Coordinar la regulación del metabolismo del triptófano sistémico y renal por los transportadores de fármacos OAT1 y OAT3
Mar 20, 2022
Jeffry C Granados1, Ana Richelle2, Jahir M. Gutiérrez1, Patricio Zhang3, Xinlian Zhang4, Vibha Bhatnagar5, Nathan E. Lewis1,2,6y Sanjay K. Nigam2,7,*
Contacto:joanna.jia@wecistanche.com
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Cómo detectan los órganos los metabolitos circulantes es una pregunta clave. Aquí, mostramos que los transportadores de aniones orgánicos multiespecíficos de las drogas, OAT1 (SLC22A6 o NKT) y OAT3 (SLC22A8), juegan un papel en el sentido del órgano. Los análisis de metabolómica del suero de ratones knockout para Oat1 y Oat3 revelaron cambios en los derivados del triptófano implicados en el metabolismo y la señalización. Varios de estos metabolitos se derivan del microbioma intestinal y están implicados como toxinas urémicas encrónicoriñónenfermedad. La interacción directa con los transportadores se apoyó con ensayos de transporte basados en células. Para evaluar el impacto de la pérdida de la función OAT1 o OAT3 en el riñón, un órgano en el que estos transportadores de captación se expresan en gran medida, los datos transcriptómicos de inactivación se mapearon en un modelo computacional basado en "tareas metabólicas" que evalúa más de 150 funciones celulares. A pesar de los cambios de los metabolitos del triptófano en ambos knockouts, solo en el knockout de Oat1 aumentaron múltiples funciones celulares relacionadas con el triptófano. Por lo tanto, privado de la capacidad de tomar quinurenina, quinurenato, antranilato y N-para-milantranilato a través de OAT1, el riñón responde activando sus propias vías biosintéticas relacionadas con el triptófano. Los resultados respaldan la Teoría de Señalización y Detección Remota, que describe cómo los transportadores de "fármacos" ayudan a optimizar los niveles de metabolitos y moléculas de señalización al facilitar la comunicación entre órganos. Dado que OAT1 y OAT3 son inhibidos por muchos fármacos, los datos implican la posibilidad de interacciones entre fármacos y metabolitos. De hecho, el tratamiento de seres humanos con probenecid, un inhibidor de OAT utilizado para tratar la gota, elevó los metabolitos de triptófano circulantes. Además, dado que las agencias reguladoras han recomendado que se analicen los medicamentos para la unión o el transporte de OAT1 y OAT3, se deduce que estos metabolitos se pueden usar como biomarcadores endógenos para determinar si los candidatos a fármacos interactúan con OAT1 y/o OAT3.
Los transportadores de aniones orgánicos OAT1 (SLC22A6, originalmente NKT (1)) y OAT3 (SLC22A8, originalmente ROCT (2)) se encuentran en el túbulo proximal delriñóny el plexo coroideo del cerebro y controlan la distribución fisiológica y la eliminación de numerosos fármacos y toxinas ambientales, así como metabolitos endógenos como -cetoglutarato, prostaglandinas y urato (3, 4). Además, los OAT ayudan a regular los niveles de productos naturales ingeridos y compuestos derivados del microbioma intestinal (p. ej., epicatequina, 3-sulfato de indoxilo, sulfato de p-cresol) (5, 6).
OAT1 y OAT3, miembros de la familia SLC22, se encuentran entre los transportadores de fármacos multiespecíficos más conocidos. Este grupo de transportadores de fármacos incluye a otros miembros de las superfamilias SLC (transportador de solutos) y ABC (cassette de unión a ATP) (7, 8). Existe una extensa literatura sobre los roles farmacológicos y toxicológicos de estos transportadores, sin embargo, las funciones endógenas de estas proteínas conservadas evolutivamente, así como la red regulatoria en la que participan, apenas comienzan a caracterizarse (9). Estos transportadores multiespecíficos influyen en muchos aspectos de la fisiología y la fisiopatología, probablemente al funcionar en combinación con transportadores monoespecíficos u oligoespecíficos. Tres ejemplos fisiopatológicos bien caracterizados son las funciones de OAT1, OAT3, URAT1 y ABCG2 en la gota (10), la función de OAT1 y OAT3 en la acumulación de toxinas urémicas asociadas con enfermedades crónicas.riñón(ERC) (11, 12) y la familia SLC22 en casos agudosriñónlesión (13).
