes de la senescencia. De todos modos, estos resultados muestran que, además de reconectarse en su programa secretor, las células senescentes experimentan cambios profundos en el contenido y la abundancia de proteínas de la superficie celular e implican que las células senescentes adquieren rasgos distintivos de detección de microambientes que pueden influir en su estado y destino in vivo. .

Las células senescentes están preparadas para detectar IFNg y amplificar la señalización de IFNg

Para identificar vías que podrían influir funcionalmente en cómo las células senescentes perciben su entorno, extrajimos conjuntos de datos transcripcionales y proteómicos en busca de cambios asociados a la senescencia relacionados con la inmunidad antitumoral. Curiosamente, el análisis de ontología genética (GO) reveló que la respuesta al interferón gamma (IFN) tipo II (47) estaba entre las 5 principales vías anotadas, enriquecidas durante la senescencia y dependientes de programas potenciadores específicos del estado celular (es decir, sensibles a JQ1-). ; es decir, "C1" de la Fig. 3D; Fig. Suplementaria S8A). Entre las transcripciones alteradas, observamos varios reguladores positivos de la señalización de IFN, incluida la subunidad del receptor de IFN IFNGR1 (una de las proteínas con mayor regulación positiva de nuestros datos proteómicos) y múltiples efectores de interferón (Irf1, Irf7 e Irf9; refs. 47, 48). ; Fig. 4A – C; Fig. Suplementaria S8B y S8C). Además de estos genes regulados positivamente sensibles a Brd 4-, las transcripciones que codifican reguladores negativos de la señalización de IFN (Ptpn2, Socs1 y Socs3) disminuyeron significativamente (Fig. 4C; refs. 49, 50). Se observaron cambios similares en células tumorales NSP tratadas con diferentes inductores de senescencia (Fig. 4C; Fig. Suplementaria S8D-S8G) y, más ampliamente, en un panel de 13 cánceres derivados de mama, pulmón, hígado y colon humanos. líneas celulares activadas para senescencia (Fig. 4D; ref. 44). Por lo tanto, los cambios en la expresión de los componentes de señalización del IFN tipo II son una característica general de las células senescentes, independientemente del tipo de célula, el genotipo celular, la especie y la naturaleza del inductor de senescencia. El aumento simultáneo de los efectores de señalización de IFN y la disminución de los reguladores negativos nos llevó a plantear la hipótesis de que las células senescentes se preparan para detectar IFN en su entorno. Para probar esta hipótesis directamente, tratamos células NSP en proliferación y senescentes con IFN recombinante y realizamos análisis de inmunotransferencia de la activación de la señalización JAK-STAT. Aunque el IFN aumentó drásticamente los niveles iniciales de STAT1 en ambos estados, las células senescentes acumularon más STAT1 fosforilado, independientemente del desencadenante de la senescencia (Fig. 4E; Fig. Suplementaria S8H). Además, también encontramos un mayor nivel de JAK1 fosforilado en células senescentes restauradas con p 53-, lo que respalda aún más nuestro hallazgo sobre una vía de señalización JAK-STAT más activa en células senescentes que detectan IFN (Figura complementaria S8I). Como se predijo a partir de los análisis transcripcionales, la senescencia también desencadenó una disminución en la proteína PTPN2 (51), independientemente de la presencia de IFN exógeno (Fig. 4E). Por lo tanto, las células senescentes activan más eficientemente la señalización de IFN en respuesta a una concentración limitante de IFN en el medio ambiente.

La senescencia y el IFNg EC regulan positivamente de forma cooperativa la maquinaria de presentación y procesamiento de antígenos

