Cistanche mejora la infección renal por lupus eritematoso sistémico
Mar 13, 2022
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DISCUSIÓN
Una ruptura de la tolerancia contra los antígenos nucleares es el sello distintivo desistémico lupuseritematoso, y además de las células B, se cree que las células T autorreactivas juegan un papel central en su patogénesis. Sin embargo, como la detección de (auto)antígeno específicoCD4más Las células T aún representan un desafío importante en la investigación de la autoinmunidad; hasta la fecha, se sabe poco sobre el CD4 reactivo al antígeno nuclear.máscélulas T ensistémicolupuseritematoso.
Recientemente, nuevos métodos para la detección y enumeración de CD4 específicos de antígenomásSe han desarrollado células T. El enfoque de la biblioteca de células T aprovecha la expansión policlonal anterior de las células T para permitir la detección de clones de células T específicos de antígeno raros. Esta estrategia ofrece alta sensibilidad y permite trabajar con cantidades limitadas de células. Usando esta técnica, pudimos demostrar células T reactivas contra 5 antígenos nucleares canónicos en pacientes consistémicolupuseritematoso. Las desventajas de la detección basada en biblioteca son, además de ser laboriosa, que no se puede excluir el crecimiento o la pérdida de ciertos clones durante la fase de expansión, y las opciones limitadas para el análisis fenotípico de las células.
La citometría de compañeros estándar está limitada por la cantidad de eventos detectables, lo que generalmente restringe el análisis de muestras a la población con frecuencias superiores al 0.01 por ciento. Nuestra observación utilizando la biblioteca de células T reveló que la frecuencia de circulación de CD4 autorreactivosmásLas células T para un autoantígeno particular en pacientes con un brote de enfermedad eran células w20 en un millón de células, lo que representa una frecuencia del 0,002 por ciento; por lo tanto, la detección de CD4 específico de autoantígenomásLas células T que utilizan citometría estándar no manipulada son casi imposibles. Bacher et al. introdujo el preenriquecimiento de CD4másCélulas T que son reactivas a antígenos particulares antes de la adquisición en citometría compañera, conocida como el método ARTE. Adoptar este enfoque para la detección de CD4 específicos de antígenos nuclearesmásCélulas T, pudimos confirmar nuestros hallazgos y demostrar la expansión del antígeno nuclear CD4 reactivomásCélulas T en activosistémicolupuseritematoso. En particular, la frecuencia de células T reactivas con transtiretina y C. albicans fue indiferente entre controles sanos y pacientes consistémicolupuseritematosocon actividad variable de la enfermedad. Por lo tanto, la expansión observada deautorreactivoT célulasprobablemente no sea el resultado de una hiperreactividad general inactivasistémicolupuseritematososino de la expansión de células T específicas de antígeno.
loslupus eritematoso sistémicoinfecta elriñón, por lo que la cistanche se usa para protegerriñones.
Informes anteriores ya han demostrado la existencia deautorreactivocélulas Tensistémicolupuseritematoso, utilizando principalmente la proliferación, la producción de citocinas o la regulación positiva de los marcadores de activación, aunque sin poder cuantificar una población clara de estas células. La mejor evidencia sobre la frecuencia de células T específicas de antígeno nuclear existe para la reactividad contra la ribonucleoproteína pequeña U1, un objetivo de autoantígeno característico en la enfermedad mixta del tejido conjuntivo y que se encuentra solo en una fracción de pacientes consistémicolupuseritematoso. Ribonucleoproteína nuclear pequeña U1– CD4 reactivomásLos linfocitos T se determinaron mediante dilución limitante y el ensayo de inmunolocalización ligado a enzimas (ELISPOT) y se informó que se producían a una frecuencia de (40 a 250) 106 linfocitos T y (20 a 60) 106 PBMC, respectivamente, que es similar magnitud como la frecuencia de células autorreactivas en nuestro estudio. En nuestro trabajo, investigamos la reactividad frente a varias característicassistémicolupuseritematoso-antígenos nucleares asociados. Curiosamente, aunque todos los pacientes con NL activa mostraron un aumento de las frecuencias de CD4 reactivo al antígeno antinuclear.másLas células T, los pacientes diferían en su cartera de objetivos, y la reactividad estaba dirigida contra un conjunto más amplio de antígenos en comparación con los pacientes con células inactivas.sistémicolupuseritematoso. El significado biológico de esto es actualmente desconocido. CD4 diferentemásLas reactividades de las células T pueden asociarse con ciertas manifestaciones clínicas de diferentes reactividades que pueden ser redundantes para la patogénesis de la enfermedad.
