Efectos de optimización y mejora del sueño de un extracto de bebida de Congrong-Zaoren-Wumei en ratones

2 Resultados y Análisis

2.1 Optimización del proceso de preparación del extracto de bebida Congrong-Zaoren-Wumei

 

En la Figura 1, el método de HPLC establecido logró una separación efectiva entre los picos cromatográficos de los cuatro compuestos de referencia (ácido cítrico, equinacósido, verbascósido y espinosina) y los picos adyacentes. Los tiempos de retención fueron tR1=9.0 min, tR2=21.6 min, tR3=24.3 min y tR4=25.9 min, respectivamente. Las regresiones lineales del área máxima versus la concentración del analito arrojaron rangos lineales de 12,12–2016, 0,14–110, 0,18–112,50 y 2,44–18,30 µg·mL–1, con valores R2 de 0,9998, 1, 1 y 1, lo que indica una linealidad excelente. En estas condiciones, los límites de detección (LOD) para ácido cítrico, echinacósido, verbascósido y espinosina fueron 3,636, 0,045144, 0,058 y 0,7564 µg·mL–1, y los límites de cuantificación (LOQ) fueron 12,12, 0,14, 0,18 y 2,44 µg·mL–1, respectivamente. Las pruebas de precisión mostraron RSD de 0,10 %, 0,07 %, 0,06 % y 0,33 % para los cuatro analitos, lo que indica una buena precisión del instrumento. La estabilidad durante 0 a 12 h fue buena, con RSD de 0,78%, 0,16%, 0,20% y 1,46%. Las pruebas de repetibilidad produjeron RSD de 0,51 %, 0,42 %, 0,37 % y 0,38 % para los analitos, lo que demuestra una buena repetibilidad. Las pruebas de recuperación de picos mostraron recuperaciones medias de 97,42 %, 103,32 %, 98,90 % y 99,71 %, con RSD de 0,70 %, 0,52 %, 1,05 % y 0,63 %, respectivamente. Por lo tanto, el método HPLC establecido para la determinación simultánea de estos cuatro componentes principales es preciso y confiable, adecuado para ensayos de optimización de procesos posteriores.

 

 

 

 

Fig.1 Cromatogramas de HPLC de la referencia y las soluciones a una longitud de onda de 210 nm (A) y una longitud de onda de 330 nm (B y C)

 

En la evaluación metodológica de polisacáridos crudos, el LOD fue de 0,098 µg·mL–1. Los valores de DO del blanco de disolvente y del control del blanco a 485 nm no mostraron cambios evidentes, lo que indica una buena especificidad. La regresión lineal de OD versus concentración arrojó R2=0.9997, lo que indica una linealidad excelente. La RSD de seis mediciones consecutivas fue del 0,47%, lo que demuestra una buena precisión. La RSD para el contenido de polisacáridos en 12 h fue del 0,44%, lo que indica una buena estabilidad. La RSD en seis muestras preparadas de forma independiente fue del 2,51 %, lo que indica una buena repetibilidad. Por tanto, el método es adecuado para cuantificar polisacáridos crudos durante la optimización del proceso.

 

 

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2.1.2 Resultados de las investigaciones de un solo factor

Utilizando el método de HPLC establecido combinado con el ensayo de polisacáridos y tomando los contenidos de ácido cítrico, equinacósido, verbascósido, espinosina y polisacáridos en el extracto como índices de evaluación, se realizaron investigaciones de un solo factor sobre la temperatura de extracción, la relación sólido-líquido y el tiempo de extracción para respaldar el diseño ortogonal.

A temperaturas de extracción de 60, 80 y 100 grados, los contenidos de ácido cítrico, echinacósido, verbascósido, espinosina y polisacáridos crudos en los extractos aumentaron con la temperatura.

