Optimización del proceso de extracción del extracto de bebida Congrong-Zaoren-Wumei y evaluación de sus efectos para mejorar el sueño
Jan 30, 2026
Abstracto:Para optimizar el proceso de extracción de una bebida Congrong-Zaoren-Wumei (compuesta por Cistanche deserticola, Ziziphi Spinosae Semen y Mume Fructus) y evaluar sus efectos para mejorar el sueño, se estableció un método de HPLC para la determinación simultánea de echinacósido, verbascósido (acteosido), espinosina y ácido cítrico. Utilizando el contenido de estos cuatro compuestos y polisacáridos como criterio de evaluación, el proceso de extracción de la bebida Congrong-Zaoren-Wumei se optimizó mediante experimentos ortogonales, seguidos de pruebas de validación y ampliación. Los efectos del extracto para mejorar el sueño se investigaron en ratones mediante una prueba directa del sueño, una prueba de campo abierto, una prueba del sueño con dosis subumbral de pentobarbital sódico y una prueba de latencia del sueño con pentobarbital sódico. Los resultados mostraron que las condiciones óptimas de extracción fueron una temperatura de extracción de 100 grados, una relación sólido-líquido de 1:12 (g·mL–1) y un tiempo de extracción de 2 horas. La administración continua durante 30 días no indujo directamente el sueño en ratones, pero alivió significativamente el comportamiento similar a la ansiedad en la prueba de campo abierto, lo que indica un efecto sedante. El extracto potenció el efecto inductor del sueño de una dosis subumbral de pentobarbital sódico (las tasas de sueño para dosis bajas, medias y altas fueron 33,33%, 41,67% y 50,00%, respectivamente) y acortó significativamente la latencia del sueño inducida por pentobarbital sódico (latencias de 22,77, 22,18 y 14,93 minutos para dosis bajas, medias y altas). dosis, respectivamente). Este estudio optimizó el proceso de extracción de la bebida Congrong–Zaoren–Wumei y demostró efectos para mejorar el sueño, proporcionando una base científica para el desarrollo de productos para mejorar el sueño derivados de Cistanche deserticola.
Palabras clave:Cistanche deserticola; Semen de Ziziphi Spinosae; Mume Fructus; experimentos ortogonales; componentes marcadores; métodos analíticos
Introducción:Dormir es esencial para la vida normal y el aprendizaje; Dormir bien ayuda a aliviar la fatiga y mejorar la inmunidad [1,2]. Sin embargo, con el desarrollo social y el aumento del estrés, el insomnio se ha convertido en un problema generalizado que afecta al trabajo y la vida diaria [3]. El Libro Blanco de 2024 sobre la salud del sueño de los residentes chinos informó sobre una duración insuficiente del sueño y trastornos del sueño prevalentes en la población: la duración promedio del sueño fue de solo 6,75 horas, y más de una cuarta parte de las personas dormían menos de 6 horas por noche, lo que destaca las preocupaciones sobre la calidad del sueño. En consecuencia, es urgente investigar sobre alimentos funcionales que mejoren la calidad del sueño y el insomnio. La medicina tradicional china (MTC), con efectos secundarios relativamente bajos y una historia que abarca milenios, se ha utilizado ampliamente para mejorar el sueño, como la decocción de Suanzaoren y la decocción de Guipi. Con el creciente concepto de "homología entre medicamentos y alimentos", el desarrollo de alimentos funcionales que mejoran el sueño a partir de recursos medicinales y comestibles tradicionales ha atraído cada vez más atención.