Al igual que otras enfermedades autoinmunes, también pudimos demostrar la existencia de CD4 autorreactivosmásCélulas T en individuos sanos, aunque a frecuencias mucho más bajas en comparación con pacientes con lupus eritematoso sistémico activo. Estas células eran indetectables al comparar el número de células activadas con o sin estimulación con antígeno, incluso con técnicas tan sensibles como las bibliotecas de células T o los métodos ARTE. Sin embargo, mediante la clonación de una sola célula, pudimos demostrar que la señal de "fondo" de hecho contenía CD4 específico de autoantígeno.máscélulas T ¿Qué eventos específicos conducen a la ruptura de la tolerancia y al aumento de la frecuencia deautorreactivoT célulassigue siendo especulativo; sin embargo, nuestros datos demuestran que la expansión de clones autorreactivos juega un papel en la patogenia del lupus eritematoso sistémico.
CD4 reactivo al antígeno nuclear circulantemásLas células T produjeron principalmente IFN-g y, en menor medida, IL-17 e IL-10. Este perfil de citocinas, junto con la correlación débil o nula con la producción de autoanticuerpos, sugiere que el papel del CD4 reactivo al antígeno nuclearmásLas células T pueden no ser el único proveedor de ayuda de las células B. Se ha demostrado que el IFN-g es indispensable en la patogenia de la NL. Se ha demostrado que las células Th1 son reclutadas en elinfectado riñóntejido ensistémico lupuseritematoso, lo que hace que las células T reactivas al antígeno nuclear sean las principales candidatas para invadir elriñones, donde encontrarían su omnipresente autoantígeno afín. Se ha descrito previamente que las células T urinarias reflejan la actividad de la enfermedad y reflejan el fenotipo de las células intrarrenales en LN20,33; por lo tanto, utilizamos las células T urinarias como sustituto deriñóncélulas T Las células T urinarias revelaron una variabilidad de TCR restringida, lo cual está en línea con las observaciones enriñónbiopsias, lo que indica el enriquecimiento de ciertos clones de células T en elinfectadoriñóntejido. Entre las células T urinarias, pudimos detectar células T reactivas al antígeno nuclear, y su frecuencia se enriqueció en comparación con las células T circulantes. En consecuencia, parece probable que las células reactivas al antígeno nuclear participen directamente en la propagación del daño orgánico local.
En resumen, aquí demostramos que los CD4 reactivos al antígeno nuclearmásLas células T se expanden inactivassistémicolupuseritematoso; fenotípicamente son principalmente células T Th1 productoras de IFN-g e invadeninfectadoórganos diana como elriñón.
Cistanche puede evitar la infección alriñóndebido asistémicolupuseritematoso.
MÉTODOS
Los métodos detallados se dan en el material complementario.
Sujetos y muestras de sangre y orina.
Se obtuvieron muestras de sangre de 17 individuos sanos, 12 pacientes con inactividadsistémicolupus eritematoso(sistémicolupuseritematosoPuntaje DAI<10), and="" 20="" patients="" with="" active="">sistémicolupuseritematoso(sistémicolupuseritematosoDAI score >10). Además, se obtuvieron muestras de orina de 12 pacientes consistémicolupuseritematosoy LN. Todos los sujetos habían dado su consentimiento informado sobre la base de la aprobación ética obtenida por la junta de revisión institucional y las autoridades éticas de Charité - Universitätsmedizin Berlin (EA 1/342/12, EA 1/098/07 y EA 1/036/16 ). Las PBMC y las células urinarias se prepararon usando un gradiente de densidad FicollHypaque.
