¿Cómo estudiar la diversidad genética de Herba Cistanches?

Estudio sobre diversidad genética de Herba Cistanches por RAPD

Contacto:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Cui Guanghong, Chen Min, Huang Luqi*, Xiao Suping, Li Da

(Instituto de Materia Médica China, Academia China de Medicina China, Beijing 100700)

Resumen

Objetivo:Para estudiar la poblacióndiversidad geneticadeCistanche deserticayCistanche tubulosa.

Métodos:Dos poblaciones silvestres deCistanche deserticay cuatro poblaciones silvestres deCistanche tubulosafueron analizados por RAPD, y losdiversidad geneticade las poblaciones fue analizada por el software versión 1.31 de POPGENE.

Resultados:El porcentaje medio de loci polimórficos deCistanche deserticafue del 47,37 por ciento, los loci polimórficos de las dos poblaciones fueron del 39,47 por ciento y del 35,53 por ciento, y la diversidad genética promedio de Nei fue 0.135 8. La de Shannon era más. El índice de información de estado es 0.207 2, y el coeficiente de diferenciación génica Gst {{1{{20}}}}.254 6. El porcentaje promedio de loci polimórficos en Cistanche fue del 27,59 %, y el porcentaje de loci polimórficos en cada población varió del 19,54 % al 25,29 %, de los cuales la población de Andier tuvo el 25,29 % más alto, y la diversidad genética promedio de Nei fue 0. { {21}}, el índice de información del polimorfismo de Shannon es 0,1258, el coeficiente de diferenciación génica Gst =0.175 5.

Conclusión:Cistanche deserticayCistanche tubulosatienen una cierta diferenciación entre las poblaciones. losdiversidad geneticade Desert Cistanche es significativamente mayor que la de Cistanche tubulosa y se ha diferenciado en dos ecotipos.

Palabras llave: Cistanche deserticola; Cistanche tubulosa; RAPD; diversidad genetica

[Número de clasificación de la biblioteca china] S 567 [Código de identificación del documento] A [Número de artículo] 1001-5302 (2004) 08-0727-04

Cistanche es una planta parásita perteneciente al género Cistanche en la familia Lidanaceae, también conocida como Dayun, que es un preciado material medicinal chino. Las principales plantas fuente de Cistanche deserticola en mi país sonCistanche deserticaYCMa y C.tubulosa (Schenk) R.Wight[1]. Las plantas hospedantes de Cistanche deserticola son Haloxylon ammodendron y Haloxylon ammodendron, que se distribuyen principalmente en la Liga de Alashan en Mongolia Interior, el norte de Xinjiang, Qinghai, Gansu y otros lugares. La distribución de Cistanche deserticola es la misma que la de las plantas hospedantes. En mi país, la cistanche Cistanche solo se distribuye en condados alrededor del desierto de Taklimakan al sur de las montañas Tianshan en Xinjiang, y su distribución no está completamente sincronizada con el anfitrión Tamarix. Otras regiones como el norte de Xinjiang, Gansu, Qinghai, Ningxia, Mongolia Interior, Shaanxi y otros lugares de Tamarix Plants no son parásitos Cistanche Tubula[2]. Debido al rápido aumento de la demanda de cistanche en los últimos años, que provocó la extinción de sus recursos, los recursos de cistanche silvestre se han reducido a solo unas pocas áreas productoras principales. Ambas han sido catalogadas como especies vegetales protegidas en peligro de extinción en mi país [3], entre las cualesCistanche deserticaha sido incluida en el Apéndice II de CITES [4].