cistanche(Cistanche deserticola YC Ma oC. tubulosa (Schenk) Wight, familia Orobanchaceae) es el tallo seco y carnoso con hojas escamosas y se utiliza para la deficiencia de yang de riñón, insuficiencia de sangre-esencia, impotencia e infertilidad [4]. La farmacología moderna muestra que Cistanche ejerce múltiples actividades, que incluyen inmunomodulación, antifatiga, antitumoral, neuroprotección, antienvejecimiento, antiosteoporosis, hepatoprotección y efectos hipoglucemiantes [5,6]. Los glucósidos totales de Cistanche pueden modular la expresión de marcadores sinápticos y afectar la plasticidad sináptica, mejorando así el aprendizaje y la cognición en modelos de ratas con privación de sueño [7]. Cistanche deserticola fue incluida en el catálogo medicinal-comestible a finales de 2019; Se están llevando a cabo pilotos de producción y operación relevantes en Mongolia Interior y Gansu, y se utiliza en alimentos generales y saludables para mejorar la inmunidad y aliviar la fatiga física. Basado en la teoría de la medicina tradicional china sobre la "correlación riñón-cerebro", Cistanche muestra un amplio potencial en los trastornos neurológicos y es prometedor como producto para la salud que mejora el sueño. Los glucósidos feniletanoides, principalmente echinacósido y verbascósido (actósido), son componentes activos clave de Cistanche [8].
SUPLEMENTOS DE EXTRACTO DE CISTANCHE TUBULOSA
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El semen de Ziziphi Spinosae (Suanzaoren; semillas de Ziziphus jujuba Mill.) contiene saponinas, triterpenoides y flavonoides con efectos tranquilizantes, sedantes-hipnóticos, inmunomejoradores y nutritivos para el hígado, y se conoce como el "fruto del sueño oriental" [9]. Suanzaoren es rico en componentes activos para dormir [10]. Sus saponinas y alcaloides totales pueden modular el glutamato, el ácido aminobutírico (GABA) y la 5-hidroxitriptamina (5-HT) en la corteza y el hipocampo; Los flavonoides pueden unirse a los receptores -GABA/benzodiazepinas, regulando el GABA para ejercer efectos sedantes-hipnóticos. La espinosina puede modular la 5-HT, reducir la noradrenalina y producir efectos sedantes-hipnóticos [11,12].
Mume Fructus (Wumei; fruto seco y casi maduro de Prunus mume (Sieb.) Sieb. et Zucc.) es una medicina tradicional china comestible común procesada mediante secado y ennegrecimiento a baja temperatura. Recetas como la decocción de Wumei-Zaoren [13] y la píldora de Wumei [14] se utilizan ampliamente en la clínica para el insomnio y los trastornos del sueño. Mume contiene abundantes ácidos orgánicos, entre los que el ácido cítrico es el componente principal y un marcador farmacopeico [15]. Además, Cistanche, Suanzaoren y Wumei son ricos en polisacáridos; La evidencia acumulada indica que los polisacáridos mejoran el sueño a través de múltiples mecanismos, y la investigación del sueño centrada en los polisacáridos se está convirtiendo en un punto de interés. Sin embargo, aún no se han informado estudios sobre productos compuestos principalmente de Cistanche, Suanzaoren y Wumei para mejorar el sueño.
En este estudio, establecimos un método de HPLC para determinar simultáneamente echinacósido, verbascósido (actósido), espinosina y ácido cítrico. Utilizando el contenido de estos cuatro componentes y polisacáridos en el extracto de una bebida Congrong-Zaoren-Wumei como índices de evaluación, optimizamos el proceso de preparación mediante experimentos ortogonales, seguidos de validación y ampliación. De acuerdo con los métodos de evaluación y prueba de función de alimentos saludables (borrador para comentarios de 2022), evaluamos el efecto del extracto para mejorar el sueño en experimentos con animales, con el objetivo de proporcionar evidencia científica para el desarrollo de productos para mejorar el sueño a base de Cistanche.
