El cistanosido de Cistanche Herba mejora el daño reproductivo masculino inducido por la hipoxia mediante la supresión del estrés oxidativo-Ⅱ

Efectos de Cis sobre la viabilidad de las células GC-1 inducida por hipoxia in vitro.

Para investigar si Cis puede prevenir los efectos inhibidores de la hipoxia sobre la viabilidad de las células GC{{0}}, se realizó un ensayo CCK-8. Las células GC-1 se trataron con diferentes subtipos (Cis-A, B, C, H) y rangos de concentración (0.02 μM, 0.2 μM, 2 μM) de Cis durante 72 h. Una comparación del grupo modelo con el grupo DMSO mostró que DMSO no promovió directamente la viabilidad de las células GC{{10}} (Figura 2A). Sin embargo, las viabilidades celulares se restauraron notablemente (P < 0.05) con los tratamientos con Cis. En comparación con el grupo modelo, Cis-A, Cis-B, Cis-C y Cis-H mostraron ciertos efectos protectores sobre el daño inducido por la hipoxia en la viabilidad de las células GC-1, y Cis-B mostró los efectos más significativos. efecto (Figura 2A). Los efectos protectores de Cis a 0.2 μM fueron significativamente mayores que los efectos protectores de Cis a 0.02 μM, mientras que la diferencia entre 2 μM y 0,2 μM no fue obvia, lo que indica que la restauración La viabilidad celular GC-1 inducida por Cis demostró un aumento dependiente de la dosis en el rango de concentración de 0,02-0.2 μM (Figura 2A). Por lo tanto, de acuerdo con las necesidades experimentales, se seleccionó Cis 0,2 μM como concentración óptima en los siguientes experimentos in vitro. Para confirmar aún más si las células germinales estaban realmente protegidas por Cis, se realizaron tinciones con FCM y Ki-67 para evaluar la alteración de la proliferación de células GC-1 después del tratamiento con Cis. Tras el tratamiento con Cis, se redujo la proporción de células GC-1 en la fase G1. Por el contrario, más células entraron en la fase S, lo que sugiere que el tratamiento con Cis podría aumentar el índice de proliferación de células germinales (P <0,01; Figura 2B). Las estadísticas para el ciclo celular GC-1 se muestran en la Figura 2Bb. Los resultados de la tinción con Ki-67 también mostraron que el tratamiento con Cis-A, Cis-B, Cis-C y Cis-H mejoró significativamente la proporción de células Ki-67-positivas de la GC inducida por hipoxia{{54} } células in vitro (Figura 2C).

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El mecanismo de Cis protege a las células germinales de la hipoxia in vitro.

Para investigar si los efectos protectores de Cis en las células GC-1 estaban relacionados con la eliminación del exceso de ROS, se utilizó el tinte fluorescente DCFH-DA para detectar los niveles de ROS en cada grupo. Como se muestra en las Figuras 3A y 3B, el tratamiento con DMSO no cambió el contenido de ROS intracelular ni el nivel de LPO en comparación con el grupo modelo. Sin embargo, los niveles de ROS en las células GC-1 se redujeron notablemente en los grupos tratados con Cis (Figura 3A). Además, también se observó una disminución de LPO en células GC-1 sometidas a Cis (Figura 3B).

Para explorar más a fondo el mecanismo por el cual Cis protege a las células germinales de la lesión hipóxica, se realizaron tinciones TUNEL y análisis de transferencia Western para evaluar la apoptosis. La tinción con TUNEL (Figura 3C) mostró una apoptosis significativa en los grupos modelo y DMSO. Sin embargo, se observaron menos células apoptóticas con el tratamiento con Cis, lo que indicó que el tratamiento con Cis redujo la apoptosis de las células GC-1. Además, se midió la expresión de PARP, Caspasa-3, Bax y Bcl-2 para corroborar el mecanismo molecular. Como se presenta en la Figura 3D, la caspasa-3 y PARP se activaron en células GC-1 en condiciones de hipoxia, y esta activación fue inhibida por el tratamiento con Cis. Además, la proporción de Bax/Bcl-2 fue mayor en el grupo modelo que en el grupo de control, y el tratamiento con Cis redujo la proporción de Bax/Bcl-2 (Figura 3D). Estos datos indicaron que Cis tenía una capacidad potencial para atenuar el daño oxidante inducido por la hipoxia, y este efecto protector podría lograrse reduciendo la acumulación de ROS e inhibiendo la activación de la vía de apoptosis relacionada con la caspasa.

