El cistanosido de Cistanche Herba mejora el daño reproductivo masculino inducido por la hipoxia mediante la supresión del estrés oxidativo-Ⅰ
Apr 01, 2024
Introducción
Actualmente, aproximadamente 48,5 millones (15%) de parejas en edad reproductiva en todo el mundo se ven afectadas por la infertilidad, entre las cuales el 40-50% de los casos se atribuyen a la infertilidad masculina, una condición que está fuertemente asociada con factores ambientales y de estilo de vida. La evidencia sugiere que la susceptibilidad de los testículos de los mamíferos a la baja presión de oxígeno es un factor causante de algunas formas de infertilidad masculina. Como se demostró en estudios previos, la espermatogénesis se ve afectada y reducida tras la exposición a la hipoxia hipobárica.
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Para explorar el mecanismo subyacente, los estudios han demostrado que la exposición a la hipoxia hipobárica aumenta la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS). ROS juega un papel importante en el sistema reproductivo masculino. En niveles bajos, son necesarios para la capacitación de los espermatozoides, la reacción acrosómica y la fusión espermatozoides-ovocitos [10]. Sin embargo, el exceso de ROS puede inducir daño al ADN nuclear/mitocondrial del espermatozoide y daño peroxidativo a la membrana plasmática, que a su vez son factores etiológicos importantes para lamayor riesgo de infertilidad masculina. Por tanto, la acumulación de ROS inducida por hipoxia podría ser una causa de infertilidad masculina.
Cistanches Herba, una planta medicinal parásita perenne, está ampliamente distribuida en zonas áridas y se utiliza ampliamente debido a sus actividades farmacológicas. Entre todos los contenidos efectivos deCistanches Herba, los PhG se han considerado el principal componente activo. Hasta la fecha, se han aislado 34 PhG dePlantas de cistanches. cistanósido(Cis), un PhG activo aislado deCistanches Herba, ha recibido atención por sus efectos antioxidantes.
Teniendo en cuenta los efectos antioxidantes de Cis y el papel de ROS en la infertilidad masculina inducida por hipoxia, Cis se considera un fármaco candidato potencial para el tratamiento deinfertilidad masculina inducida por hipoxia. Sin embargo, pocos informes han abordado los efectos antioxidantes del Cis extraído de Cistanches Herba en el tratamiento de la infertilidad masculina inducida por hipoxia o las vías de señalización involucradas. En este estudio, se construyeron modelos experimentales de hipoxia in vitro e in vivo y se evaluaron los componentes de efectos de diferentes Cis.
Materiales y métodos
Cultivo celular y reactivo.
La línea celular de espermatogonias de ratón GC-1spg (GC-1) se adquirió de la American Type Culture Collection (ATCC) y se cultivó en DMEM (Invitrogen, EE. UU.) suplementado con 10 % de suero fetal bovino, 1 % L-glutamina (100 mM), penicilina (100 U/mL) y estreptomicina (100 ug/mL) a 37 grados en una incubadora humidificada con 5% de CO2. Cis (Cis-A, B, C, H) se adquirió de Chengdu Gelipu Biotechnology Co., Ltd. (China).
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Ensayo de viabilidad celular.
La viabilidad celular se probó mediante el ensayo del kit de recuento celular{{0}} (CCK-8). En resumen, se sembraron células GC-1 en placas de 96-pocillos a 1,5 × 103 por pocillo y se cultivaron a 37 grados durante 24 h. Luego, las células fueron tratadas con diferentes concentraciones (20%, 15%, 10%, 5%) de oxígeno o diferentes concentraciones (2 μM, 0,2 μM, 0,02 μM) de Cis (Cis-A, Cis-B, Cis- C, Cis-H) durante el tiempo requerido. Luego, se descartó el sobrenadante y se detectaron las viabilidades celulares utilizando un kit CCK-8 (Dojindo Japón). La absorbancia de cada pocillo se midió a 450 nm utilizando un lector de microplacas (BioRad USA). Finalmente, las viabilidades celulares se calcularon de acuerdo con la siguiente fórmula: Viabilidad celular=(grupo ODexperimental - grupo ODblank)/(grupo ODcontrol - grupo ODblank) × 100%.
Análisis de Western Blot
Las células o tejidos recolectados se homogeneizaron en tampón RIPA para extraer proteínas (RIPA Beyotime China; Cocktail Roche Suiza). Se recogieron los sobrenadantes y se analizó la concentración de proteínas mediante el método BCA (Beyotime). Aproximadamente 40 ug de las proteínas extraídas de cada muestra se separaron mediante SDS-PAGE y se electrotransfirieron a una membrana de filtro de nitrocelulosa (NC) (Beyotime China). Las membranas de filtro NC se bloquearon con leche desnatada al 5 % durante 1,5 h y se incubaron con anticuerpos específicos (anti-PARP 1:1000, antiCaspasa-3 1:1000, anti-Bcl-2 1:1000, anti-Bax 1 :1000, anti-GAPDH 1:1000; todos los anticuerpos se adquirieron de Cell Signaling Technology, EE. UU.) durante la noche a 4 grados. Luego, todas las membranas NC se incubaron con el correspondiente anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante durante 1,5 h a temperatura ambiente y se tomaron imágenes con un sistema de imágenes (Tannon, China).