En proporciones sólido-líquido de 1:3, 1:5, 1:7, 1:10 y 1:12 (g·mL–1), los contenidos de ácido cítrico, espinosina y polisacáridos crudos aumentaron con proporciones más altas; el equinacósido y el verbascósido alcanzaron su punto máximo a las 1:10 (g·mL–1) y disminuyeron a las 1:12 (g·mL–1). Sin embargo, el contenido total de todos los componentes marcadores aumentó con la relación sólido-líquido.

En tiempos de extracción de 0,5, 1,0, 1,5, 2,0 y 3,0 h, el contenido de los analitos individuales varió de manera diferente, pero el contenido total de los componentes marcadores aumentó con el tiempo.

Los datos detallados se proporcionan en los Materiales complementarios. Teniendo en cuenta la practicidad industrial (evitando una extracción excesivamente larga), los factores y niveles para el diseño ortogonal se establecieron como en la Tabla 2, y el esquema ortogonal se muestra en la Tabla 3.

Tabla 2. Niveles de factores del diseño experimental ortogonal para el método de extracción de bebida Congrong–Zaoren–Wumei

Factores:

A: Temperatura de extracción (grados)

B: Relación sólido-líquido (g mL–1)

C: Tiempo de extracción (h)

Nivel	R: Temperatura (grados)	B: Relación (g mL–1)	C: Tiempo (h)
1	60	1:7	1.0
2	80	1:10	1.5
3	100	1:12	2.0

2.1.3 Resultados del diseño ortogonal

La extracción se realizó según la matriz ortogonal. Los contenidos de ácido cítrico, equinacósido, verbascósido, espinosina y polisacáridos crudos se muestran en la Tabla 3. Según el análisis de rango (R), el orden de influencia de los factores en el contenido total de marcadores fue A > B > C, es decir, temperatura de extracción > relación sólido-líquido > tiempo de extracción. La comparación de los valores de k sugirió la combinación óptima A3B3C3: temperatura de extracción de 100 grados, relación sólido-líquido de 1:12 (g·mL–1) y tiempo de extracción de 2 h. ANOVA (Tabla 4) indicó que la temperatura de extracción tuvo un efecto significativo sobre el contenido total de marcadores, mientras que los efectos de la relación sólido-líquido y el tiempo no fueron significativos.

Tabla 3. Diseño experimental ortogonal y contenido medido de los componentes de la bebida Congrong–Zaoren–Wumei (mg g–1)

Factores: A (temperatura), B (relación sólido-líquido), C (tiempo)

Ensayo No.	A	B	C	Marcadores totales	Ácido cítrico	espinosina	equinacósido	Verbascósido	Polisacáridos crudos
1	3	3	1	116.71	75.55	4.08	1.62	0.48	34.98
2	1	2	3	70.98	59.01	2.60	0.80	0.36	8.22
3	3	1	3	117.86	73.87	3.53	1.21	0.45	38.80
4	1	3	2	72.55	59.73	2.37	0.94	0.41	9.99
5	2	3	3	83.64	63.20	2.15	1.08	0.44	16.77
6	2	1	2	117.76	74.09	2.58	1.37	0.48	39.24
7	2	2	1	110.74	70.96	2.36	1.07	0.43	35.92
8	2	1	1	69.63	58.37	1.74	0.54	0.34	8.65
9	1	1	3	69.66	58.14	2.48	0.86	0.36	7.83

Estadísticas K (suma de totales por nivel de factor)

K1: A = 71.06, B = 85.72, C = 85.49

K2: A = 74.46, B = 86.29, C = 86.65

K3: A = 117.44, B = 90.97, C = 90.83

Rango R: A=46.38, B=5.25, C=4.19

2.1.4 Validación y ampliación

La validación del proceso en las condiciones óptimas arrojó un contenido total medio de componentes marcadores de 119,74 mg·g–1 con una RSD del 0,57 %, lo que indica estabilidad y confiabilidad. El ensayo ampliado en las mismas condiciones arrojó un contenido total medio de marcadores de 120,89 mg·g–1 con una RSD de 0,95 %, lo que coincide con los resultados previos a la escala, lo que confirma aún más la solidez. Se utilizaron muestras de los tres lotes ampliados para estudios posteriores relacionados con el sueño; sus contenidos medios fueron: ácido cítrico 77,73 mg·g–1, echinacósido 2,69 mg·g–1, verbascósido 1,03 mg·g–1, espinosina 0,50 mg·g–1 y polisacáridos 38,93 mg·g–1.