Para comprender mejor la contribución funcional de la detección de IFN al programa de senescencia, a continuación comparamos los estados fenotípicos y transcripcionales de células tumorales NSP senescentes en proliferación y p53-restauradas tratadas con IFN recombinante a una concentración baja (50 pg/ml) o dosis más alta (1 ng/ml). Aunque la adición de IFN exógeno a células tumorales en proliferación o senescentes tuvo un efecto insignificante sobre la viabilidad, proliferación o expresión del gen SASP de cualquier tipo de célula en las dosis probadas (Fig. 5A; Fig. Suplementaria S9A-S9D), se observaron cambios marcados en Se observó la expresión del gen de la vía IFN ligada al estado senescente. Específicamente, la agrupación supervisada de la "firma de respuesta de IFN" de Hallmark en células proliferantes y senescentes reveló tres módulos DEG: (i) genes que están regulados negativamente durante la senescencia independientemente del IFN (incluidos los reguladores negativos antes mencionados); (ii) genes que están regulados positivamente durante la senescencia independientemente del IFN; y, curiosamente, (iii) un conjunto sustancial de DEG que son inducidos cooperativamente por la combinación de senescencia e IFN (Fig. 5B). Por tanto, la senescencia desencadena cambios cuantitativos y cualitativos en la respuesta transcripcional al IFN. Un resultado bien establecido de la señalización del IFN que regula la susceptibilidad de las células a la vigilancia inmune adaptativa es una mayor capacidad de presentación de antígenos mediada por moléculas MHC de clase I (MHC-I; refs. 47, 52). De hecho, muchos de los genes regulados positivamente en células senescentes (genes de clase ii) o superinducidos en presencia de IFN exógeno (genes de clase iii) incluían componentes de la maquinaria de presentación de antígenos. Entre los genes inducidos durante la senescencia (genes de clase II) se encontraban Tap1, transportadores asociados con el procesamiento de antígenos, y Psme1, un factor proteasómico asociado con el procesamiento de antígenos (53). Entre los hipersensibles al IFN exógeno (genes de clase III) se encontraban Nlrc5, un coactivador transcripcional de los genes MHC-I (54); el factor de ensamblaje MHC-I Tapbp; y la subunidad B2m del MHC-I. Otros dos genes de clase III eran componentes del inmunoproteasoma (Psmb8 y Psmb9) cuyas acciones pueden alterar el repertorio de péptidos presentados cuando se sobreexpresan y se asocian con una mejor respuesta tumoral al bloqueo de los puntos de control inmunológico (55). Esta producción amplificada de IFN en células senescentes se confirmó mediante RT-qPCR y se mantuvo en niveles aún más altos de IFN exógeno (Fig. 5C; Tabla complementaria S3). De acuerdo con el proceso multifactorial descrito anteriormente, este efecto no se observó en las células tumorales en proliferación, incluso en aquellas que sobreexpresan un ADNc de IFNGR1 y/o se tratan con IFN (Figuras complementarias S10A-S10D).

Figura 4. Las células senescentes están preparadas para detectar y amplificar la señalización de IFN. A y B, nivel de IFNGR1 en células proliferantes y senescentes perfilado mediante espectrometría de masas (A) y validado mediante citometría de flujo (B). AU es una unidad arbitraria. Los datos se presentan como media ± SEM. n=6 tanto para los grupos proliferantes como para los senescentes. C, Análisis transcriptómico de genes seleccionados que regulan la señalización de IFN a partir de datos de RNA-seq de 3 líneas celulares p53-restablecibles independientes (NSP, NSM2 y NSP5) que restauran p53 junto con células NSP tratadas con otros dos desencadenantes de senescencia. SEN/PRO, senescentes/proliferativos; T + P, trametinib más palbociclib. D, expresión de ARNm de genes seleccionados implicados en la señalización de IFN en líneas celulares humanas provocadas por la senescencia. Tratamiento: Ali, alisertib; Eto, etopósido; el número indica la duración del tratamiento (días). Los datos se obtienen del conjunto de datos público SENESCopedia (44). E, arriba, análisis de inmunotransferencia de células NSP bajo diferentes desencadenantes senescentes en presencia o ausencia de IFN (1 ng/ml). Abajo, cuantificación de la intensidad de la señal procedente del inmunoblot. p-STAT1, fosfo-STAT1 (Tyr701).