El mecanismo enzimático que inhibe la OS implica eliminadores de radicales libres como la glutatión reductasa (GR), la glutatión peroxidasa (GPx) y la superóxido dismutasa (SOD) [23]. El mecanismo enzimático que inhibe la OS juega un papel esencial en la prevención del daño oxidativo en células y tejidos [23]. Para validar aún más el mecanismo potencial de inhibición de Cis de la OS inducida por hipoxia en células GC-1, se midieron las actividades de GR, GPx y SOD. Los resultados revelaron que las actividades de GR, GPx y SOD disminuyeron significativamente (P < 0.01, Figura 3E) bajo hipoxia en comparación con los grupos de control, y el tratamiento con Cis restauró notablemente sus actividades en Células GC-1 expuestas a hipoxia (P <0,05, Figura 3E), lo que sugiere que estos compuestos podrían activar el poderoso sistema antioxidante endógeno.

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Efectos de Cis sobre la reproducción en ratas inducidas por hipoxia hipobárica.

Para determinar los efectos de la hipoxia hipobárica en ratas macho, primero probamos las alteraciones morfológicas de los testículos en ratas inducidas por hipoxia hipobárica. Los resultados de la tinción con HE mostraron que en el grupo de control, las células espermatogénicas normales en diversas etapas estaban dispuestas de manera ordenada desde la membrana basal hasta la luz, y los espermatozoides maduros eran visibles en las luces de los túbulos (Figura 4A). En comparación con los controles, se observaron alteraciones patológicas del tejido testicular en el grupo modelo, la membrana basal de las células epiteliales testiculares estaba dispuesta de manera laxa, el epitelio espermatogénico era extremadamente delgado y el nivel y número de células germinales se redujeron notablemente (Figura 4A). . Sin embargo, el tratamiento con Cis mejoró notablemente la histología del daño testicular inducido por hipoxia hipobárica in vivo (Figura 4A). También medimos el peso corporal, el peso de los testículos, el peso del epidídimo y el peso de la vesícula seminal, lo que llevó a calcular el índice de órganos reproductivos (la relación entre órganos reproductivos y peso corporal). Como se muestra en la Figura 4B-D, el índice de órganos reproductivos (testículos, epidídimo y glándula vesícula seminal) fue marcadamente menor en el grupo modelo (P <0.01) que en el grupo de control. Sin embargo, el efecto de la hipoxia hipobárica sobre el índice de órganos reproductivos de las ratas se revirtió con el tratamiento con Cis (Figura 4B-D).

A continuación, también se midieron la actividad de la enzima acrosómica y la tasa de espermatozoides vivos de los espermatozoides de ratas macho para dilucidar el daño a la función testicular. Como se muestra en la Figura 4E, 4F, la actividad de la enzima acrosómica y la motilidad de los espermatozoides fueron menores en las ratas del grupo modelo que en el grupo de control (P < 0.01). Sin embargo, en comparación con las ratas del grupo modelo, la actividad de la enzima acrosómica se restableció en las ratas tratadas con 8 mg/kg/d de Cis (P <0,05) (Figura 4D). Además, como se muestra en la Figura 4F, el tratamiento con Cis tambiénMejoró la tasa de espermatozoides vivos.; todas las ratas tratadas con 8 mg/kg/d de Cis mostraron una tasa de espermatozoides vivos significativamente mayor (55,83 ± 6,03%, P < 0.05; 69,{ {8}} ± 2,29%, P < 0.01; 52,33 ± 3,40%, P < 0,05; y 53,67 ± 2,25%, P < 0,05 respectivamente) en comparación con las ratas modelo (43,83 ± 4,01%) .

En conjunto, estos resultados sugirieron que el ambiente hipóxico hipobárico provocó alteraciones morfológicas testiculares, pérdida de peso de los órganos reproductivos y daños a la función testicular en ratas macho, y Cis podría proteger eficazmente los órganos reproductivos del daño inducido por la hipoxia.

Efectos de Cis sobre la OS en los testículos de ratas inducidas por hipoxia hipobárica.