Anticuerpos y citometría de seguimiento
Según los experimentos, se tiñeron varias moléculas de superficie en células estimuladas con antígeno en diferentes combinaciones de los siguientes anticuerpos monoclonales: anti-CD3, -CD4, -CD8, -CD14, -CD20, -CD69 y -CD154; para discriminar células vivas y muertas, el kit LIVE/DEAD Aqua (Life Technologies Ltd.,paisistémicolupuseritematoso, Reino Unido) fue utilizado.
Para teñir el compartimento celular intracelular, las células se fijaron con paraformaldehído al 2 por ciento (v/v) durante 15 minutos a temperatura ambiente y se permeabilizaron con BD FACS Permeabilizing Solution 2 (BD Biosciences, San José, CA); los siguientes antígenos se tiñeron intracelularmente usando un protocolo estándar: CD154, IFN-g, IL-2, IL-4, IL-10 e IL-17.
Las muestras se adquirieron en citómetros de seguimiento BD FACSCanto II y BD LSRFortessa (BD Biosciences) en el Centro de Citometría de Flujo Deutsches Rheuma-Forschungszentrum Berlin utilizando el software BD FACSDiva (BD Biosciences). Los datos de citometría de flujo se analizaron utilizando el software FlowJo (FlowJo v10, Three Star, Ashland, VA).
Preparación de antígenos y grupos de antígenos
Utilizamos los siguientes antígenos para estimular CD4másCélulas T en el ensayo de biblioteca de células T: {{0}},5 mg/ml de proteína recombinante humana SNRPD1 (SmD1) (Biorbyt Ltd., Cambridge, Reino Unido), 50 ng/ml de proteína recombinante humana SNRP70 (RNP70) (Abcam Plc., Cambridge, Reino Unido), 0,5 mg/ml de proteína histona humana natural (Abcam Plc.), 0,5 mg/ml de SS humana -Proteína recombinante A/Ro (amablemente proporcionada por Euroimmun AG, Lübeck, Alemania), 0,5 mg/ml de SS-B/La proteína recombinante humana (amablemente proporcionada por Orgentec Diagnostika GmbH, Mainz, Alemania), 1 mg/ml de SEB (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Alemania), 1 mg/ml de PepTivator Candida albicans MP65 (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Alemania) y 0,5 mg/ml de proteína recombinante de transtiretina humana (ATGen, Seongnam, Corea del Sur ).
Bibliotecas de células T periféricas y urinarias El protocolo para generar bibliotecas de células T periféricas y urinarias amplificadas se adoptó y adaptó como se describió anteriormente.14 Brieflfly, 200,000 CD4 periféricomásCélulas T o 500 a 2000 CD4 urinariosmásLas células T se aislaron usando anti-CD4 humanomásMicroBeads (Miltenyi Biotec GmbH) según las instrucciones del fabricante. La pureza de CD4másLa fracción de células T se comprobó de forma rutinaria mediante citometría de seguimiento sobre la base de CD3másCD4más expression, where the purity always reached >99 por ciento y 70 por ciento a 75 por ciento para muestras de sangre periférica y orina, respectivamente. Paralelamente, las células presentadoras de antígenos se prepararon mediante la recolección de células CD3 de PBMC después del agotamiento con microesferas CD3 antihumanas (Miltenyi Biotec GmbH) y se crioconservaron. Después de 1 a 2 semanas de cultivo, fracciones de CD4 amplificadomásLos linfocitos T se distribuyeron en 96-placas de pocillos, en función del número de antígenos a analizar. Antes de la estimulación con los antígenos, las células se dejaron en reposo durante al menos 4 días. El día de la estimulación, las células presentadoras de antígenos se descongelaron y distribuyeron en el cultivo de células T en una proporción de al menos 1 célula presentadora de antígenos por 100 células CD4.máscélulas T CD4másLas bibliotecas de células T para el control negativo (células no estimuladas) y el control positivo (células estimuladas con SEB) siempre se incluyeron en los experimentos. CD4más Las células T se estimularon con el antígeno durante 4 días y la proliferación se determinó usando un protocolo estándar de [3H]-timidina.