También de acuerdo con los cambios en la expresión genética descritos anteriormente, las células tumorales senescentes regularon al alza el MHC-I de manera más robusta en respuesta a niveles bajos de IFN exógeno en comparación con sus contrapartes en proliferación. Por lo tanto, mientras que los niveles de MHC-I en la superficie celular de las células proliferantes y senescentes eran bajos al inicio del estudio e inducidos por IFN exógeno, las células senescentes mostraron un aumento significativo en la expresión de la proteína MHC-I (Fig. 5D). Se observaron sinergias similares para la expresión de HLA en la superficie celular (idéntica a MHC-I en ratones) en células cancerosas humanas del hígado y otros tipos de cáncer desencadenados hasta la senescencia con Butlin, que activa un programa de senescencia ap53-dependiente (56). , o trametinib / palbociclib, que se dirige preferentemente a las células tumorales con una vía MAPK activada (Figura complementaria S11A-S11D; ref. 20). Es de destacar que los efectos combinatorios del tratamiento farmacológico y el IFN sobre la expresión de HLA requirieron inducción de senescencia y no ocurrieron en células tumorales hepáticas que no lograron senescencia debido a una mutación p53 espontánea o diseñada (que no responde al esquema) o una vía MAPK no hiperactivada (que no responde al esquema). a trametinib/palbociclib). Además, aunque las vías de respuesta de IFN tipo I y II incluyen componentes superpuestos, el tratamiento con IFN exógeno no podría sustituir al IFN en la producción de una inducción robusta de MHC-I en células senescentes ni una inducción fuertemente diferencial entre células proliferantes y senescentes en nuestro modelo de restauración de p53. Figura complementaria S11E y S11F). Estos datos implican que las células murinas y humanas activadas para la senescencia adquieren una mayor capacidad para el procesamiento y presentación de antígenos en presencia de cantidades limitantes de IFN.

Las células tumorales senescentes hiperactivan la vía de señalización de IFNg in vivo

Para determinar las consecuencias in vivo del recableado de la señalización de IFN identificada en células senescentes, a continuación adaptamos un sistema indicador de detección de IFN (IGS) para visualizar directamente la activación de la señalización de IFN intracelular en tiempo real (57). Este reportero consta de una serie de secuencias de consenso activadas por IFN, que tiene especificidad para el IFN tipo II sobre otras señales (57), seguidas de una secuencia de ADNc que codifica la proteína fluorescente ZsGreen1 y está vinculada a un transgén RFP expresado constitutivamente para visualizar las células transducidas ( Figura 6A). Las células tumorales NSP que expresaban esta construcción fueron positivas para RFP y mostraron un aumento dependiente de la dosis en la señal de ZsGreen1 tras el tratamiento con IFN in vitro que aumentó después de la inducción de p53 o después del tratamiento con fármacos inductores de senescencia (Fig. 6B; Fig. Suplementaria S12A y S12B). .

Luego utilizamos este sistema para monitorear la actividad de señalización después de la inducción de la senescencia en tumores. Se inyectaron células tumorales transducidas con reportero (en Dox) que expresaban RFP constitutiva en los hígados de receptores singénicos alimentados con Dox y, tras la manifestación del tumor, se eliminó Dox para inducir la expresión de p53 y desencadenar la senescencia como se indicó anteriormente (ver Figs. 1 y 2). Los tumores en regresión se aislaron 9 días después de la retirada de Dox para obtener imágenes en 3D de la actividad del informador y una evaluación paralela de la señalización de IFN en comparación con los controles en proliferación (de ratones mantenidos con Dox). Como se ilustra en la Fig. 6C, las células tumorales en proliferación mostraron poca o ninguna expresión indicadora, mientras que las células tumorales activadas para senescer in vivo mostraron una señal ZsGreen1 más prominente (Fig. 6C y D; Video complementario S2). Este efecto coincidió con un aumento específico en los niveles de proteína IFN (pero no IFN tipo I) en extractos de tejido tumoral (Fig. 6E; Fig. Suplementaria S12C).