Debido a la gran variedad de pequeños compuestos de aniones orgánicos transportados por OAT1 y OAT3, es posible que una amplia gama de xenobióticos y moléculas endógenas compitan por el acceso y la eliminación renal de estos transportadores de OAT (14, 15). Esto tiene implicaciones importantes porque muchos de los metabolitos, incluidos los que surgen del microbioma intestinal y son transportados por OAT1 y OAT3, regulan la fisiología endógena y se han relacionado con el desarrollo de trastornos clínicos, como la ERC, el síndrome metabólico y la diabetes (14, 16, 17). Por ejemplo, la cantidad de CMPF (ácido 3-carboxi-4-metil-5-propil-2- furano propanoico), un sustrato de OAT3, en la circulación se ha relacionado con la diabetes. CMPF es un metabolito de ácido graso furano que se encuentra en los aceites de pescado, aceites vegetales, mantequilla y otros alimentos y perturba la función de las células pancreáticas, lo que lleva a la intolerancia a la glucosa (18, 19). Las posibles consecuencias de la competencia a nivel de transportador entre un fármaco y el metabolito endógeno transportado incluyen (a) concentraciones intracelulares alteradas de metabolitos porque un fármaco transportado bloquea la entrada del metabolito en la célula; (b) concentraciones séricas alteradas del fármaco, el metabolito o ambos, lo que conduce a un aumento de la vida media y/o los niveles del metabolito; y (c) metabolismo sistémico alterado que surge de efectos en cascada distales en múltiples vías metabólicas que dependen de OAT1 o OAT3 o ambos.
Aplicamos un enfoque de biología de sistemas que empleó datos metabolómicos y transcriptómicos de ratones Oat1 y Oat3knockout (KO) para analizar las principales funciones metabólicas que están influenciadas por OAT1 y OAT3. Los datos metabolómicos séricos de los ratones KO Oat1 y Oat3 representaron el impacto que estos transportadores tienen en el metabolismo sistémico endógeno. Utilizamos los datos transcriptómicos de lariñón, que es el sitio de expresión de los genes transportadores codificadores, para evaluar la actividad de cientos de funciones metabólicas mediante el análisis de tareas metabólicas. Al hacerlo, pudimos complementar la comprensión de los cambios de metabolitos extracelulares debido a la pérdida del transportador OAT1 u OAT3 con un análisis de las vías metabólicas intracelulares afectadas.
Juntos, el enfoque multiómico y el análisis de biología de sistemas utilizados aquí proporcionan un retrato de las vías metabólicas y de señalización locales y sistémicas moduladas por separado y conjuntamente por OAT1 y OAT3. Mostramos que OAT1 no solo regula el metabolismo del triptófano de manera sistémica, sino que también juega un papel clave en las vías metabólicas del triptófano dentro del tejido donde se encuentra. Por lo tanto, nuestros resultados indican que los estudios de nuevas entidades farmacológicas no solo deben considerar los efectos de la interacción fármaco-metabolito (DMI) en el suero, sino también evaluar los posibles cambios en el metabolismo celular debido a la pérdida de la entrada de metabolitos a través de la competencia a nivel del transportador. En apoyo de la relevancia humana de nuestro trabajo, mostramos que muchas de las alteraciones en los niveles séricos de metabolitos de triptófano observadas en los ratones knockout también se observan en humanos después de la administración de probenecid, un fármaco utilizado para tratar la gota que inhibe OAT1 y OAT3.
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Resultados
Resumen del enfoque general
La familia de genes SLC22 (OAT, OCT, OCTN) codifica transportadores que participan en la absorción de muchos compuestos únicos en varios tejidos, aunque gran parte de la investigación se ha centrado en un puñado de miembros (SLC22A1, SLC22A2, SLC22A6, SLC22A8) que manejan muchas drogas comunes (20, 21). Sin embargo, estos genes están muy conservados, con ortólogos en moscas, gusanos, peces y erizos de mar (22); esto implica que tienen roles fisiológicos importantes más allá del manejo de drogas. Para determinar las funciones endógenas de OAT1 y OAT3 en el control del metabolismo a nivel de tejido y a nivel de organismo, independientemente de sus funciones bien conocidas como transportadores de fármacos y toxinas, analizamos datos transcriptómicos específicos de tejido y datos de metabolómica sérica (Fig. 1). Comparamos datos de ratones genéticamente deficientes en Oat1 o Oat3 y sus controles de tipo salvaje. Estos conjuntos de datos se han examinado previamente desde una perspectiva quimioinformática (23) y para proporcionar una visión general amplia de las vías afectadas (24), pero aquí ponemos énfasis en su papel específico en la disposición de los metabolitos de triptófano. Debido a que estos dos transportadores se encuentran en elriñón, Analizamosriñóndatos transcriptómicos mediante el análisis de tareas metabólicas, un método de biología de sistemas que agrupa los genes según sus funciones coordinadas en la biosíntesis de un conjunto limitado de intermediarios de metabolitos clave a partir de diversas entradas de metabolitos (consulte la sección Métodos para obtener más detalles). Apoyamos estos estudios dentro de ensayos de transporte in vitro; también respaldamos la relevancia clínica de nuestros hallazgos con datos de metabolómica humana.