Los blastos de células T amplificados respondieron de manera diferente a los antígenos mostrados por CPM de centelleo altamente heterogéneo; por lo tanto, era necesaria una normalización del umbral de proliferación determinado como puntuación z específica del donante. La puntuación z se calculó como 5 diferencias de los percentiles 75 y 25 por encima de la mediana de CPM de microcultivos no estimulados. Las células en microcultivos estimulados con SEB sirvieron como control positivo. Cabe destacar que los microcultivos con un índice de estimulación SEB de<5 for="" peripheral="" blood="" samples,="" or="" 4="" for="" urinary="" samples,="" were="" excluded="" because="" it="" indicated="" poor="" cell="" viability.="" enumeration="" of="" the="" precursor="" frequency="" of="" antigen-specific="">másLas células T se calcularon usando el número de microcultivos negativos según la distribución de Poisson y se expresaron por 1 millón de células, como se describió anteriormente. El uso de la distribución de Poisson se basa en la probabilidad de que al menos 1CD4másLa célula T está presente en un solo microcultivo de bibliotecas de células T cuando se detectó la señal radiactiva después de la estimulación específica del antígeno.
En los métodos ARTE periférico y urinario seguimos el protocolo que utiliza el CD154 MicroBead Kit (Miltenyi Biotec GmbH). Brevemente, las células se estimularon durante 7 horas con antígenos y luego se marcaron con anticuerpos anti-CD154-biotina humana y microesferas anti-biotina de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células marcadas se cargaron en columnas MS calibradas (Miltenyi Biotec GmbH) para enriquecer las células que expresan CD154-. El marcaje de las células con éster de N-succinimidilo de diacetato de carboxifluoresceína (Sigma-Aldrich Chemie GmbH) se realizó siguiendo un protocolo estándar.
Cistanche mejorariñónfunciones
Generación de clones unicelulares
Se generaron clones unicelulares a partir de células reactivas al antígeno, que se enriquecieron con la expresión de CD154 siguiendo el protocolo ARTE. Las células que expresan CD154- se filtraron con un filtro de preparación de 30- mm (Miltenyi Biotec GmbH) y se resuspendieron en 1 ml de solución salina fría tamponada con fosfato al 20 por ciento (v/v), 0,5 por ciento de albúmina de suero bovino y ácido etilendiaminotetraacético 2 mM. Las células fueron células individuales clasificadas para el CD154másCD69másfenotipo, y se cultivaron células separadas individuales en pocillos individuales de 96-placas de pocillos en presencia de células alimentadoras. Los cultivos celulares se mantuvieron durante 3 a 4 días hasta que se hicieron visibles varios clones. Un día antes de la reestimulación, las células presentadoras de antígenos se descongelaron y distribuyeron en el cultivo de células T en una proporción de
al menos 1 célula presentadora de antígeno a 100 CD4máscélulas T Las células se estimularon con 1 mg/ml de antígeno y los clones no estimulados sirvieron como control negativo.
Análisis de repertorio TCR basado en secuenciación de última generación
El ADN genómico se aisló de CD4 periféricomásCélulas T y células urinarias utilizando el AllPrep DNA/RNA Micro Kit (Qiagen, Venlo, Países Bajos). El locus de TCR-b recombinante se amplificó siguiendo el protocolo descrito anteriormente. Las lecturas se procesaron utilizando IMSEQ, y los clonotipos iguales se agruparon y analizaron más.