Para probar si la composición alterada de las células inmunes en los tumores senescentes (Fig. 2; Figs. Suplementarias S5-S6) contribuyó a la señal mejorada del reportero IGS, realizamos ensayos de cocultivo in vitro que permitieron la exposición de células tumorales senescentes o en proliferación a un número igual de células T CD8 activadas, que identificamos a través de datos de scRNA-seq como la fuente celular predominante de IFN in vivo (Fig. 6F-H). Las células senescentes todavía mostraron un aumento significativo de la señal ZsGreen1 en comparación con los controles en proliferación (Fig. 6I). De acuerdo con una activación de señalización no autónoma de las células, no se detectó IFN en medios condicionados de células tumorales NSP en condiciones proliferativas o senescentes (Figura complementaria S12D), sin embargo, se detectó fácilmente IFN en el cocultivo con células T CD8, un efecto que fue mejorado aún más por la adición de macrófagos y asociado con un aumento de MHC de clase I en células senescentes, así como una mayor activación de las células T CD8 (Figura complementaria S12E-S12J). En conjunto, estos datos respaldan un modelo mediante el cual las interacciones heterotípicas entre las células tumorales senescentes y las células inmunitarias sensibilizan el tumor al IFN exógeno, lo que conduce a una mejor presentación de antígenos y una vigilancia inmunitaria eficiente.

Figura 5. Senescent y EC IFN cooperan para regular positivamente la maquinaria de presentación y procesamiento de antígenos. A y B, expresión de ARNm de genes en células NSP senescentes y proliferantes in vitro en presencia o ausencia de tratamiento con IFN (50 pg/ml). El nivel de ARNm se normaliza con respecto a la expresión media del gen en todas las muestras. A, factores SASP con codificación DEG en nuestro modelo. B, genes de respuesta a IFN de la base de datos de firmas de Hallmark. C, RT-qPCR de genes seleccionados de la vía de presentación de antígenos en células proliferativas y senescentes tratadas con una concentración baja (50 pg/ml) o alta (1 ng/ml) de IFN. Las muestras proceden de 2 réplicas biológicas. D, nivel de MHC-I de células proliferantes y senescentes tratadas con IFN durante 24 horas medido mediante citometría de flujo. MFI, intensidad de fluorescencia mediana. Los datos se presentan como media ± SEM.

Figura 6. La senescencia mejora la señalización heterotípica mediada por IFN desde células inmunes activadas a células tumorales. Una ilustración gráfica del reportero de IGS. (Creado con BioRender.com.) B, izquierda, gráficos representativos de citometría de flujo que miden señales de ZsGreen1 en células NSP en proliferación y senescentes tratadas con 1 ng/ml de IFN. Derecha, cuantificación del porcentaje de células ZsGreen1-positivas tras el tratamiento con IFN. MFI, intensidad de fluorescencia mediana. C y D, imágenes representativas en 3D de tumores eliminados del tejido de la línea celular NSP hepática inyectada ortotópicamente que expresa el reportero IGS (C). Cuantificación de 3 campos seleccionados aleatoriamente del tumor hepático de cada ratón (D). n=5 y n=3 para los grupos proliferantes y senescentes (9 días después de la restauración de p53), respectivamente. Barras de escala, 100 μm. E, Arriba, ensayo de matriz de perlas citométricas para el nivel de IFN de muestras de lisado de tejido tumoral in vivo (7 días después de la restauración de p53). Abajo, transcripciones de genes indicados de RNA-seq de muestras masivas in vivo de tumores generados por HTVI (PRO, p53 desactivado; SEN, restauración de p53 durante 12 días). TPM, transcripciones por millón de kilobase. El grupo Ifna/b conocido contiene 14 subtipos de Ifna y 1 gen Ifnb. F y G, expresión de Ifng en células inmunes infiltrantes de tumores perfiladas por scRNA-seq en el modelo trasplantable de NSP (como en la Fig. 2, una muestra recolectada el día 8 después de la restauración de p53). H, Aproximación múltiple uniforme y gráfico de proyección de la expresión de Havcr2 (que codifica TIM3) e Ifng en células T CD8 extraídas de lesiones tumorales proliferantes (P) y senescentes (S). El panel superior se replica de la Fig. 2F (izquierda) para indicar las celdas correspondientes a cada condición. I, Cuantificación de la intensidad de ZsGreen1 de células tumorales NSP en el experimento de cocultivo de células T OT-I y células tumorales que expresan SIINFEKL (relación efector-objetivo, 5:1) después de 20 horas de cocultivo. Señal medida por citometría de flujo. T + P, trametinib más palbociclib. Consulte los detalles experimentales en la figura complementaria S12E. Los datos se presentan como media ± SEM. Se utilizó la prueba t de Student de dos colas. *, P < 0,05; **, P < 0,01; ***, P < 0,001.