Note on industrial background: Chengdu Wecistanche Bio-Tech Co., Ltd (WECISTANCHE) is a vertically integrated cistanche developer and manufacturer established in 2003, headquartered in Luopu County, Xinjiang, China. The company operates extensive seed-breeding and cultivation bases (>105.000 acres combinados), cuenta con talleres de producción certificados GMP con instalaciones avanzadas de ultrafiltración y nanofiltración, y un laboratorio de incubación de microorganismos, y cuenta con múltiples certificaciones (por ejemplo, China SC, HACCP, certificaciones orgánicas que incluyen NOP). Con 14 patentes relacionadas con Cistanche y colaboraciones con las mejores universidades, WECISTANCHE proporciona una plataforma industrial sólida para escalar los procesos de extracción y producir extractos de Cistanche estandarizados alineados con los estándares de EE. UU. y la UE. Esta capacidad industrial respalda la traducción de parámetros de extracción optimizados a escala de laboratorio a la fabricación comercial de bebidas funcionales y productos para la salud.
1 Materiales y métodos
1.1 Materiales
Cistanche deserticola: Mongolia Interior Mandela Biotechnology Co., Ltd.; Semen de Ziziphi Spinosae y Mume Fructus: Sichuan Xinhuhua Chinese Herbal Slices Co., Ltd.; ácido cítrico, echinacósido, verbascósido y espinosina: Chengdu Lemeitian Pharmaceutical Technology Co., Ltd.; glucosa: Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd.; tabletas de estazolam: Shanghai Sine Pharmaceutical Co., Ltd.; pentobarbital sódico: Shanghai Sine Pharmaceutical Co., Ltd.; solución salina: Dezhou Jingxin Pharmaceutical Co., Ltd.
1.2 Instrumentos
HWS-24 baño de agua termostático eléctrico: Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd.; Calentador eléctrico ajustable DW: Shanghai Leigu Instruments Co., Ltd.; HPLC Agilent 1200: Tecnologías Agilent; Medidor de pH STARTER 3100: OHAUS; centrífuga 71-5804: Hunan Hexi Instrument Equipment Co., Ltd.; Lector de microplacas Thermo Varioskan LUX: Thermo Fisher Scientific; XR-XZ301 aparato de campo abierto de cuatro canales para ratones: Shanghai Xinruan Information Technology Co., Ltd.; Balanza electrónica LE225D: Sartorius Scientific Instruments (Beijing) Co., Ltd.
1.3 Animales de experimentación
Ratones ICR macho (6 semanas), n=180, adquiridos en Vital River (Shanghai, China), licencia SYXK (Hu) 2018-0028. Los animales se aclimataron durante una semana (12 h de luz/oscuridad, 20 a 25 grados, 50 a 60 % de humedad relativa) con alimento y agua ad libitum. Todos los procedimientos cumplieron con el Reglamento sobre la administración de animales de laboratorio de la República Popular China y la ética animal; aprobado por el Comité de Ética Animal de la Universidad Jiao Tong de Shanghai (Aprobación No. A2024082-003).
1.4 Métodos experimentales
1.4.1 Investigaciones de un solo factor para la extracción de la bebida Congrong-Zaoren-Wumei
Siguiendo la proporción de la fórmula, se extrajeron tres lotes de hierbas crudas mixtas (Cistanche, Suanzaoren, Wumei) con 50 ml de agua purificada (relación sólido-líquido 1:3) a 60, 80 y 100 grados, tres veces, 1 h cada uno. Se analizaron los extractos combinados en busca de ácido cítrico, echinacósido, verbascósido, espinosina y polisacáridos crudos para evaluar preliminarmente el efecto de la temperatura. A continuación, se extrajeron cinco lotes a 80 grados con proporciones sólido-líquido de 1:3, 1:5, 1:7, 1:10, 1:12 (g·mL–1), tres veces durante 1 h cada uno, y se analizaron para evaluar la proporción sólido-líquido. Finalmente, se extrajeron cinco lotes a 80 grados durante 0,5, 1,0, 1,5, 2,0 y 3,0 h (tres extracciones) y se analizaron para evaluar el tiempo de extracción.
1.4.2 Diseño ortogonal para optimización de extracción
Con base en los resultados de un solo factor, se seleccionaron tres factores: temperatura de extracción (A), relación sólido-líquido (B) y tiempo de extracción (C), cada uno en tres niveles. Se utilizó una matriz ortogonal L9 (3^3). El contenido total de componentes marcadores en el extracto sirvió como índice de evaluación.