Se midieron los niveles de ROS y LPO en los testículos de ratas para analizar los efectos de Cis en la SG inducida por hipoxia hipobárica. El análisis de ROS reveló que, en comparación con el grupo de control, los niveles de ROS en los testículos en el grupo modelo aumentaron significativamente (P < 0.01 Figura 5A). Por el contrario, la LPO se elevó dramáticamente en los testículos (P <0.01) bajo hipoxia hipobárica en comparación con condiciones normóxicas (Figura 5B). Sin embargo, el tratamiento con Cis alteró los cambios anteriores (P <0,05), en los que Cis-B ejerció mejores efectos que otros Cis (Figura 5A, 5B). Cis pareció proteger los testículos al reducir la OS en condiciones hipóxicas hipobáricas in vivo.

Además, se realizaron análisis de apoptosis para evaluar más a fondo el mecanismo por el cual Cis protegía contra la lesión de la función testicular inducida por hipoxia hipobárica. Los resultados de la tinción TUNEL (Figura 5C) mostraron que existía una apoptosis significativa en el grupo modelo en comparación con el grupo de control. Sin embargo, después del tratamiento con Cis (8 mg/kg/d), se produjeron menos células apoptóticas (P <0.05) (Figura 5C). Los datos de la transferencia Western también mostraron que la hipoxia y el tratamiento hipobárico dieron como resultado la activación de Caspasa-3 y PARP y un aumento de la relación Bax/Bcl-2 en el tejido testicular, lo que indica un aumento en la apoptosis (Figura 5D). Además, diferentes tipos detratamiento cisapoptosis significativamente reducida en el tejido testicular (Figura 5D). De manera similar, el análisis IHC del tejido testicular mostró resultados similares (Figura 1 complementaria).

Para verificar el mecanismo de OS reducido por Cis desencadenado por hipoxia hipobárica, probamos más a fondo las actividades de GR, GPx y SOD en el tejido testicular. Como se muestra en la Figura 5E, en comparación con el grupo de control, el tratamiento con hipoxia hipobárica redujo significativamente las actividades de GR, GPx y SOD (P < 0.01). Sin embargo, el tratamiento con Cis restauró las actividades enzimáticas (GR, GPx y SOD) del tejido testicular en ratas tratadas con hipoxia hipobárica (P <0,05). En conclusión, Cis parecía proteger los testículos activando un poderoso mecanismo de defensa enzimático antioxidante endógeno en condiciones de hipoxia hipobárica.

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Discusión

En áreas de gran altitud, se sabe que la hipoxia hipobárica afecta múltiples sistemas en los humanos, incluido el sistema reproductivo masculino [4, 20]. Investigaciones experimentales recientes están orientadas a comprender los mecanismos por los que la hipoxia hipobárica afecta el sistema reproductivo masculino. En este estudio, se investigó el efecto terapéutico del extracto de Cis de Cistanches Herba sobre el daño reproductivo inducido por la hipoxia. Los resultados demostraron que Cis puede proteger el sistema reproductivo masculino del daño hipóxico al reducir la acumulación de ROS y OS inducida por la hipoxia al mejorar la actividad de las enzimas antioxidantes endógenas.

Los ROS son radicales libres derivados del oxígeno que desempeñan un papel vital en la fisiología y patología humana. Las dosis bajas de ROS son esenciales paracapacitación espermática, la reacción acrosómica y la fusión espermatozoide-ovocito [24, 25]. Sin embargo, la acumulación excesiva de ROS a menudo provoca daños en las células germinales y estromales, lo que provoca infertilidad masculina [26]. Las ROS pueden dañar fácilmente las membranas celulares, los ácidos nucleicos, las proteínas, las enzimas y otras macromoléculas biológicas mediante la peroxidación. Además, también provocan posibles daños celulares y del ADN cuando superan la capacidad de transporte de antioxidantes. La evidencia acumulada respalda el papel fundamental de las ROS en la patogénesis de la fertilidad masculina [27, 28]. La producción de ROS está regulada por la tensión de oxígeno. En condiciones hipóxicas, el oxígeno disponible en el medio ambiente disminuye y la viscosidad de la sangre aumenta, lo que afecta muchos procesos metabólicos dependientes de oxígeno en el organismo [29, 30]. Sin embargo, la menor presión atmosférica en altitudes elevadas provoca un retorno venoso deficiente y una disminución en la cantidad de oxígeno transportado por el torrente sanguíneo a todas las células del organismo, lo que aumenta aún más la hipoxia de órganos y células [29, 30]. Así, la exposición a gran altitud da lugar a una serie de respuestas fisiológicas hipóxicas, incluida la producción y acumulación de ROS, cuando la demanda de oxígeno excede el suministro vascular. Como se mencionó anteriormente, la acumulación de ROS conduce a una variedad de efectos intracelulares, el más crítico de los cuales es causar OS en las células.