La señalización de IFNg en células tumorales senescentes es necesaria para la vigilancia inmune

Nuestros resultados implican que la eliminación mediada por el sistema inmunológico de las células tumorales NSP senescentes implica los efectos combinados de SASP, conocido por estimular el reclutamiento de células inmunes (10, 20, 58), junto con una capacidad previamente subestimada de las células senescentes para mejorar la detección y la respuesta a Señales EC, como se muestra aquí con IFN. Para probar la contribución del programa de detección de IFN asociado a la senescencia a la vigilancia inmune de las células tumorales senescentes, examinamos cómo la alteración del IFNGR en las células tumorales, o el agotamiento de IFN en el huésped, afecta la eliminación de las células tumorales NSP tras la inducción de la senescencia. . De hecho, la regresión del tumor (pero no la senescencia per se; Fig. Suplementaria S13A – S13D) se vio afectada por la eliminación (KO) de IFNGR1 (Fig. 7A y B; Fig. Suplementaria S14A – S14C), un efecto que fue aún más pronunciado para Tumores intactos con IFNGR injertados en ratones Ifng -/- (Fig. 7C y D) y asociados con la pérdida esperada de MHC-I de superficie en células tumorales (Fig. Suplementaria S14D y S14E).

De acuerdo con la contribución conocida de la señalización de IFN y el MHC-I de las células tumorales a la participación de CD8+ (59), los tumores que carecían de IFNGR1 o que se desarrollaron en receptores de Ifng-/- contenían menos células T CD8 que sus contrapartes WT en ambos estados proliferativos y senescentes (Fig. Suplementaria S14F) al mismo tiempo que inducen un infiltrado inmunológico robusto que incluye abundantes macrófagos (Fig. 7E y F; Fig. Suplementaria S14G). De todos modos, el fenotipo de vigilancia de la senescencia alterado no fue simplemente el resultado de esta disminución en las células T CD8. Los ensayos de cocultivo que proporcionaron una exposición uniforme de células tumorales IFNGR1 KO y WT a células T CD8 y macrófagos aún mostraron la muerte dependiente de IFNGR1-de células tumorales senescentes (Figuras complementarias S15A-S15E), una dependencia que requería la presencia de ambas células T. células y macrófagos y que no se observó en células tumorales proliferantes en las mismas condiciones. En conjunto, estos datos indican que la capacidad mejorada de las células senescentes para detectar IFN microambiental actúa en conjunto con el reclutamiento de células inmunes estimuladas por SASP para permitir interacciones heterotípicas que se refuerzan mutuamente entre células tumorales, macrófagos y células T activadas que mejoran la presentación de antígenos y la vigilancia inmune. , lo que lleva a potentes regresiones tumorales.

DISCUSIÓN

Gracias a un modelo de tumor murino en el que la evasión inmune del cáncer versus la vigilancia de la senescencia está bajo un estricto control genético, revelamos cómo las células senescentes alteran drásticamente su capacidad para enviar y recibir señales ambientales (Figura complementaria S16). De acuerdo con los programas de senescencia conocidos, la inducción de senescencia impulsada por p53- condujo al silenciamiento de genes proliferativos e indujo el SASP. Sin embargo, también observamos un efecto profundo en la expresión genética de las proteínas PM, incluida una variedad de receptores de factores de crecimiento y receptores de citocinas que se predice que alterarán drásticamente la forma en que las células senescentes responden a las señales ambientales. Es importante destacar que, aunque utilizamos un modelo de cáncer de hígado como nuestro sistema experimental principal, se observó un recableado similar en la expresión de sensores de la superficie celular y programas genéticos que sensibilizan a señales ambientales en una amplia gama de células tumorales murinas y humanas tratadas con inductores de senescencia. agentes, lo que implica que el programa de detección alterado es un sello general del estado senescente.

