Construcción de nuevas vacunas quiméricas termoestables candidatas para el virus de la enfermedad de Newcastle del genotipo VII

Abstracto: El virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) de genotipo VII ha provocado una pandemia en muchos países y suele provocar consecuencias mortales en los pollos infectados. Aunque las vacunas comerciales atenuadas actuales contra el NDV pueden proporcionar una protección ideal contra el genotipo VII del NDV, no pueden prevenir completamente la infección y la diseminación viral, y el genotipo de algunas cepas vacunales no puede coincidir con la cepa prevalente. En este estudio, para construir una vacuna viva atenuada termoestable y compatible con el genotipo VII, utilizamos una cepa HR09 virulenta termoestable del genotipo VIII como columna vertebral y reemplazamos su gen F con el de la cepa DT-2014 del genotipo VII. Mientras tanto, el sitio de escisión del gen F de DT-2014 se mutó al de la proteína de clase IF y a la proteína F avirulenta de clase II, respectivamente. Los resultados mostraron que los dos virus quiméricos, denominados rcHR09-CI y rcHR09-CII, compartían una cinética de crecimiento y termoestabilidad similares con su cepa parental HR09. Las pruebas del tiempo medio de muerte (MDT) y del índice de patogenicidad intracerebral (ICPI) mostraron que los dos virus quiméricos estaban muy atenuados. Aunque tanto los NDV quiméricos como la cepa vacunal La Sota podrían brindar protección completa a los pollos inmunizados contra el desafío de la cepa virulenta ZJ1 del genotipo VII, los dos NDV quiméricos podrían inducir un mayor nivel de respuesta de anticuerpos contra la cepa ZJ1 y podrían reducir significativamente la eliminación viral en comparación con Cepa vacunal La Sota. En conclusión, nuestro estudio construyó dos candidatos a vacunas quiméricas termoestables contra el genotipo VII del NDV, que proporcionaron protección completa contra el desafío del virulento genotipo VII del NDV.

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Palabras clave: Virus de la Enfermedad de Newcastle; termoestabilidad; virus quimérico compatible con el genotipo VII; proteína F; eficiencia de protección; diseminación viral