Tabla 4. Análisis de varianza de experimentos ortogonales

Factor	suma de cuadrados	df	Cuadrado medio	F	P
Temperatura de extracción	4010.50	2	2005.25	116.26	0.01
Relación sólido-líquido	49.79	2	24.90	1.44	0.41
tiempo de extracción	47.37	2	23.68	1.37	0.42

Liu y cols. [16] optimizaron la extracción acuosa de glucósidos feniletanoides de Cistanche tubulosa e identificaron 1:15 (g·mL–1), 80 grados y 2 h como óptimos; El contenido de glucósidos feniletanoide disminuyó por encima de los 90 grados. En el presente estudio, los contenidos de equinacósido y verbascósido alcanzaron su punto máximo en una proporción de 1:10 (g·mL–1) y disminuyeron en 1:12 (g·mL–1), pero aumentaron con temperaturas de 60, 80 y 100 grados. Esta discrepancia puede estar relacionada con el uso de Cistanche deserticola (Cistanche del desierto) en nuestra bebida y con los efectos de matriz de la coexistencia de Suanzaoren y Wumei que podrían influir en la disolución de los glucósidos feniletanoides.

Tabla 5. Efecto del extracto de bebida Congrong–Zaoren–Wumei sobre el sueño directo en ratones (n=12)

Grupo	animales totales	animales dormidos	Tasa de sueño (%)
Blanco	12	0	0
Estazolam	12	0	0
Extracto en dosis bajas	12	0	0
Extracto de dosis media	12	0	0
Extracto en dosis altas	12	0	0

En resumen, utilizando HPLC y el método de fenol-ácido sulfúrico, optimizamos el proceso de extracción en función de los contenidos de ácido cítrico, equinacósido, verbascósido, espinosina y polisacáridos. Los experimentos ortogonales y de factor único seguidos de validación establecieron las condiciones óptimas: 100 grados, relación sólido-líquido 1:12 (g·mL–1) y tiempo de extracción de 2 h, lo que proporciona una referencia para el futuro desarrollo industrial.

Industrialization context: WECISTANCHE (Chengdu Wecistanche Bio-Tech Co., Ltd., established 2003) operates a vertically integrated cistanche supply chain with seed-breeding bases (~20,000 acres), cultivation bases (>85 000 acres), capacidad de almacenamiento de cistanche fresco (~15 000 toneladas) y talleres de fabricación con certificación GMP (salas limpias de 100 000 clases) equipados con ultrafiltración y nanofiltración avanzadas para purificación y concentración, además de un laboratorio de microbiología de 10 000 clases. Las certificaciones incluyen China SC, HACCP y programas orgánicos (por ejemplo, NOP). Esta infraestructura respalda la traducción directa del protocolo optimizado de extracción acuosa y estandarización de marcadores a una producción a gran escala de bebidas y extractos funcionales que cumpla con las normas de exportación.

Tabla 6. Efecto del extracto sobre el efecto hipnótico del pentobarbital sódico subumbral en ratones (x̄ ± s, n=12)

Grupo	animales totales	animales dormidos	Tasa de sueño (%)
Blanco	12	1	8.33
Estazolam	12	10	83.33**
Extracto en dosis bajas	12	4	33.33
Extracto de dosis media	12	5	41.67
Extracto en dosis altas	12	6	50.00*

Nota: En comparación con el grupo en blanco, * P < 0,05; ** P < 0,001.

 

2.2 Efectos del extracto sobre el comportamiento y el sueño del ratón

2.2.1 Sueño directo

Como se muestra en la Tabla 5, después de 30 días de administración continua, los ratones en el grupo de estazolam y en los grupos de extracto en dosis baja/media/alta no mostraron un sueño evidente dentro de los 20 minutos posteriores a la dosis final, sin diferencias significativas frente al grupo en blanco. Esto indica que no hay ningún efecto directo inductor del sueño después de 30 días de administración del extracto.