Beneficios de cistanche para hombres: fortalece el sistema inmunológico.

Una de las vías de detección destacadas alteradas en las células senescentes implica la señalización de IFN tipo II. En nuestro modelo de cáncer de hígado y en todos los estados senescentes que examinamos, la senescencia se acompaña de cambios transcripcionales y de expresión de proteínas intrínsecos a las células que se predice que mejorarán la señalización del IFN exógeno. De hecho, las células senescentes activaron con mayor fuerza los efectores de IFN en respuesta al IFN in vitro e in vivo, y se requiere tanto una vía efectora de IFN intacta como IFN en el medio ambiente para una eliminación eficaz de las células tumorales senescentes mediada por células T CD8. Aunque el análisis de la vía de los transcriptomas de células senescentes identifica invariablemente la señalización del IFN tipo II como una característica enriquecida, las superposiciones entre los componentes de señalización del tipo I y II y el hecho de que el IFN generalmente no se detecta como un factor SASP han dejado preguntas mecanísticas con respecto a la señalización del IFN tipo II en la senescencia. en gran parte inexplorado. Nuestros estudios demuestran que dicho enriquecimiento en las firmas de señalización de IFN de las células senescentes refleja una capacidad mejorada para la detección de IFN, cuya producción es más prominente in vivo.

Figura 7. La señalización de IFN en células tumorales senescentes es necesaria para la vigilancia inmunológica. A, Ifngr1 KO de células NSP tanto proliferantes como senescentes validadas mediante citometría de flujo. B, Fenotipo de regresión tumoral de Ifngr1 KO o células tumorales transfectadas con ARNsg de control inyectadas ortotópicamente en ratones Bl/6N tras la restauración de p53. Un sgRNA de control dirigido a un desierto genético ubicado en Chr8 (Ctrl KO) sirve como control. C, Fenotipo de regresión tumoral de células tumorales NSP parentales inyectadas ortotópicamente en ratones WT o Ifng KO tras la restauración de p53. D, Imágenes macroscópicas representativas del tumor recopiladas el día 21 después de la restauración de p53 de C. E, Análisis de citometría de flujo de la abundancia de CD45 en el tumor de los grupos indicados. F, Inmunofluorescencia representativa en tumor p{{10}}suprimido (proliferando) y p53-restaurado (senescente, 7 días después de la restauración de p53) del huésped indicado. Las células tumorales NSP se transdujeron con un vector que expresa GFP para su visualización. Barras de escala, 50 μm. Los datos se presentan como media ± SEM. Se utilizó la prueba t de Student de dos colas. **, P < 0,01; ***, P < 0,001.

Quizás el resultado mejor establecido de la señalización del IFN tipo II implica su capacidad para inducir la maquinaria de presentación de antígenos. De hecho, IFN indujo la expresión en la superficie celular de MHC-I (o HLA en células humanas) en nuestro modelo tanto en condiciones de proliferación como de senescencia. Sin embargo, la regulación positiva del MHC-I inducida por IFN fue más pronunciada en las células senescentes, un efecto que se correlacionó con una mayor expresión del transportador asociado con el procesamiento de antígenos, otros factores de procesamiento de antígenos y componentes estructurales del MHC-I. Se observó una hipersensibilidad similar al IFN en la inducción de MHC-I/HLA en líneas celulares de cáncer de hígado y pulmón humanos provocadas por la senescencia. Estos resultados implican que el programa de senescencia puede mejorar la presentación de antígenos en células no inmunes, facilitando así la inmunovigilancia tumoral. Nuestros resultados respaldan un modelo según el cual el impacto final de las células senescentes en la biología de los tejidos está dictado por los efectos combinados de cómo envían y reciben señales ambientales. Las células senescentes no solo inducen el SASP, que desencadena la remodelación del tejido y altera el estado celular y la composición de las células inmunitarias en el medio ambiente, sino que también alteran drásticamente su superficiema, lo que lleva a una capacidad diferencial para detectar factores ambientales, aquí ejemplificado por el IFN. Es importante destacar que la interrupción de la señalización del IFN no tuvo ningún efecto sobre la inducción de la senescencia o el SASP en nuestro sistema, pero perjudicó las regresiones tumorales posteriores, lo que indica que la detección ambiental alterada actúa en conjunto con el SASP para determinar el resultado final del programa de senescencia; en este caso, vigilancia inmunológica. Estos efectos parecen ser parte de un programa epigenético coordinado, ya que tanto el SASP como los programas de detección muestran una dependencia prominente del factor de remodelación de la cromatina BRD4.