1. Introducción

El virus de la enfermedad de Newcastle (NDV), el agente causante de la enfermedad de Newcastle (ND), pertenece al género Orthoavulavirus en la subfamilia Avulavirinae de la familia Paramyxoviridae [1]. El NDV tiene un genoma de ARN monocatenario de sentido negativo, que codifica nucleoproteína (N), fosfoproteína (P), proteína de matriz (M), proteína de fusión (F), proteína hemaglutinina-neuraminidasa (HN) y proteína grande (L). ) [2]. Según la evolución de las cepas del NDV, el NDV se puede dividir en dos clases: una son los virus de clase I, con un tamaño de genoma de 15.198 nucleótidos; otro son los virus de clase II, con un tamaño de genoma de 15.186 o 15.192 [3]. Según su patogenicidad, el VEN se ha clasificado en tres patotipos: lentogénico, mesogénico y velogénico [4]. El NDV se puede clasificar en dos clases: uno es el NDV de clase I, que se aísla principalmente de aves silvestres y siempre es avirulento para los pollos. El otro es el NDV de clase II, que se ha encontrado en aves domésticas y silvestres, incluidas cepas tanto virulentas como avirulentas [1,5,6]. La proteína F del NDV se sintetiza primero como un precursor inactivo, F0, que luego se escinde en dos subunidades activas F1 y F2 mediante la proteasa celular del huésped [7]. La proteína F activa puede mediar en la fusión de membranas virales y celulares [8]. Los investigadores han descubierto que el motivo del sitio de escisión de la proteína F también es un indicador de la virulencia del NDV. Se informó que la cepa de virulencia para pollos mostró un motivo de sitio de escisión de 112R/KR-QK/RR↓F 117, mientras que los NDV de baja virulencia tienen el motivo de 112G/EK/R-QG/ER↓L 117 en la misma región. [9,10]. Por lo tanto, alterar el motivo del sitio de escisión de la proteína F es una forma eficaz de atenuar el virulento NDV [11, 12]. A pesar de su importante papel en la virulencia del NDV, la proteína F también contribuye de manera importante a la inmunidad protectora de las vacunas con genotipo compatible [13]. La vacuna contra el virus termoestable puede facilitar su almacenamiento y transporte, especialmente en algunos distritos remotos donde no se dispone de transporte en cadena de frío. Anteriormente, se aisló en nuestro laboratorio una cepa natural termoestable de NDV, denominada HR09, que podía mantenerse infecciosa durante más de una hora bajo un tratamiento a 56 ◦C [14]. Posteriormente, utilizando un sistema genético inverso, se descubrió que los residuos 315 y 369 en la proteína HN eran responsables de su capacidad de resistencia al calor [15]. Como HR09 es una cepa virulenta, mutamos su sitio de escisión de la proteína F de 112RRQKR↓F 117 a un motivo avirulento 112GRQGR↓L 117 usando un sistema genético inverso y descubrimos que el virus recombinante rHR09 podría proporcionar una protección completa contra el desafío del genotipo VII. Cepa virulenta del NDV [16]. Además, el HR09 atenuado se utilizó además como vector de vacuna para expresar el gen HA del virus de la influenza aviar (AIV) del subtipo H9N2, que también proporcionó una protección ideal contra el desafío del AIV H9N2 [17]. En este estudio, para construir una vacuna atenuada de NDV termoestable y compatible con el genotipo VII, utilizamos una cepa HR09 virulenta de NDV de genotipo VIII termoestable como columna vertebral y reemplazamos su gen F con el de la cepa DT-2014 de genotipo VII. Mientras tanto, el sitio de escisión del gen F de DT-2014 se mutó al de la proteína F del NDV de clase I y a la proteína F del NDV de clase II avirulenta, respectivamente. Los resultados mostraron que los dos virus quiméricos compartían una cinética de crecimiento y termoestabilidad similares con el HR09. Además, las pruebas del tiempo medio de muerte (MDT) y del índice de patogenicidad intracerebral (ICPI) mostraron que los dos virus quiméricos pertenecían a una cepa avirulenta. Ambos podrían inducir un alto nivel de respuesta de anticuerpos contra ellos mismos y la cepa ZJ1 del genotipo VII en pollos inmunizados, podrían disminuir significativamente la eliminación viral y proporcionar protección total contra los infectados con la cepa ZJ1. En conclusión, nuestro estudio proporciona dos candidatos a vacunas quiméricas termoestables para el genotipo VII del NDV.

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2. Materiales y métodos

2.1. Células y virus

Se cultivan células BSR-T7/5, una línea celular selectiva de células BHK que pueden expresar la ARN polimerasa T7, con medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Gibco) suplementado con 15% de suero fetal bovino (Pan Biotech, Alemania) y 1% de suero bovino fetal (Pan Biotech, Alemania) y 1% de suero fetal bovino. penicilina-estreptomicina (Thermo Fisher Scientific, Waltham, EE. UU.) a 37 ◦C en la incubadora con 5% de CO2. Los huevos de gallina embrionados libres de patógenos específicos (SPF), que pueden usarse para la propagación del NDV, se compran en Beijing Boehringer Ingelheim Vital Biotechnology Co., Ltd. Cepa termoestable del NDV HR09 del genotipo VIII (MF285077.1) y cepa del genotipo VII ZJ1. están almacenados en nuestro laboratorio.

2.2. Construcción de plásmidos

El plásmido, denominado pNDV/rHR09, se construyó clonando la secuencia completa del genoma del genotipo VIII HR09 con la mutación en la proteína F en el vector TVT7R (0,0) [16]. Se amplificó el gen F de la cepa DT-2014 del genotipo VII, que tenía una alta similitud con las cepas prevalentes del NDV del genotipo VII, y las mutaciones de sus sitios de escisión se generaron mediante mutagénesis dirigida al sitio. Luego, el gen F en pNDV/rHR09 fue reemplazado por el gen DT-2014 F mutado. Todas las secuencias de cebadores utilizadas en el estudio están disponibles previa solicitud.