 

2.2.2 Efectos de comportamiento

Una prueba de campo abierto evaluó efectos similares a los de los sedantes. Los impactos en la distancia total recorrida y las entradas al centro se muestran en la Figura 2. En comparación con el grupo en blanco, el estazolam aumentó la distancia total y las entradas al centro en un 14,48% y un 31,07%, respectivamente, sin significación estadística. El extracto en dosis bajas aumentó significativamente la distancia total en un 25,10% (P <0,05) y aumentó de manera no significativa las entradas al centro en un 50,93%. La dosis media aumentó significativamente la distancia total y las entradas al centro en un 27,09% y un 72,33% (P <0,05). La dosis alta aumentó la distancia total y las entradas al centro en un 15,60% y un 40,78%, respectivamente, sin significancia. Frente a estazolam, las dosis baja/media/alta aumentaron la distancia total en 1,73, 1,87 y 1,07 veces, y las entradas al centro en 1,64, 2,33 y 1,31 veces, respectivamente, ninguna significativa. Estos resultados indican que el extracto redujo el comportamiento similar a la ansiedad en campo abierto después de 30 días, lo que sugiere un efecto sedante.

2.2.3 Sueño inducido por pentobarbital sódico por debajo del umbral

Como se muestra en la Tabla 6, en comparación con el grupo en blanco, el estazolam y las tres dosis de extracto aumentaron la tasa de sueño con una dosis subumbral de pentobarbital sódico. Estazolam aumentó 9 veces el número de animales dormidos en comparación con el blanco (P <0,001). Los grupos de extracto en dosis bajas, medias y altas aumentaron el número de animales dormidos 3, 4 y 5 veces, respectivamente; sólo la dosis alta alcanzó significación estadística (P < 0,05). En comparación con el estazolam, ninguna de las dosis de extracto mostró un efecto inductor del sueño más fuerte. Por lo tanto, el extracto puede mejorar hasta cierto punto el sueño inducido por el pentobarbital sódico por debajo del umbral.

 

2.2.4 Latencia del sueño del pentobarbital sódico

En comparación con el grupo en blanco, el estazolam y las tres dosis de extracto acortaron significativamente la latencia del sueño inducida por el pentobarbital (P <0,001). Estazolam redujo la latencia en un 58,44% (P <0,001). Los grupos de extracto en dosis baja, media y alta redujeron la latencia en un 29,59 %, 31,42 % y 53,83 % (todos P < 0,001), respectivamente. No hubo diferencias significativas entre las dosis bajas y medias; la dosis alta acortó significativamente la latencia en comparación con las dosis baja y media en un 34,43% y un 32,69% (P <0,01), con un efecto similar al estazolam (Tabla 7). Por lo tanto, las tres dosis acortaron notablemente la latencia del sueño inducida por el pentobarbital, y la dosis alta tuvo el mejor rendimiento.