Después de varios años de investigación, la investigación sobre mejoramiento artificial de Cistanche ha sido exitosa y se encuentra en etapa de promoción y siembra a gran escala. Sin embargo, cómo prevenir el declive de las especies de Cistanche durante la producción industrial, cómo restaurar la población silvestre limitada lo antes posible y preservar los preciosos recursos de germoplasma silvestre son las claves para lograr su uso sostenible. En cuanto al patrimonio protegido de Cistanche [Fecha de recepción], 2004-03-11 [Proyecto de Fondo] Ministerio de Ciencia y Tecnología Proyecto de Bienestar Social (2001.109); Proyecto "Décimo Plan Quinquenal" del Ministerio de Ciencia y Tecnología (2001BA701A09a) [Autor para correspondencia] * Huang Luqi, Tel:( 010) 64014411-2955, E-mail: huangluqi @263.net El estudio de la transmisión todavía está vacío. Este estudio utiliza la tecnología RAPD para estudiar 2 poblaciones silvestres deCistanche deserticay 4 poblaciones silvestres deCistanche tubulosa, y analice tanto La diferencia endiversidad geneticaSe espera que proporcione una base genética experimental importante para la protección de Cistanche, una valiosa medicina china.

cistanche

1. Material y métodos

1.1 Materiales

Cistanche deserticase recolectó del condado de Jimsar en Xinjiang y el área de Jilantai de la Liga Ancient Alxa en Mongolia Interior. Las poblaciones de Cistanche se recolectaron del condado de Minfeng y el condado de Yutian, Xinjiang. El condado de Minfeng es actualmente el área con el mayor rendimiento de Cistanche cistanche, con la mayor densidad y comunidades relativamente completas de bosques naturales. Los puntos de muestreo Andil, Sawuzek, Yatongguz y Daheyan del condado de Yutian son las principales áreas de producción, que están ubicadas en el río Andir, el río Yeyike, el río Yatongguzi y Kelaniya. En los tramos inferiores del río, la distancia entre las poblaciones es más de 50 kilómetros Cada población muestreó aleatoriamente 19-30 individuos. Las muestras se secaron rápidamente en gel de sílice y se utilizaron para la extracción de ADN (Tabla 1).

Cuadro 1 Poblaciones de muestreo y áreas productoras de Cistanche deserticola y Cistanche tubulosa

1.2 Extracción de ADN

El método de extracción de ADN total utiliza un método alto en sal y bajo pH [5]. La muestra de ADN se sometió a un espectrofotómetro para detectar la concentración de la plantilla de ADN, luego se utilizó electroforesis en gel de agarosa al 1 por ciento, tinción con EB, observación y fotografía bajo luz ultravioleta, electroforesis de ADN con bandas claras y menos cola para el análisis RAPD.

1.3 Detección de cebadores RAPD

Dado que el experimento encontró que el mismo cebador tiene un efecto insatisfactorio en la amplificación simultánea de ambosCistanche deserticay Cistanche tubulosa, los cebadores se cribaron de forma independiente. Se utilizaron 150 cebadores aleatorios (10 pb), sistema de reacción de 25 μL de Shanghai Shenggong Biotechnology Co., Ltd. para amplificación y selección; cada cebador usó 2 plantillas de población y 1 agua bidestilada esterilizada como control en blanco, y obtuvo 10 cebadores para la amplificación de Cistanche deserticola con bandas claras, fuerte polimorfismo y buena repetibilidad: S490, S1 101, S{{ 8}}, S1 137, S1 165, S1 218, S1 222, S2 015, S2 112, S{{15 }}; 10 cebadores deCistanche tubulosa: S1 141, S1 146, S1 183, S1 208, S1 500, S2 032, S2 042, S2 052, S2 059, S2 155.

1.4 Amplificación por PCR y detección de productos

Los cebadores seleccionados se utilizaron para amplificar el ADN molde deCistanche deserticayCistanche tubulosapor PCR. El ADN genómico se diluyó a 50 ng·μL -1 según la concentración medida como plantilla. El volumen de reacción total es 25 μL, de los cuales 10 × PCR Buffer 2,5 μL, Mg2 más 1,5 μL, Taq (5 U·μL -1) 0,2 μL, Mezcla dNTP (cada 2,5 mM) 1 μL, cebador 5 μM 1 μL, plantilla de ADN 1 μL, agua bidestilada esterilizada 18,8 μL, la solución de amplificación por PCR anterior es el producto de Shanghai Sangon. La amplificación se realizó en un termociclador PTC-100. El programa de amplificación fue una predesnaturalización de 94 grados durante 5 min y luego 40 ciclos. Cada ciclo incluía 94 grados 45 s, 34 grados 1 min, 72 grados 1 min 30 s y finalmente Extender a 72 grados durante 5 min. Los productos amplificados se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa al 2,0 por ciento (que contenía EB) en tampón TAE 1x y se observaron y fotografiaron con el sistema de formación de imágenes de gel SYNGENE.