2.3. Rescate del virus recombinante

En este estudio, se rescataron dos candidatos a vacunas quiméricas contra el NDV como se describió anteriormente [18]. Los procedimientos principales se describen a continuación: en primer lugar, los plásmidos de NDV de longitud completa que contenían los sitios de escisión del gen F mutado de NDV DT-2014, denominados pNDV/rcHR09-CI y pNDV/rcHR{{4} }CII, se transfectaron con los tres plásmidos auxiliares pCI-NP, pCI-P y pCI-L utilizando el reactivo Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.) según las instrucciones del fabricante. En segundo lugar, los líquidos alantoideos de huevos de gallina embrionados con SPF se agregaron a las 12 h y 36 h después de la transfección, respectivamente. En tercer lugar, los lisados ​​​​de células completas se recogieron 72 h después de la transfección y se congelaron/descongelaron tres veces. Finalmente, los lisados ​​celulares se inyectaron en huevos de gallina embrionados con SPF de 10- días de edad durante 3 a 5 días, y los fluidos alantoideos se recogieron y se sometieron a un ensayo de HA para determinar la existencia de NDV quiméricos rescatados.

2.4. RT-PCR y QRT-PCR

El ARN se extrajo utilizando el reactivo TRIzol (Merck, Darmstadt, Alemania) de los fluidos alantoideos recolectados de huevos de gallina embrionados infectados y luego se transcribió de manera inversa en ADNc utilizando el kit de síntesis de ADNc de primera hebra PrimeScript™ (Takara, Beijing, China). La longitud completa de la secuencia del genoma del NDV rescatada se amplificó utilizando 10-par de cebadores (disponibles previa solicitud). Los niveles de eliminación de virus se cuantificaron mediante RT-PCR cuantitativa absoluta en tiempo real utilizando un instrumento Life Technology. Brevemente, las muestras de hisopo cloacal y traqueal se recolectaron 3- y 5- días después de la exposición (dpc), luego se extrajo el ARN, se transcribió de manera inversa a ADNc y se sometió a una PCR cuantitativa en tiempo real. (QRT-PCR) para la cuantificación de la eliminación viral. La cantidad de eliminación viral se calculó como la media ± DE del nivel de ARNm de todos los hisopos recolectados. Las secuencias del cebador y de la sonda utilizadas en la detección de la diseminación viral están disponibles previa solicitud.

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2.5. Curva de crecimiento viral

La cinética de crecimiento de diferentes NDV se midió en huevos de gallina embrionados de 10-días de edad. Brevemente, los NDV se diluyeron y se inyectaron en huevos de gallina embrionados de 10-días de edad mediante inoculación alantoidea. El líquido alantoideo se recogió a las 24-, 48-, 72- y 96- h después de la infección. La EID50 de cada muestra se calculó utilizando el método de Reed y Muench [19].

2.6. Prueba de termoestabilidad

La termoestabilidad de cada virus se midió como se describió anteriormente [18]. Brevemente, cada virus con título de 108 EID50 a 0,1 ml por vial se sometió a un baño de agua a 56 ◦C, luego las muestras se recolectaron en 10-, 20-, {{ 8}}, 40-,50- y 60-min después de la incubación. Finalmente, se midió el título del virus mediante el método EID50.

2.7. Determinación de virulencia y estabilidad.

La virulencia de cada virus se evaluó aplicando la prueba del tiempo medio de muerte (MDT) en huevos de gallina embrionados SPF de 10-días como se describió anteriormente [20,21]. Brevemente, el líquido alantoideo recolectado de cada cepa quimérica de NDV se diluyó de 10-6 a 10-9 en series de 10- veces y se inyectó en huevos de gallina embrionados SPF de 10- días de edad, con 5 por grupo. con 100 L de cada dilución. Luego, los huevos de gallina embrionados desafiados se incubaron a 37 ◦C y se colocaron al trasluz durante un total de 7 días. Se registró la muerte de cada grupo y se calculó el valor de MDT. Además, también se midió la prueba ICPI en pollos SPF de 1-días de edad para comprobar la virulencia del virus quimérico. Brevemente, el virus quimérico se diluyó en una serie de 10- veces usando PBS y se inyectó en huevos de gallina embrionados con SPF de 1- días de edad. Los huevos incubados se traslucieron durante un total de 8 días y se calculó el valor ICPI. Para evaluar la estabilidad de los dos NDV quiméricos, se propagaron en huevos de gallina embrionados SPF de 10- días de edad mediante inoculación alantoidea durante un total de 20 pases, luego se midieron los valores de MDT e ICPI de pases seleccionados.