Estadísticas
Las pruebas estadísticas se realizaron con el software GraphPad Prism (Prism 8, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Se aplicó el ajuste de Bonferroni para comparaciones múltiples. La prueba U de Mann-Whitney y la prueba de rango con signo de Wilcoxon se utilizaron en los experimentos con conjuntos de datos independientes y dependientes, respectivamente. Después del ajuste de Bonferroni para comparaciones múltiples, se corrigió el cálculo de los valores de P críticos porque se basa en el número de comparaciones planificadas. valores p<0.01 were="" considered="" statistically="" significant="" with="" the="" following="" indication:="" *p="" <="" 0.01,="" **p="" <="" 0.005,="" and="" ***p="" <="" 0.0005.="" correlation="" analyses="" were="" performed="" using="" spearman="" rank="" correlations="" by="" showing="" the="" absolute="">sistémicolupuseritematosoValores DAI en lugar de valores clasificados para proporcionar una mejor comprensión de la correlación entre el número de células y la actividad de la enfermedad. Para análisis de correlación, valores de P<0.5 were="" considered="" statistically="" significant="" with="" the="" following="" indication:="" *p="" <="" 0.05,="" **p="" <="" 0.01,="" and="" ***p="" <="" 0.001.="" when="" background="" frequencies="" were="" higher="" than="" the="" frequencies="" of="" nuclear="" antigen–reactive="">másLas células T, las frecuencias sin fondo se definieron como cero. Se aplicó una transformación log(x + 1) al conjunto de datos cuando incluía valores cero. Los datos complementarios del paciente y los datos estadísticos están disponibles en las tablas complementarias S1 y S2.
CD4 reactivo al antígeno nuclearmáslas células se expanden en activosistémicolupuseritematoso, producen citocinas efectoras e infectan elriñones,cistanche puede proteger elriñones.
DIVULGACIÓN
Todos los autores declararon no tener intereses en conflicto.
EXPRESIONES DE GRATITUD
Agradecemos a Toralf Kaiser y Jenny Kirsch (Flow Cytometry and Cell Sorting Facility, Deutsches Rheuma-Forschungszentrum Berlin) por su ayuda con la citometría de flujo y la clasificación de células. El apoyo para estos estudios fue proporcionado por subvenciones de Deutsche Forschungsgemeinschaft dentro de Sonderforschungsbereich 650 to GR y por subvenciones de Deutsche Gesellschaft für Nephrologie and Clinical Scientist Program of Charité–Universitätsmedizin Berlin and Berlin Institute of Health to PE.
MATERIAL COMPLEMENTARIO Archivo complementario (PDF)
Figura S1. CD4 específico de antígeno nuclear autorreactivomásLas células T se detectaron mediante el método de la biblioteca de células T. Figura S2. CD154másCD69másCD4másLas células T aisladas después de la estimulación con antígenos nucleares de individuos sanos son células CD4 específicas de antígeno de buena fe.máscélulas T
Figura S3. Las frecuencias de CD4 autorreactivo productor de citoquinasmásLas células T se compararon con el título de anticuerpos antinucleares (anti-ANA) (A) y con la concentración de anticuerpos anti-ADN de doble cadena (anti-dsDNA) (B).
Figura S4. CD4 reactivo al antígeno nuclearmásSe detectaron células T en la orina de activossistémicolupuseritematosopacientes con NL.
Tabla S1. Datos clinicos.
Tabla S2. Resumen de valores medianos.
Métodos complementarios.
Una vez elriñónestá infectado debido al antígeno nuclear CD4 reactivomáscélulas que se expanden en activosistémicolupuseritematoso, lariñónse destruye la función, se usa cistanche para mejorarriñónfunción.
REFERENCIAS
1. Casciola-Rosen LA, Anhalt G, Rosen A. Autoantígenos dirigidos ensistémico lupuseritematosose agrupan en dos poblaciones de estructuras superficiales sobre queratinocitos apoptóticos. J Exp Med. 1994; 179: 1317-1330.
2. Arbuckle MR, McClain MT, Rubertone MV, et al. Desarrollo de autoanticuerpos antes del inicio clínico desistémicolupuseritematoso. N Engl J Med. 2003;349:1526–1533.
3. Suárez-Fueyo A, Bradley SJ, Tsokos GC. células T ensistémicolupuseritematoso. Curr Opin Immunol. 2016;43:32–38.
4. Crow MK, DelGiudice-Asch G, Zehetbauer JB, et al. Proliferación de células T específicas de autoantígeno inducida por la proteína ribosomal P2 en pacientes consistémicolupuseritematoso. J Clin Invest. 1994;94:345–352.
5. Engler JB, Undeutsch R, Kloke L, et al. Desenmascaramiento de CD4 autorreactivomáscélulas T por agotamiento de las células T reguladoras CD25 ensistémicolupuseritematoso. Ann Rheum Dis. 2011;70:2176–2183.
y etc.