Detección del ciclo celular
Se realizó un ensayo de citometría de flujo (FCM) para analizar el ciclo celular. Las células se trataron en diferentes condiciones durante 72 h y se recogieron. Luego, las células se lavaron con PBS, se fijaron en etanol al 75% y se tiñeron con yoduro de propidio (PI). Para cada muestra, se recogieron 1 x 104 células y se analizaron mediante citometría de flujo (FACS Calibur, BD Biosciences). Luego, se calcularon la proporción de células en fase G1/S/G2 y el índice de proliferación [Fase (S+G2)/Fase (G1+S+G2) × 100%].
Tinción de Ki-67
Las células se cultivaron en una placa confocal y se trataron con hipoxia o diferentes subtipos de Cis durante 72 h. Después de fijar todas las células con paraformaldehído al 4 %, se incubaron con un anticuerpo anti-Ki-67 (1:200, tecnología de señalización celular). Luego, todas las células se incubaron con el correspondiente anticuerpo IgG anti-conejo conjugado con CY-3- (1:200, Boster, China) y solución DAPI (1,0 ug/ml, Beyotime). La fluorescencia se observó con un microscopio confocal Fluoview FV1000 (Olympus, Japón).
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Detección de ROS
Se introdujo FCM para medir los niveles de ROS intracelulares utilizando DCFH-DA. Las células suspendidas se sembraron en 6-placas de pocillos y se sometieron a diferentes tratamientos. Después de 72 h de tratamiento, las células se suspendieron en DMEM sin suero con DCFH-DA 10 μM (Beyotime). Luego se determinaron los contenidos de ROS mediante clasificación de células activadas por fluorescencia en un sistema de citometría de flujo Beckman Coulter con una longitud de onda de excitación de 488 nm y una longitud de onda de emisión de 525 nm [18].
Determinación de la peroxidación lipídica (LPO)
Se realizó el ensayo de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS) para detectar LPO. Todos los pasos operativos se realizaron de acuerdo con las instrucciones (Sigma USA). Las concentraciones se calcularon utilizando un coeficiente de extinción molar de 1,56×105/(M·cm), que se obtuvo utilizando malondialdehído como estándar. Los resultados se expresan como nmol de equivalentes de MDA/mg de proteína.
Determinación de actividades enzimáticas.
Las actividades enzimáticas se probaron utilizando kits de ensayo que incluían glutatión reductasa (GR), glutatión peroxidasa (GPx) y superóxido dismutasa (SOD). Todos los pasos operativos se realizaron de acuerdo con las instrucciones suministradas (Nan Jing Jian Cheng Bioengineering Institute China).
Animales y protocolo experimental.
Se obtuvieron ratas Wistar macho maduras (180-220 g, 8 semanas de edad) del centro de animales de la Cuarta Universidad Médica Militar, Xi'an, China. El permiso para el uso de los animales se obtuvo del Comité de Ética de la Universidad (Número de referencia: 20190506). El experimento con animales se llevó a cabo de acuerdo con las directrices universitarias para el cuidado y uso de animales de laboratorio.
A todas las ratas se les permitió adaptarse durante aproximadamente 1 semana antes del comienzo del experimento. Después de la aclimatación, las ratas se distribuyeron aleatoriamente en 6 grupos con 5 animales en cada grupo. Las ratas del grupo de control se criaron bajo presión normal (PO2: 20%; presión de aire: 101,3 kPa), mientras que las ratas del grupo modelo y tratado con Cis se criaron en una cámara de oxígeno de baja presión (presión interna de 61,6 kPa). , equivalente a una altura de 4000 metros sobre el nivel del mar; PO2: 14,55%) para simular un ambiente hipóxico de gran altitud. Todas las ratas tuvieron libre acceso a comida y agua en jaulas de plástico a 22 ± 2 grados y condiciones de humedad con un ciclo automático de luz/oscuridad de 12-h. Las ratas en el modelo y en los grupos tratados con Cis permanecieron en condiciones hipobáricas, pero fueron transferidas a condiciones normobáricas cada 96 h, momento en el que se les proporcionó comida y agua y se limpiaron las jaulas. La duración de la transición de hipobárico a hipobárico fue de aproximadamente 2 h. Todos los grupos de tratamiento fueron tratados con el Cis correspondiente (8 mg/kg/d) mediante sonda oral durante 8 semanas, mientras que las ratas control y modelo fueron tratadas con un volumen igual de agua.