2.8. Inmunización y desafío de pollos

Un total de pollos SPF de 48 8-días de edad se dividieron aleatoriamente en cuatro grupos, y tres grupos fueron inoculados con 106 EID50 de rcHR09-CI, rcHR09-CII y la cepa La Sota en 100 l de DMEM por vía oculonasal, respectivamente. A los pollos del grupo de control se les inyectaron 100 µl de DMEM. El suero de los pollos inmunizados se recogió a los 7-, 14- y 21 días después de la inmunización (dpi) para determinar el título de anticuerpos. A los 21 ppp, los pollos fueron expuestos a 105 cepas EID50 NDV genotipo VII ZJ1 por vía oculonasal. Los hisopos cloacales y orofaríngeos se recolectaron el 3- y el 5- día posterior a la exposición (dpc) para una mayor detección de diseminación viral. Los signos clínicos y la muerte se registraron todos los días hasta el 14 dpc.

2.9. Determinación del título de anticuerpos séricos

El título de anticuerpos contra el NDV se midió mediante el método de inhibición de la hemaglutinación (HI) como se describió anteriormente [22].

2.10. Declaración de Ética

La inmunización y el desafío de los pollos fueron aprobados por el Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad de Yangzhou (No. YZUDWLL-201904-002; Fecha: 4 de febrero de 2019).

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2.11. Análisis estadístico

Los datos se muestran como medias ± desviaciones estándar (DE) y se obtuvieron de tres réplicas. La significación estadística entre diferentes grupos se analizó mediante el método de prueba t de Student utilizando el software GraphPad Prism 7.0 (La Jolla, CA, EE. UU.). (* p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0,001).

3. Resultados

3.1. Esquema para la construcción de dos NDV quiméricos

El NDV del genotipo VII se distribuye en todo el mundo y a menudo causa consecuencias fatales en pollos y otras aves susceptibles [23]. Anteriormente, aislamos una cepa termoestable de NDV HR09 de genotipo VIII, que puede mantener la infecciosidad durante más de 60 minutos cuando se incuba a 56 ◦C [14]. En este estudio, para generar una vacuna candidata atenuada termoestable contra el genotipo VII del NDV, utilizamos HR09 como columna vertebral y reemplazamos el gen F con el de la cepa VII DT-2014; mientras tanto, los sitios de escisión fueron mutados de 112RRQRR↓F 117 a sitios de escisión de proteína NDV F de clase I 112ERQER↓L 117 y la cepa avirulenta de sitios de escisión de proteína NDV F de clase II 112GRQGR↓L 117. Los plásmidos que contienen la longitud completa de el genoma HR09 con la proteína F mutada se designó como prcHR09-CI y prcHR09-CII, respectivamente (Figura 1).

Figura 1. Estrategia esquemática para la construcción de dos NDV quiméricos. El gen F de la cepa termoestable HR09 de genotipo VIII se reemplazó con el gen F mutado de la cepa DT-2014 de genotipo VII.

3.2. Construcción del NDV quimérico rcHR09-CΙ y rcHR09-CⅡ

Para construir los virus quiméricos, los plásmidos prcHR09-CI o prcHR09-CII se cotransfectaron con los tres plásmidos auxiliares, pCI-NP, pCI-P y pCI-L en células BSR-T7/5. , que puede expresar la ARN polimerasa T7. 72 h más tarde, se recogió el lisado celular completo y se inyectó en huevos embrionados SPF de 10-días de edad, y los fluidos alantoideos se recogieron 4 días después de la incubación. Para comprobar los sitios de escisión de los dos virus quiméricos rescatados, se realizó el experimento de PCR del gen F y los productos se sometieron a secuenciación; Los resultados mostraron que los sitios de escisión se mutaron con éxito a 112ERQER↓L 117 en rcHR09-CI (Figura 2A) y 112GRQGR↓L 117 en rcHR09-CII (Figura 2B), por separado. Finalmente, el genoma completo de los dos NDV quiméricos termoestables se amplificó utilizando 10 pares de cebadores, y los resultados demostraron que tanto rcHR09-CI (Figura 2C) como rcHR09-CII (Figura 2D) contenían el genoma completo del NDV. En conjunto, estos datos demostraron que los dos virus quiméricos termoestables se construyeron con éxito.