OS se refiere a un desequilibrio entre las reacciones de oxidación y reducción, que conduce a la generación de un exceso de oxidantes o moléculas que aceptan un electrón de otro reactivo, lo que a su vez produce ROS [31, 32]. Se sabe que la OS puede desencadenarse por una serie de factores endógenos y exógenos, incluida la exposición a gran altitud. Los espermatozoides son células particularmente susceptibles a la OS debido a sus sistemas de reparación celular inadecuados y al alto contenido de ácidos grasos poliinsaturados en la membrana plasmática [33]. Los tejidos testiculares y epididimarios no son una excepción, ya que se ha observado la presencia de OS grave en espermátidas redondas de ratas sometidas a hipoxia [4]. OS afecta la estabilidad del ADN, poniendo en peligro la integridad del material genético del gameto [34-36]. Sin embargo, se ha confirmado que un alto nivel de daño en el ADN en los gametos masculinos conduce a la activación de la señalización de apoptosis, lo que resulta en una reducción del recuento de espermatozoides del epidídimo y un aumento en el porcentaje de células defectuosas [28, 37]. En el presente estudio, la hipoxia redujo significativamente la viabilidad de las células GC-1 mediante la inducción de apoptosis y la detención del ciclo celular. Más importante aún, el análisis FCM mostró niveles significativamente mayores de ROS después de la estimulación por hipoxia, con una mayor tasa de apoptosis y una mayor activación de Caspasa-3, PARP y relación Bax/Bcl-2, lo que indica que ROS podría activar apoptosis activando la vía de señalización de caspasa durante el daño a la fertilidad inducido por hipoxia. Los hallazgos actuales demostraron que la hipoxia conducía a una acumulación excesiva de ROS, provocando daño oxidativo a las células reproductivas. Por lo tanto, es significativo identificar nuevos antioxidantes que puedan servir como un enfoque eficaz para aliviar los daños a la fertilidad inducidos por la hipoxia.

Para protegerse contra la OS, existe en el cuerpo un complejo sistema antioxidante, compuesto principalmente por factores enzimáticos. En condiciones fisiológicas, el contenido de ROS y el sistema antioxidante mantienen un cierto equilibrio. Sin embargo, la sobreproducción de ROS agota el sistema antioxidante del esperma, lo que lleva a la OS, lo que daña el ADN del esperma y da como resultado tasas más bajas de fertilidad y embarazo [23]. Por lo tanto, para abordar la sobreproducción de ROS y los efectos nocivos relacionados a nivel celular en el sistema reproductivo masculino, se han probado diferentes estrategias antioxidantes [23]. Actualmente, la literatura sobre el uso de compuestos con actividad antioxidante ymejora de la función de los espermatozoideses extenso. Es importante destacar que la mayoría de los informes describen una mejora en los parámetros del esperma después de la ingesta de antioxidantes orales, incluyendomejoras en la concentración de espermatozoidesy motilidad o una disminución del daño al ADN [38]. Por lo tanto, un número creciente de urólogos prescriben antioxidantes orales para la infertilidad debido a problemas relacionados con el sistema operativo [39]. Estos antioxidantes incluyen principalmente carnitinas, vitaminas, zinc, melatonina y compuestos naturales [23, 40]. Actualmente, con el desarrollo de la tecnología de extracción de fármacos, también se está considerando un número cada vez mayor de extractos de MTC para mitigar la infertilidad masculina porque estos antioxidantes pueden reducir los efectos destructivos de la OS [41]. Yüce A. et al. informó en 2013 que la canela tiene efectos beneficiosos sobre el equilibrio oxidativo y antioxidante en los testículos y la calidad del esperma [R]. Zhang L et al. demostró que la curcumina mejora significativamente la motilidad de los espermatozoides en pacientes y disminuye el H2O2 [43]. Además, también se ha demostrado que una variedad de otros extractos de plantas como el arándano, el crocus sativus, las semillas de granada y el té verde protegen el sistema reproductivo a través de mecanismos antioxidantes [27, 44-47]. Cistanches Herba es una medicina tradicional china importante que posee un perfil de seguridad favorable y amplias funciones medicinales para el tratamiento de la infertilidad, entre otras afecciones [13]. Los estudios farmacológicos modernos han demostrado que Cistanches Herba posee diversas actividades, como actividades antioxidantes, antiinflamatorias, hepatoprotectoras y antineurodegenerativas [13, 48]. Por lo tanto, los extractos, fracciones o compuestos de Cistanches Herba pueden tener características antioxidantes potenciales para el tratamiento de la infertilidad.