1.5 Estadísticas y análisis de datos

En el espectro de electroforesis, la posición correspondiente del producto de reacción en el gel se compara de acuerdo con el estándar de peso molecular y se estima el peso molecular del producto amplificado. La banda con la banda se registra como 1, y la banda sin banda se registra como 0, formando un gráfico de matriz 0/1 e ingresando a la computadora, usando POPGENE32 para calcular el porcentaje de sitios polimórficos (PPL) de cada población, índice de diversidad génica de Nei (H), índice de información de polimorfismo de Shannon (I), coeficiente de diferenciación génica (Gst), diversidad génica (Ht),Diversidad genetica(Hs), la identidad genética (I) y la distancia genética (D) de Nei (1978) dentro de una población, y el análisis de conglomerados se realizó utilizando el método UPGMA.

2. Resultados y análisis

2.1 Diversidad genética de Cistanche

Todas las muestras obtuvieron bandas con un peso molecular entre 200 y 2 200 pb (Figura 1, 2). Se detectaron un total de 76 loci en 60 muestras de 2 poblaciones deCistanche desertica, 36 de los cuales eran loci polimórficos, lo que representa el 47,37 por ciento , H=0.135 8, I=0.207 2. Entre ellos, el PPL de Jimsar es del 39,47 por ciento y el de Gilanty es del 35,53 por ciento. H es 0. 0 95 3 y 0.1 070 respectivamente, y yo es 0.15 12 y 0.163 7 respectivamente. Se detectaron un total de 87 loci en {{20}} individuos de 4 poblaciones de Cistanche, 24 de los cuales eran loci polimórficos, lo que representa el 27,59 por ciento, H=0.084 8, Yo=0.1278. El PPL más alto fue Andil con 25,29 por ciento, mientras que el PPL fue más bajo en Savuzek y Yatungusi (ambos con 19,54 por ciento). H es 0.062 1 -0.080 0, I es 0.095 0 -0.116. El tamaño de H e I es consistente con la tendencia del tamaño de la PPL de cada población, y los coeficientes son los más grandes en Andier, seguido por Dayan. En el caso de la misma PPL, la H de Savuzek=0.{{40}} La suma I=0.097 0 es ligeramente mayor que el 0.{{44 }} y 0.095 0 de Yatunguska (Tabla 2).

Figura 1 Bandas amplificadas RAPD de algunas muestras de desiertoCistanche desertica, cebador S490 1-10. Muestras de garantía; 11-20. Jimpster muestra el marcador M-DNA (200 - 2 000 pb)

Figura 2 Bandas amplificadas por RAPD de algunas muestras de Cistanche Tubulosa, cebador S2 042 1-20. Xinjiang Andier muestra M-DNA Marker (200 - 2 000 pb)

Tabla 2 Eldiversidad geneticadeCistanche deserticayCistanche tubulosapoblaciones

2.2 Análisis de variación genética de Cistanche

Según el nivel dediversidad geneticaen poblaciones (Hs), diferenciación entre poblaciones (Dst), y la proporción de diferencias genéticas entre poblaciones en diferencias genéticas totales (Gst), se puede observar que la diversidad genética total de Cistanche deserticola Ht=0.{{ 1}}, donde Hs=0.101 2, Gst =0.254 6. Cistanche Ht=0.082 2, de los cuales Hs=0.067 8, Gst=0.175 5 (Tabla 3). Los resultados anteriores indican que existe un cierto grado de variación genética entre las poblaciones. La variación entre las poblaciones del desierto de Cistanche deserticola representó el 25,46 por ciento de la variación total, y la variación de las poblaciones de Cistanche tubulosa representó el 17,55 por ciento de la variación total.

Tabla 3 Análisis de variación genética deCistanche deserticayCistanche tubulosa.