Figura 2. Construcción y validación de los quiméricos NDV rcHR09-CI y rcHR09-CII. El ARN total de los virus rescatados se extrajo y se transcribió de forma inversa en ADNc, el gen F de rcHR09-CI (A) y rcHR09-CII (B) se amplificó y se preparó para secuenciación. La longitud completa de los quiméricos NDV rcHR09-CI (C) y rcHR09-CII (D) se amplificó utilizando 10 pares de cebadores, y S1-S10 son su representación.

3.3. Características biológicas del rcHR09-CI y rcHR09-CII del NDV quimérico

Para comprobar si el reemplazo del gen F afecta la replicación del NDV, se realizaron cinéticas de crecimiento en huevos de gallina embrionados de 10-días midiendo su EID50. Los NDV se diluyeron e incubaron en 10-huevos de gallina embrionados de un día de edad y el líquido alantoideo se recogió en 24-, 48-, 72- y 96- h post-incubación. Los resultados de EID50 mostraron que tanto el rcHR09-CI como el rcHR09-CII quiméricos rescatados compartían una cinética de crecimiento similar con su cepa HR09 parental (Figura 3A), lo que demostró que el reemplazo del gen F no tuvo ningún efecto. sobre la replicación de HR09.

Figura 3. Las características biológicas de los quiméricos NDV rcHR09-CI y rcHR09-CII. (A) Los dos quiméricos NDV rcHR09-CI y rcHR09-CII tienen una cinética de crecimiento similar con su cepa materna HR09. La curva de crecimiento de los dos virus quiméricos y su cepa materna HR09 se midió con el método EID50 en huevos de gallina embrionados SPF de 10-días de edad. (B) Los dos quiméricos NDV rcHR09-CI y rcHR09-CII comparten la termoestabilidad con HR09. Se incubaron un total de 108 EID50 de las cepas NDV rcHR09-CI, rcHR09-CII, HR09 y La Sota a 56 ◦C durante 10-, 20-, {{21 }}, 40-, 50- y 60-min, respectivamente. Luego, se midieron los títulos de los cuatro NDV utilizando el método EID50.

Como la cepa HR09 era una cepa termoestable de NDV, también se investigó si el reemplazo de la proteína F afectaba su termoestabilidad. Cada virus quimérico y HR09 con el mismo título de virus (108 EID5{{50}}) se trataron con 10-, 20- , 30-, 40-, 50- y 60-min por debajo de 56 ◦C. Luego, se midió el título del virus realizando un ensayo EID50. Los resultados mostraron que los dos virus quiméricos y su cepa parental HR09 podían permanecer infecciosos durante más de 60 minutos, mientras que la cepa no termoestable La Sota sólo permaneció infecciosa durante no más de 20 minutos (Figura 3B). Estos datos indicaron que los virus quiméricos rcHR09-CI y rcHR09- 218 CII todavía eran termoestables. En este estudio, el gen F de VIII HR09 se reemplazó con el gen F mutado de VII DT- 2014 para obtener dos NDV quiméricos atenuados. Para evaluar la virulencia de rcHR09-CI y rcHR09-CII quiméricos, se detectaron los valores de MDT e ICPI. Los resultados mostraron que el valor de MDT de los dos NDV quiméricos era superior a 120 h. Como control, el valor de MDT de su cepa parental HR09 fue de 57,6 h. Los valores ICPI de rcHR09-CI y rcHR09-CII fueron cero, como control, el ICPI de HR09 fue 1,8 (Tabla 1). La virulencia del NDV según el valor de MDT se ha clasificado en tres grupos: velogénica (menos de 60 h), mesogénica (60 a 90 h) y lentogénica (más de 90 h). Mientras tanto, el valor ICPI también es un criterio común para determinar la virulencia del NDV: velogénico (menos de 60 h), mesogénico (60 a 90 h) y lentogénico (más de 90 h): velogénico (1,5 a 2,0), mesogénico (0,7 –1,5) y lentogénico (0,0–0,7) [24]. En conjunto, estos datos demuestran que tanto el rcHR09-CI como el rcHR09-CII quiméricos rescatados estaban altamente atenuados al alterar los sitios de escisión de la proteína F.