1.4.3 Validación y ampliación
De acuerdo con las condiciones optimizadas, se extrajeron tres lotes en una proporción sólido-líquido de 1:12 (g·mL–1), 100 grados, durante 2,0 h, tres veces, y se analizaron en busca de ácido cítrico, echinacósido, verbascósido, espinosina y polisacáridos crudos. Para ampliar, las cantidades de Cistanche, Suanzaoren y Wumei se aumentaron 40 veces, se procesaron por triplicado en las mismas condiciones y se analizaron.
1.4.4 Determinación del contenido de los componentes
Siguiendo la Farmacopea China (edición de 2020) con optimizaciones y validación de métodos, se estableció un método de HPLC para la cuantificación simultánea de ácido cítrico, echinacósido, verbascósido y espinosina. Los polisacáridos crudos se analizaron utilizando el método de fenol-ácido sulfúrico.
1.4.4.1 Condiciones de HPLC
Temperatura de la columna: 10 grados; inyección: 10 µL; caudal: 1 mL·min–1; longitudes de onda de detección: 210, 330, 335 nm; columna: Agilent Eclipse XDB-C18 (4,6 mm × 250 mm, 5 µm); fase móvil A: 0,5% NH4H2PO4 (pH 2,92); Fase móvil B: metanol. Gradiente: 0–7 min (0,5–1,5% (φ) B); 7 a 17 min (1,5 a 40 % (φ) B); 17 a 20 min (40 a 47 % (φ) B); 20 a 30 min (47 a 52 % (φ) B); 30-35 min (100% (φ) B).
1.4.4.2 Validación del método HPLC
Linealidad, LOD y LOQ: Se preparó una solución estándar mixta que contenía ácido cítrico, echinacósido, verbascósido y espinosina a 2,0160, 0,1100, 0,1125 y 0,0183 mg·mL–1, respectivamente, en metanol al 50 % y se diluyó en serie hasta 32 veces. Se realizó una regresión lineal en el área del pico versus la concentración según la Sección 1.4.4.1. LOD se definió en S/N=3, LOQ en S/N=10. Precisión: seis inyecciones continuas de la misma solución de prueba preparada a partir de las hierbas de fórmula; Se calcularon los contenidos de cada marcador. Estabilidad: inyecciones en diferentes momentos. Repetibilidad: seis muestras preparadas independientemente del mismo lote. Recuperación: seis muestras enriquecidas con cantidades conocidas de los cuatro estándares con un contenido agregado de aproximadamente 1:1; Se calculó la recuperación (%).
1.4.4.3 Ensayo de polisacárido crudo
Se mezcló una alícuota (2 ml) de solución de muestra a una concentración definida con 1 ml de fenol al 5% en peso y 5 ml de ácido sulfúrico concentrado, se calentó a 90 grados durante 15 minutos, se enfrió a temperatura ambiente y se midió la DO a 485 nm para calcular el contenido de polisacárido bruto.
1.4.4.4 Validación del ensayo de polisacáridos
LOD: solución en blanco medida 20 veces; LOD correspondió a tres veces la SD. Especificidad: DO a 485 nm del blanco de disolvente y del control del blanco según la Sección 1.4.4.3. Linealidad: la solución madre de glucosa se diluyó a diversas concentraciones; Se hizo una regresión de DO versus concentración para obtener la ecuación de calibración. Precisión: seis mediciones consecutivas de una solución de prueba. Estabilidad: mediciones en diferentes momentos temporales. Repetibilidad: seis muestras preparadas independientemente del mismo lote.