2.3 Distancia genética y análisis de conglomerados entre poblaciones de Cistanche deserticola

La distancia genética de las dos poblaciones deCistanche deserticaes {{0}}.080 0, y la identidad genética es 0.9231. La distancia genética de las cuatro poblaciones de Cistanche fue 0.012 0-0.031 5, y la identidad genética fue 0.9690-0.988 1 (Cuadro 4) . El agrupamiento de individuos de Cistanche deserticola y cistanche tubulosa muestra que Cistanche deserticola puede agruparse en dos grupos distintos según la población, mientras que los diferentes individuos de cistanche tubulosa no pueden agruparse por población, lo que también indica que la diferenciación genética entre Cistanche deserticola la población es relativamente alta. Grande, pero la diferenciación genética entre las poblaciones de Cistanche tubulosa es pequeña.

Tabla 4 Identidad genética (abajo a la izquierda) y distancia genética (arriba a la derecha) deCistanche tubulosa.

3. Discusión

3.1 Diversidad genética de Cistanche

El nivel dediversidad geneticade las plantas es inseparable de sus características biológicas, hábitats, origen y evolución. Entre ellos, el sistema de reproducción, el rango de distribución, la forma de vida y los métodos de dispersión de polen y semillas tienen la mayor influencia [6]. De acuerdo con los resultados estadísticos de los datos de aloenzimas de 499 especies de plantas en 165 géneros por Ge Song et al. [7], el polimorfismo de Cistanche a nivel de especie debería ser de alrededor del 50 por ciento, y el polimorfismo a nivel de población debería ser de alrededor del 40 por ciento. Alrededor de 0,17. Los niveles de polimorfismo obtenidos en este experimento son todos inferiores a estos valores medios. Al mismo tiempo, en comparación con los niveles de loci polimórficos obtenidos por los métodos RAPD para varias plantas comunes en peligro de extinción, como el 32 % de las especies en peligro de extinción Silver Fir[18], el 22,5 % de la peonía enana y el 27,6 % de la peonía morada [9] ] Se puede observar que la diversidad genética deCistanche desertica es ligeramente inferior al nivel medio, mientras que la diversidad genética de Cistanche tubulosa ya es extremadamente baja.

3.2 Razones de la baja diversidad genética de Cistanche

Cistanche es una planta parásita específica, distribuida en estrechas áreas desérticas al mismo tiempo. Por lo tanto, el estilo de vida único y el área de vivienda relativamente estrecha pueden ser la razón inherente por la cual eldiversidad geneticade Cistanche es generalmente más bajo que el de las plantas ordinarias.

La diferencia endiversidad geneticaentre Cistanche deserticola y Cistanche tubulosa puede estar relacionado con la diferencia en el rango de distribución de los dos y si están sincronizados con la distribución del huésped. El área de distribución de Cistanche tubulosa es significativamente más pequeña que la de Cistanche deserticola, y su distribución está muy desincronizada con la planta huésped. Los estudios han demostrado que existe una gran diversidad entre las especies de Tamarix. Por ejemplo, Zhang Juan et al. informó que la diversidad genética de Tamarix sibiricus era tan alta como 98,7 por ciento [10], mientras que la diversidad genética de Cistanche es extremadamente pobre, lo que indica la evolución a largo plazo. Cistanche tubulosa puede haber experimentado serios cuellos de botella en la historia, lo que resultó en la pérdida de una gran cantidad dediversidad genetica.

Al mismo tiempo, según las investigaciones, se constató que ninguno de losCistanche deserticadentro de los 20 km de los asentamientos humanos podrían ser desenterrados y florecidos normalmente. Se excavaron los pozos grandes y pequeños de la Cistanche, especialmente en las principales áreas productoras de la flor de tubo de Cistanche. Por lo tanto, fue causado por una gran cantidad de excavación. La falta de procedencia y la destrucción del hábitat pueden ser las principales razones provocadas por el hombre para la bajadiversidad geneticade Cistanche.

3.3 Diferenciación genética de Cistanche

Debido a la distancia geográfica entre Xinjiang y Mongolia Interior, el aislamiento geográfico provocó la diferenciación y el aislamiento entre losCistanche deserticapoblaciones, y las dos poblaciones formaron diferentes ecotipos genéticamente diferentes debido a su adaptación a las condiciones del hábitat local. Debido a su estrecho rango de distribución ya los frecuentes intercambios de genes entre poblaciones, la diferenciación genética entre poblaciones es menor que la de Cistanche deserticola.