Tabla 1. Evaluación de patogenicidad y estabilidad de los dos NDV quiméricos (20 pases en total).

Además, la estabilidad de los dos NDV quiméricos se detectó incubando 20 pases en huevos de gallina embrionados de 10-días de edad, y se eligieron los pases 10 y 20 para medir los valores de MDT e ICPI. Los resultados mostraron que los valores de MDT del paso 10 y el paso 20 fueron todos mayores de 120 h, y los valores de ICPI del paso 10 y el paso 20 fueron todos cero (Tabla 1). Estos datos mostraron que después de 20 pases en huevos de gallina embrionados de 10-días de edad, los valores de MDT e ICPI de dos NDV quiméricos no tuvieron diferencias significativas, lo que demostró que los dos NDV quiméricos rescatados eran relativamente estables.

3.4. Se indujo un título alto de anticuerpos HI después de la inmunización de los NDV quiméricos

Para comprobar si la inmunización de los NDV quiméricos rescatados podía inducir la respuesta de anticuerpos en pollos, 48 8-pollos SPF de un día de edad se dividieron en cuatro grupos. Se inocularon diferentes grupos con 106 EID50 de rcHR09-CI, rcHR09-CII, cepa La Sota o 100 µL de DMEM por vía oculonasal, respectivamente. El suero de los pollos inmunizados se recogió los días 7-, 14- y 21 días después de la inmunización (dpi) para determinar el título de anticuerpos HI. El anticuerpo HI del suero recolectado contra la cepa de NDV inmunizada mostró que no hubo diferencias significativas entre el suero de rcHR09-CI, rcHR09-CII y La Sota en 7 ppp. Además, con el paso del tiempo, el título de anticuerpos HI fue creciendo en suero de 14 y 21 ppp, y no hubo diferencias significativas entre los tres grupos (Figura 4A).

Figura 4. Los virus quiméricos indujeron un alto nivel de respuesta de anticuerpos. Los pollos SPF fueron inmunizados con 106 EID50 rcHR09-CI, rcHR09-CII y la vacuna comercial cepa La Sota por vía oculonasal, respectivamente. El suero se recogió en 1-, 2- y 3 semanas después de la inmunización, se midió el título de anticuerpos usando el método HI contra ellos mismos (A) y el título de anticuerpos HI cruzado contra ZJ1 (B). (ns: sin diferencia significativa; * p < 0,05; ** p < 0,01).

Además, se detectó el título de anticuerpos HI de reacción cruzada contra la cepa ZJ1 para elevar los efectos de inmunización de los NDV quiméricos contra el NDV de genotipo VII. Los resultados mostraron que no hubo diferencias significativas entre los tres grupos inmunizados contra NDV en 7 ppp y que el título de anticuerpos HI aumentó con el tiempo. A diferencia del título de anticuerpos HI contra la cepa inmunizada, los títulos de anticuerpos HI contra la cepa ZJ1 de los grupos inmunizados con rcHR09-CI y rcHR09-CII fueron significativamente más altos que los del grupo inmunizado con la vacuna La Sota, y rcHR 09-El grupo CI indujo el título de anticuerpos HI más alto entre estos tres grupos (Figura 4B).

3.5. La eliminación viral se redujo cuando los pollos inmunizados fueron expuestos a la cepa virulenta ZJ1 del genotipo VII

En este estudio, los pollos SPF inmunizados fueron desafiados con la cepa ZJ1 del genotipo VII para evaluar el efecto protector de los virus quiméricos contra el NDV del genotipo VII. A los 21 ppp, los pollos inmunizados fueron desafiados con 105 cepa EID50 ZJ1, y los hisopos cloacales y orofaríngeos de todos los pollos desafiados de cada grupo se recolectaron en los 3- y 5- días posteriores al desafío (dpc ) para la detección de diseminación viral. Los resultados mostraron que la inmunización de los grupos rcHR09-CI, rcHR09-CII y La Sota podría reducir la eliminación viral en hisopos cloacales (Figura 5A, C) y hisopos orofaríngeos en el {{11} } y 5-dpc (Figura 5B, D) en comparación con el grupo de control. En comparación con el grupo de La Sota, la eliminación viral en dos NDV quiméricos fue significativamente menor que en los grupos inmunizados de La Sota, lo que demostró que los dos NDV quiméricos tenían una mejor eficiencia protectora que la cepa de La Sota contra el desafío del NDV del genotipo VII.