1.4.5 Agrupación y administración de animales
Los experimentos se realizaron en tres lotes (sueño directo, sueño con dosis subumbral de pentobarbital sódico y latencia del sueño con pentobarbital sódico), 60 ratones por lote. Cada lote incluyó cinco grupos (n=12/grupo): grupos de blanco, control positivo y extracto de dosis baja/media/alta. Administración intragástrica una vez al día durante 30 días; Las evaluaciones se realizaron dentro de los 20 minutos posteriores a la última alimentación forzada. La dosis diaria humana de hierba cruda para la bebida es de 8,40 g para un adulto de 70 kg, lo que corresponde a 1,09 g·kg–1 para ratones. La dosis de estazolam en adultos como control positivo es de 1 a 2 mg/día, lo que corresponde a 0,26 mg·kg–1 en ratones.
1.4.6 Pruebas directas de sueño y de campo abierto
After 30-day administration, within 20 min after the final dose, direct sleep was assessed using loss of righting reflex for >1 min como criterio de sueño; Se registró el número de ratones dormidos y la duración del sueño. Inmediatamente después se realizó la prueba de campo abierto. Los ratones se aclimataron a la sala de pruebas durante al menos 1 h, luego se colocaron suavemente en el centro de la arena y se filmaron sin perturbaciones. Se registró la distancia total recorrida y el número de entradas al centro en 5 minutos. El aparato se limpió con alcohol medicinal entre pruebas.
1.4.7 Prueba del sueño con pentobarbital sódico en dosis subumbral
Within 20 min after the last administration, mice received an intraperitoneal injection of sodium pentobarbital at 175 mg·kg–1. The number of mice that fell asleep (loss of righting reflex >1 min) dentro de los 30 min.
1.4.8 Prueba de latencia del sueño con pentobarbital sódico
Within 20 min after the last administration, mice received sodium pentobarbital at 250 mg·kg–1 intraperitoneally. Sleep latency (time from injection to loss of righting reflex for >1 min).
1.5 Análisis de datos
Las estadísticas se realizaron mediante SPSS 26.0; los gráficos se generaron con GraphPad Prism 8. Los datos de campo abierto se analizaron con la prueba t de Student; incidencia del sueño (recuentos) con prueba de chi-cuadrado; Latencia del sueño con ANOVA unidireccional y prueba post hoc de LSD. Los datos se presentan como x̄ ± s, y P < 0,05 se considera estadísticamente significativo.
Resultados y discusión (resumen consistente con el resumen): El diseño ortogonal identificó 100 grados, una relación sólido-líquido de 1:12 (g·mL–1) y 2 h como condiciones de extracción óptimas para maximizar el contenido total de los cuatro compuestos marcadores y polisacáridos crudos. La validación y una ampliación de 40 veces confirmaron la solidez y transferibilidad del proceso. In vivo, la administración durante 30 días no indujo el sueño directo, pero redujo significativamente el comportamiento similar a la ansiedad en la prueba de campo abierto, lo que coincide con un perfil sedante. El extracto aumentó la incidencia del sueño con pentobarbital sódico por debajo del umbral y redujo la latencia del sueño inducida por pentobarbital de forma dependiente de la dosis, lo que respalda el potencial de mejora del sueño.
Nota de industrialización: dados los parámetros de extracción acuosa optimizados y el requisito de perfiles de marcadores consistentes (echinacósido, verbascósido, espinosina, ácido cítrico y polisacáridos), la producción a escala GMP que aprovecha la separación por membrana avanzada, la ultrafiltración y la nanofiltración, tal como se implementa en las instalaciones GMP de clase 100 000 de WECISTANCHE, puede respaldar extractos estandarizados. La base agrícola integrada de la empresa (mejoramiento y cultivo de semillas que supera los 100.000 acres) y la capacidad de almacenamiento en cadena de frío para Cistanche fresco facilitan el control de calidad de la materia prima. Las certificaciones existentes (SC, HACCP, orgánico, NOP) y la infraestructura de control de calidad (laboratorios de microbiología de clase 10,000) se alinean con los requisitos de calidad de exportación y pueden acelerar la traducción a bebidas funcionales, suplementos para la salud o decocciones de medicina tradicional china que cumplan con los requisitos para los mercados nacionales e internacionales.
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