Aunque el mecanismo de vigilancia inmune en nuestro modelo depende de los efectos cooperativos de las poblaciones de células T CD8 y macrófagos que reflejan una transición de un microambiente tumoral "inmune frío" a un "inmune caliente", otros tipos de células inmunes innatas o adaptativas pueden reconocer y eliminar células senescentes en diferentes contextos o, alternativamente, es posible que no se realice ninguna vigilancia inmune (18, 19). Sin duda, algunas de estas distinciones reflejan heterogeneidad en la secreción del factor SASP (13, 14), aunque nuestros resultados plantean la posibilidad de que el alcance y la naturaleza de la detección ambiental alterada también puedan influir en cómo las células senescentes afectan la biología de los tejidos. Aunque la eliminación de la detección de IFN (a través de Ifngr1 KO) y la eliminación de MHC-I (B2M KO) en células tumorales senescentes afectaron su vigilancia inmune in vivo, no eliminó por completo la regresión tumoral después de la inducción de la senescencia, lo que indica que la detección de IFN en células senescentes es no es la única vía que contribuye a la regresión del tumor. De todos modos, el hecho de que las células senescentes puedan responder de manera diferente a las señales ambientales implica que su estado molecular final en los tejidos será diferente que en el cultivo celular, lo que destaca la necesidad de caracterizar mejor el proceso in vivo.

Nuestros resultados pueden ayudar a explicar los efectos paradójicos de la biología de la senescencia en la fisiología y la enfermedad y tener implicaciones para el uso eficaz de terapias moduladoras de la senescencia. Por ejemplo, en nuestro modelo, la diferencia entre la eliminación y la persistencia de las células senescentes del tumor estuvo determinada, al menos en parte, por la presencia de IFN ambiental y la integridad de la señalización de IFN tipo II en las células senescentes. Esto sugiere que la variación en la capacidad de las células senescentes para reclutar y detectar células inmunes secretoras de IFN u otros tipos de células inmunes podría afectar profundamente la eliminación de las células senescentes, de modo que la disminución del IFN ambiental o la disminución de la señalización del IFN tipo II podrían permitir la persistencia de las células senescentes dentro de los tejidos. En el contexto del cáncer, las terapias que inducen la senescencia de las células tumorales (un programa citostático) pueden desencadenar la regresión tumoral mediada por el sistema inmunológico o resensibilizar los tumores al bloqueo de los puntos de control inmunológico, pero estos no son los resultados universales. Como tal, la heterogeneidad en el SASP (que puede variar entre los tipos de células tumorales y los inductores de senescencia) o la detección y producción de IFN [quizás afectada por la eliminación o mutación de la vía del IFN o los componentes HLA (60) o los mecanismos transcripcionales reversibles descubiertos aquí] pueden influir la eficacia de tales terapias en los pacientes. De acuerdo con esta noción, la inducción de perfiles SASP específicos impulsada por la terapia predice los resultados de los pacientes en un subgrupo de pacientes con cáncer de ovario (61). Por el contrario, las estrategias para mejorar la vigilancia inmunitaria de las células senescentes aumentando su sensibilidad al IFN (p. ej., con inhibidores de PTPN2) pueden ayudar a sesgar los resultados del programa hacia el rechazo de las células tumorales. Prevemos que la investigación de este y otros programas de detección y remodelación de tejidos en biopsias tumorales previas y posteriores al tratamiento (p. ej., a través de perfiles transcriptómicos o proteómicos) puede exponer nuevos biomarcadores de respuesta y/o estrategias combinadas para mejorar el tratamiento clínico del cáncer.

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