Figura 5. Cuantificación QRT-PCR de la excreción de NDV ZJ1 en pollos desafiados. Los pollos fueron expuestos a 1{{10}}6 EID50 cepa NDV genotipo VII ZJ1 21 días después de la inmunización. Las muestras de hisopo cloacal (A, C) y las muestras de hisopo orofaríngeo (B, D) se recolectaron los días 3- y 5- después del desafío, y los niveles de eliminación viral de NDV ZJ se cuantificaron mediante QRT- PCR. Los valores se mostraron como valores medios ± desviación estándar (media ± DE) en cada grupo. (ns: sin diferencia significativa; * p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001).

3.6. Los dos NDV quiméricos brindaron protección total contra el desafío de la cepa ZJ1 del genotipo VII

Debido a que la exposición a la cepa ZJ1 del genotipo VII puede tener consecuencias letales, excepto la detección de diseminación viral, también se registró la muerte de los pollos expuestos todos los días hasta los 14 días. Los resultados mostraron que todos los pollos del grupo de control mostraron signos clínicos de depresión espiritual, trastorno respiratorio, diarrea y murieron entre el 5- y el 6-dpc, y no hubo signos clínicos ni pollos muertos en rcHR{ {4}}CI, rcHR09-CII y los grupos La Sota hasta el 14 dpc (Figura 6), lo que demostró que todos los NDV quiméricos y la cepa de vacuna La Sota podían proporcionar protección completa contra la exposición al NDV del genotipo VII.

Figura 6. Los rcHR09-CI y rcHR09-CII de NDV quiméricos brindan protección total contra el desafío de ZJ1. Tres semanas después de la inmunización, los pollos fueron expuestos a 106 cepas EID50 ZJ1. El estado de supervivencia se controló durante un total de 14 días.

4. Discusión

A pesar de que se utilizan múltiples tipos de vacunas contra el VEN en el mundo, la enfermedad de Newcastle todavía ocurre en muchos lugares del mundo. Un problema podría ser que el genotipo de la cepa de la vacuna no coincida con la cepa prevalente. Estas vacunas con genotipos no coincidentes pueden brindar cierta protección contra el desafío de los VENC virulentos; sin embargo, no pueden proteger a los pollos de la infección y no pueden reducir eficazmente la eliminación del virus [25,26]. El NDV de genotipo VII de clase II es un genotipo importante que prevalece en las regiones de Medio Oriente, África y Asia; sin embargo, las vacunas utilizadas en estos lugares suelen ser cepas de genotipo II La Sota y B1, que no son el mismo genotipo que las cepas prevalentes [27-29]. En este estudio, para generar una vacuna candidata termoestable compatible con el genotipo VII, se utilizó una cepa termoestable HR09 de genotipo VIII como columna vertebral y se construyeron dos candidatos vacunales quiméricos compatibles con el genotipo VII para satisfacer la necesidad de una vacuna para el genotipo VII. Hasta ahora, se han desarrollado múltiples candidatos a vacunas termoestables contra el VEN. El primer NDV V4 termoestable se aisló del proventrículo de pollos en 1966 [30]. V4 era una cepa lentogénica natural y los resultados del análisis filogenético mostraron que pertenecía al genotipo II del NDV. A diferencia de V4, la cepa termoestable HR09 utilizada en nuestro estudio pertenecía a una cepa virulenta [14]. Si queremos ponerlo en uso clínico, lo primero que debemos hacer es determinar cómo convertirlo en una cepa avirulenta. Gracias al desarrollo del sistema genético inverso, la construcción de vacunas candidatas avirulentas contra el NDV con genotipo coincidente ha logrado avances significativos. Como se ha demostrado que el sitio de escisión de la proteína F es el principal determinante de virulencia del NDV [31], una forma sencilla de generar el NDV atenuado es reemplazar el sitio de escisión de la proteína F en la cepa virulenta por el de la cepa avirulenta. Mientras tanto, se ha informado que la proteína F es una proteína inmunogenética importante que podría inducir el anticuerpo de neutralización para proteger a los pollos inmunizados contra el desafío del VEN virulento [32-34]. Además, se informó que el sitio de escisión del NDV podría afectar la respuesta inmune en pollos inmunizados [11]. En este estudio, reemplazamos el gen F de un HR09 termoestable con el gen F de la cepa virulenta DT-2014 del genotipo VII del NDV; mientras tanto, los sitios de escisión de DT-2014 también se mutaron a los de las cepas avirulentas de NDV de clase I y clase II, respectivamente (Figura 1).