Después de 8 semanas, las ratas fueron sacrificadas bajo anestesia. Se separaron y pesaron los testículos, el epidídimo y las vesículas seminales, y se calculó el índice de órganos de acuerdo con la siguiente fórmula: (peso del órgano/peso del animal) × 100%. Posteriormente, se recogieron espermatozoides en el epidídimo y se analizó su motilidad y actividad enzimática acrosómica. De manera similar, se recolectaron tejidos testiculares para estudios histopatológicos y detección de actividad de ROS, LPO y enzimas antioxidantes.
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Evaluación de la tasa de espermatozoides vivos.
Se hizo una incisión en el epidídimo con tijeras quirúrgicas y se preparó la suspensión de esperma en solución salina normal. Para evaluar la tasa de espermatozoides vivos, se mezclaron cuidadosamente 5 μL de la suspensión de espermatozoides con un volumen igual de tinción de eosina-Y. Luego se contaron los espermatozoides bajo un microscopio óptico. Las tasas de espermatozoides vivos se evaluaron calculando tanto los espermatozoides teñidos (espermatozoides muertos) como los no teñidos (espermatozoides vivos).
Determinación de la actividad de la enzima acrosómica del esperma.
El ensayo de actividad enzimática del acrosoma del esperma se utilizó para evaluar las enzimas del acrosoma del esperma [19]. Los resultados en cada grupo se calcularon utilizando la siguiente fórmula: Actividad de la enzima acrosómica (μUI)=(grupo ODExperiment - grupo ODblank)/(247,5×10) × 106.
Resultados
Efectos de la hipoxia en las células GC-1
Para determinar los efectos de la hipoxia en las células germinales, primero examinamos los cambios en la viabilidad celular después del tratamiento de hipoxia con diferentes concentraciones de oxígeno (20%, 15%, 10% y 5%) durante 1, 3, 5. y 7 días, respectivamente. Los resultados del ensayo CCK-8 mostraron que, en comparación con el grupo de control (concentración de oxígeno del 20%), las células expuestas a la hipoxia mostraron una disminución significativa en la viabilidad (P <0,01; Figura 1A). Además, su tasa de supervivencia fue inversamente proporcional a la concentración de oxígeno y disminuyó aún más con el tiempo de inducción. Para evitar un efecto citotóxico excesivo, se seleccionaron una concentración de oxígeno del 10 % y un tiempo de inducción de 3- días como criterios del modelo hipóxico para experimentos in vitro posteriores.
Posteriormente, se realizaron FCM y tinción de inmunofluorescencia para evaluar más a fondo la alteración de la proliferación de las células GC{{0}} bajo tratamiento de hipoxia. Los resultados mostraron que la hipoxia podría inducir la detención de las células GC-1 en la fase G1, reduciendo así la entrada de las células en la fase S e inhibiendo la replicación del ADN. Por lo tanto, la hipoxia redujo significativamente el índice de proliferación de las células GC-1 (P <0,01; Figura 1B). La tinción positiva con Ki-67 es otro biomarcador específico de células en proliferación. Por lo tanto, también examinamos la proporción de células Ki-67-positivas con o sin tratamiento de hipoxia. En comparación con el grupo de control, el tratamiento con hipoxia redujo notablemente las células Ki-67-positivas, como se muestra en la Figura 1C.
A continuación, nuestro objetivo fue investigar el modo de inhibición de la viabilidad celular GC{{0}} inducida por la hipoxia. Como se informa en la literatura, el nivel de ROS aumentó cuando las ratas fueron expuestas a un ambiente hipóxico hipobárico [8, 20]. Por lo tanto, los niveles de ROS endógenos en células GC-1 se midieron utilizando el ensayo FCM. Los resultados mostraron niveles más altos de ROS en condiciones de hipoxia en comparación con el grupo de oxígeno normal (P <0,01; Figura 1D). La acumulación de ROS causa un marcado deterioro del ADN, lo que a su vez provoca la activación de la vía de apoptosis celular y podría ser el principal factor etiológico del creciente riesgo de infertilidad masculina [21, 22]. A continuación, detectamos el efecto de activación apoptótica de la hipoxia en las células GC-1 mediante tinción con TUNEL. Como se muestra en la Figura 1E, el tratamiento con hipoxia dio como resultado un aumento en la fluorescencia de TUNEL en comparación con el grupo de control, lo que indica un aumento en la apoptosis en el grupo modelo.
Dado que el daño celular inducido por ROS generalmente es causado por OS, probamos más a fondo el OS de las células GC-1. Como se presenta en la Figura 1F, los niveles de LPO de las células GC-1 en el grupo modelo aumentaron notablemente en comparación con los niveles de LPO de las células GC-1 en el grupo de control. Estos hallazgos sugirieron que la lesión de las células GC-1 inducida por hipoxia podría estar relacionada con la OS, que es inducida por la acumulación de ROS.