3.4 Recomendaciones para la protección de Cistanche

Diversidad geneticaes el requisito previo para la supervivencia a largo plazo de las especies para evitar la extinción. La reducción dediversidad geneticareducirá la capacidad de las poblaciones para adaptarse a los cambios ambientales tanto a corto como a largo plazo [11]. Por lo tanto, proteger la diversidad genética de Cistanche es muy importante para proteger esta rara y preciosa medicina china. Dado que Cistanche es una especie con un tipo ecológico especial, debe protegerse principalmente in situ, y la base de protección natural de Cistanche debe establecerse de acuerdo con su diversidad genética. por ejemplo, paraCistanche tubulosa, debido a que la diversidad genética proviene principalmente de la población, las poblaciones con una gran diversidad genética serán los objetos de protección prioritarios [12], como el Angier de Minfeng y el Daheyan de Yutian. Está catalogado como una base de protección natural para Cistanche. En cuanto aCistanche desertica, las poblaciones de Mongolia Interior y Xinjiang han sufrido cambios significativos, por lo que se debe fortalecer aún más la investigación experimental para determinar las poblaciones prioritarias para la protección. Al mismo tiempo, realizar investigaciones básicas sobre la biología reproductiva y la ecología de la polinización de Cistanche para brindar información para su mayor protección.

Referencias

[1] He Yanping, Yin Zhezhu, Tu Pengfei, et al. Identificacion deCistanchee investigación de materiales medicinales comerciales. Materiales Medicinales Chinos, 1997, 20(3):117.

[2] Liu Minting. Investigación integral y aplicación general de las plantas Tamarix. Lanzhou: Prensa de la Universidad de Lanzhou, 1995.

[3] Fu Guoli. Libro rojo de las plantas chinas. Pekín: Science Press, 1992.

[4] La Oficina de Gestión de Importación y Exportación de Especies Amenazadas de la República Popular China, el Comité Científico de Especies Amenazadas de la República Popular China. Convención sobre el Comercio Internacional de Especies Amenazadas de Fauna y Plantas Silvestres (CITES), Apéndice II. 2003.41.

[5] Zou Yuping, Wang Xiaoquan, Lei Yiding, et al. Extracción e identificación de ADN total de varias plantas en peligro de extinción y sus parientes. Acta Botánica, 1994, 36:528.

[6] Wang Hongxin, Hu Zhiang. Sistema de fitomejoramiento, estructura genética y protección dediversidad genetica. Biodiversidad, 1996, 4(2): 92.

[7] Chen Jiakuan, Yang Ji. Biología Evolutiva Vegetal. Wuhan: Prensa de la Universidad de Wuhan, 1994.

[8] Wang Xiaoquan, Zou Yuping, Zhang Daming, et al. Análisis RAPD de la diversidad genética del abeto blanco. Ciencia china (C), 1997, 40(2): 145.

[9] Pei Yanlong, Zou Yuping, Yin Zhen, et al. Un informe preliminar sobre el análisis RAPD de la peonía enana y la peonía morada. Revista china de taxonomía vegetal, 1995, 33(4): 350.

[10] Zhang Juan, Yin Linke, Zhang Daoyuan. Un estudio preliminar sobreDiversidad geneticade Poblaciones Naturales de Tamarix lanceolado. Investigación botánica de Yunnan, 2003, 25(5):557.

[11] Ellstrand NC, Elam DR. Consecuencias de la genética de poblaciones del tamaño de población pequeño: Implicaciones para la conservación de plantas. Revista Anual de Ecología y Sistemática, 1993, 34:217.

[12] Liu Zhanlin, Zhao Guifang. El principio de la genética de poblaciones y su aplicación en la protección de plantas raras y en peligro de extinción. Biodiversidad, 1999, 7(4): 340.

De: China Journal of Chinese Materia Medica; vol. 29, número 8 de agosto de 2004