Las sustancias activas de las plantas que mejoran la fertilidad incluyen varios grupos químicos como PhG, saponinas, compuestos volátiles oxigenados y alcaloides [41]. Los estudios de actividad farmacológica de los PhG han demostrado que los PhG exhiben una amplia gama de bioactividades, como antioxidante, neuroprotección antirradiación y mejora de la función sexual [49, 50]. Entre estas actividades, la antioxidación está atrayendo progresivamente la atención. Se ha informado que algunos componentes individuales o fracciones de PhG inhiben la apoptosis de células germinales inducida por diversos productos químicos, y sus capacidades antioxidantes in vitro también se han demostrado in vivo en varios modelos animales [51, 52]. Estos resultados indican que los PhG podrían ser un candidato atractivo para eltratamiento de la infertilidad masculina. Cis es un PhG activo que se puede aislar de Cistanches Herba. En el presente estudio, exploramos los efectos de Cis en células tratadas con hipoxia o en un modelo de rata e investigamos los mecanismos moleculares subyacentes. Cis exhibió actividades protectoras sobre la disminución de la viabilidad inducida por la hipoxia y el aumento de la apoptosis en las células GC-1, y también mostró un efecto protector sobre el daño inducido por la hipoxia en el sistema reproductivo de ratas in vivo. Se observó una disminución significativa en las actividades de GR, GPx y SOD bajo hipoxia en comparación con los grupos normóxicos, mientras que las actividades específicas de GR, GPx y SOD aumentaron significativamente en los testículos o las células GC-1 tratadas con Cis. Cis pareció proteger los testículos y las células GC-1 en condiciones hipóxicas al mejorar las actividades de las enzimas antioxidantes.

Los antioxidantes enzimáticos funcionan principalmente eliminando aniones superóxido, previniendo así la peroxidación lipídica y el daño del ADN para prevenir la infertilidad. Los mecanismos antioxidantes enzimáticos desempeñan un papel crucial en la prevención del daño oxidativo [23]. El mecanismo enzimático contra la OS comprende captadores de radicales libres y enzimas dependientes de glutatión, incluidas GR, GPx y SOD [12]. Se sabe que las enzimas antioxidantes son esenciales para el sistema reproductivo masculino. En el estudio actual, el efecto de la reducción de las actividades de las enzimas antioxidantes bajo hipoxia hipobárica estuvo acompañado por un aumento de ROS y LPO en el grupo modelo, lo que concuerda con informes anteriores [12]. Sin embargo, la administración de Cis condujo a una recuperación de las actividades de las enzimas antioxidantes en las células GC-1 y los testículos de ratas, lo que permitió generar estrategias para administrar Cistanches Herba para prevenir el daño inducido por la hipoxia hipobárica, como se sugirió anteriormente. Aunque los resultados actuales mostraron que el tratamiento con Cis disminuyó parcialmente el daño de las células germinales inducido por la hipoxia en ratas, se necesitan más investigaciones para desentrañar el panorama completo de sus efectos protectores reproductivos. Por ejemplo, el mecanismo específico de Cis afecta la actividad de las enzimas antioxidantes. Además, existe la duda de si otros mecanismos también podrían ser pertinentes, ya que Cis sólo se recuperó parcialmente del daño reproductivo causado por la hipoxia. Por último, también se debe considerar si Cis tiene un efecto promotor del crecimiento directo sobre las células germinales.

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Conclusiones

En general, los hallazgos de este estudio enfatizan el potencial del Cis como antioxidante para el tratamiento del daño reproductivo masculino inducido por la hipoxia. Cis puede proteger contra el daño reproductivo masculino inducido por la hipoxia al restaurar la actividad de la enzima antioxidante, reducir la OS inducida por ROS, aumentar simultáneamente la viabilidad celular y disminuir la apoptosis. Es importante destacar que todos los subtipos de Cis (Cis-A, Cis-B, Cis-C y Cis-H) estudiados en este estudio mostraron un cierto efecto protector sobre el sistema reproductivo, y Cis-B mostró el efecto más significativo. Por lo tanto, especulamos que Cis podría ser un buen candidato a antioxidante para elTratamiento del daño reproductivo masculino inducido por hipoxia., aunque el mecanismo subyacente preciso requiere más investigación.