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Como se esperaba, los resultados de la determinación de virulencia mostraron que los dos NDV termoestables quiméricos están altamente atenuados (Tabla 1). Mientras tanto, también se descubrió que los dos NDV quiméricos mostraban una cinética de crecimiento similar a la de su cepa HR09 parental (Figura 3A). Como la proteína HN era la principal proteína responsable de la termoestabilidad de HR09, los dos NDV quiméricos aún mantenían la termoestabilidad al igual que su cepa HR09 parental (Figura 3B). Múltiples estudios han informado que la vacuna contra el NDV con genotipo compatible puede inducir un mayor nivel de respuesta de inmunidad humoral y es más eficaz para reducir la eliminación viral que la vacuna heteróloga, a pesar de que tanto las vacunas con genotipo compatible como las heterólogas pueden proteger a los pollos infectados de signos clínicos obvios y muerte [35-37]. En este estudio, el título de anticuerpos HI se midió a 7-, 14- y 21-dpi, los resultados del título de anticuerpos contra el tren inmunizado mostraron que no hubo diferencias significativas entre rcHR{ {13}}CI, rcHR09-CII y cepas La Sota (Figura 4A), mientras que el anticuerpo HI contra la cepa ZJ1 del genotipo VII mostró que los dos NDV quiméricos termoestables indujeron un nivel significativamente más alto que la cepa La Sota. y entre los tres NDV inmunizados, rcHR09-CI indujo el nivel más alto de anticuerpo HI (Figura 4B). Este resultado fue consistente con informes anteriores de que el sitio de escisión de la proteína F podría afectar la respuesta inmunitaria de las vacunas candidatas en pollos. El experimento de exposición al genotipo VII ZJ1 mostró que los tres grupos inmunizados mostraron una reducción significativa en la excreción viral en comparación con el grupo de control, y los dos NDV quiméricos termoestables pudieron reducir la excreción viral de manera más eficiente que la cepa La Sota (Figura 5). La curva de supervivencia mostró que todas las cepas rcHR09-CI, rcHR09-CII y La Sota podían proporcionar una protección completa contra el desafío de la cepa ZJ1 (Figura 6). Combinados, estos datos mostraron que los dos NDV quiméricos compatibles con el genotipo VII construidos en este estudio podrían proporcionar una protección eficaz contra el desafío de la cepa ZJ1 del genotipo VII y podrían reducir la eliminación del virus de manera más eficiente que la cepa La Sota. En resumen, este estudio construyó dos candidatos a vacunas quiméricas termoestables contra el NDV, que utilizan la cepa HR09 virulenta del NDV termoestable como columna vertebral y reemplazaron su gen F con el de la cepa DT-2014 del genotipo VII. Mientras tanto, el sitio de escisión de la proteína F de DT-2014 se mutó de 112RRQRR↓F 117 a 112ERQER↓L 117 y 112GRQGR↓L 117, respectivamente. Los dos NDV quiméricos preservan la termoestabilidad de HR09, y las pruebas de virulencia realizadas por MDT e ICPI indican que se atenúan con éxito. Ambos NDV quiméricos podrían inducir un alto nivel de respuesta de anticuerpos, reducir significativamente la eliminación viral y proporcionar una protección completa contra el desafío de la cepa virulenta del genotipo VII ZJ1.

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