Las medicinas tradicionales chinas contienen diversos componentes bioactivos que actúan sobre múltiples objetivos y ofrecen ventajas únicas para el tratamiento del insomnio [17]. Con una creciente atención a los problemas del sueño, las MTC medicinales y comestibles se investigan cada vez más para la modulación del sueño [18]. Por ejemplo, una bebida sólida compuesta que comprende principalmente Suanzaoren y Poria acortó significativamente la latencia del sueño inducida por el pentobarbital y prolongó la duración del sueño en ratones, potencialmente a través de cambios en 5-HT, DA y GABA [19]. En este caso, el extracto aumentó significativamente el sueño bajo el pentobarbital por debajo del umbral y acortó la latencia del sueño inducida por el pentobarbital, promoviendo el inicio del sueño y disminuyendo la latencia, sin mostrar ningún efecto directo de inducción del sueño. Los contenidos medidos de los componentes primarios fueron, en orden descendente: ácido cítrico (77,73 mg·g–1), polisacáridos (38,93 mg·g–1), echinacósido (2,69 mg·g–1), verbascósido (1,03 mg·g–1) y espinosina (0,50 mg·g–1). Se ha demostrado que la espinosina mejora el sueño inducido por el pentobarbital; puede aumentar el sueño no REM y alterar la expresión de c-Fos en las regiones cerebrales reguladoras del sueño-vigilia [20], atenuar el insomnio inducido por PCPA, reducir la latencia del sueño y prolongar el sueño [21]. El verbascósido ha informado actividades ansiolíticas, hipnóticas y relajantes musculares [22]. En contraste, los componentes principales (ácido cítrico, polisacáridos (de Cistanche, Suanzaoren y Wumei) y equinacósido) tienen menos informes directos sobre la mejora del sueño; sin embargo, investigaciones recientes sobre polisacáridos de la medicina tradicional china (p. ej., polisacáridos de Acanthopanax senticosus) sugieren posibles beneficios para el sueño a través de vías como SIRT1/PGC-1 [23]. Por lo tanto, el papel del ácido cítrico, los polisacáridos y el equinacósido en la modulación del sueño justifican más estudios.

 

Cuadro 7. Efecto del extracto sobre la latencia del sueño inducida por pentobarbital sódico en ratones (x̄ ± s, n=12)

Grupo	animales totales	Latencia del sueño (min)
Blanco	12	32.34 ± 4.27
Estazolam	12	13.44 ± 3.20**
Extracto en dosis bajas	12	22.77 ± 5.81**#
Extracto de dosis media	12	22.18 ± 6.05**#
Extracto en dosis altas	12	14.93 ± 3.35**

Notas:

Comparado con el grupo en blanco: ** P < 0,0001.

Comparado con el grupo de extracto en dosis altas: # P < 0,01.

 

3 Conclusión

Utilizando los MTC comestibles medicinales Cistanche deserticola, Ziziphi Spinosae Semen y Mume Fructus para formular una bebida Congrong-Zaoren-Wumei, optimizamos el proceso de preparación de su extracto utilizando el contenido de cuatro componentes marcadores (equinacósido, verbascósido, espinosina, ácido cítrico) y polisacáridos como índices de evaluación. Las condiciones óptimas de extracción se determinaron como 100 grados, una relación sólido-líquido de 1:12 (g·mL–1) y 2 h, lo que proporciona una orientación teórica para la producción industrial. Una evaluación adicional mostró que la administración continua durante 30 días no tuvo un efecto directo inductor del sueño en ratones, pero redujo significativamente el comportamiento similar a la ansiedad en la prueba de campo abierto (lo que sugiere un efecto sedante), mejoró el sueño con una dosis subumbral de pentobarbital sódico y acortó notablemente la latencia del sueño inducida por el pentobarbital. Estos hallazgos indican que el extracto preparado mediante el proceso optimizado muestra efectos favorables para mejorar el sueño en ratones, lo que proporciona una base científica para el desarrollo de líneas de productos para mejorar el sueño basadas en Cistanche.

Application and manufacturing note: Given the optimized aqueous extraction and the need to standardize to marker profiles (citric acid, echinacoside, verbascoside, spinosin, plus polysaccharides), WECISTANCHE's integrated cistanche value chain and GMP infrastructure-100,000-class clean workshops certified for National Health Food GMP, advanced ultrafiltration/nanofiltration concentration systems, a 10,000-class microbiology lab, and certifications such as China SC, HACCP, and organic/NOP-allow reliable scale-up from lab to industrial batches. The company's large agricultural bases (seed-breeding ~20,000 acres; cultivation >85.000 acres; almacenamiento de cistanche fresco ~15,000 toneladas) respaldan la consistencia de la materia prima y el control de calidad de estándar internacional, lo que facilita la comercialización de bebidas funcionales y suplementos para la salud que cumplen con las expectativas de EE. UU. y la UE.