Características conocidas de los ratones Oat1 KO y Oat3 KO Casi todas las características de los ratones deficientes en Oat1 u Oat3 son similares a las de los ratones de tipo salvaje (25–27) (Tabla 1). Los ratones knockout son viables con una supervivencia comparable a la de los ratones de tipo salvaje. Además, no muestran anomalías aparentes en el desarrollo o el crecimiento, y el examen histológico y fisiológico de estos diversos knockouts (de ~2 a 8 meses de edad) reveló pocas o ninguna diferencia con el tipo salvaje, aparte de que los ratones Oat3 KO tienen una presión arterial ligeramente más baja ( 28). También se ha observado una tendencia hacia el depósito de lípidos hepáticos en Oat1 KO, pero solo en ratones muy viejos (29).
Estos ratones sin transportador también se han caracterizado desde un punto de vista farmacológico y toxicológico (Tabla 2). OAT1 y OAT3 juegan papeles importantes en el manejo de varios fármacos y toxinas, tanto ambientales como endógenas (30–38). Ambos ratones knockout tienen respuestas alteradas a los diuréticos tiazídicos y de asa debido a la incapacidad de estos fármacos para acceder a la luz de la nefrona, un proceso que depende de la captación mediada por OAT1-o OAT3-en la célula del túbulo proximal . Los animales Oat1 KO están protegidos contra la nefrotoxicidad inducida por mercurio debido a la falta deriñóncaptación de conjugados de mercurio. Ambos ratones acumularon toxinas urémicas en el suero y mostraron una disminución de la secreción de ácido úrico. El análisis ex vivo de tejidos de ratones Oat1 KO o Oat3 KO muestra una absorción reducida de varios antivirales.
Hemos informado que los animales con deficiencia de avena1-pueden tener una expresión reducida de OAT3 (39). Sin embargo, varios estudios han indicado que el impacto funcional de esto es modesto en el mejor de los casos en el estado basal. Por ejemplo, el nocaut de Oat1riñoneshan reducido notablemente el transporte de PAH, pero sin pérdida aparente de transporte del sustrato OAT3, sulfato de estrona (26). El análisis quimioinformático ha identificado conjuntos de propiedades moleculares que distinguen los metabolitos alterados en Oat1 en comparación con los ratones deficientes en Oat3 (23). Además, embrionarioriñónlos cultivos de órganos de ambas líneas de ratones transportaron diferentes conjuntos de antivirales (36–38). También hay diferencias en los tipos de toxinas urémicas encontradas en Oat1 versus Oat3 KO (34).
El metabolismo del triptófano se altera sistémicamente en ratones KO Oat1 y Oat3
Los análisis metabolómicos publicados de ratones Oat1 KO y Oat3 KO sugieren alteraciones fisiológicamente importantes en el manejo de metabolitos endógenos y productos del microbioma intestinal, incluidas algunas toxinas urémicas (34, 35). Aquí, analizamos 731 metabolitos de identidad conocida en el suero recolectado de ratones control y Oat1 KO. Asimismo, se detectaron 611 metabolitos de identidad conocida en el suero de ratones control y Oat3 KO.
Para los ratones Oat1 KO, encontramos que 63 metabolitos en Amino Acid Superpathway (Tabla complementaria S1) aumentaron significativamente (p Menor o igual a 0.05, 54 metabolitos, entre los cuales 12 metabolitos tuvieron cambios superiores a 3) o con tendencia a aumentar significativamente (0.05 Menor o igual a p Menor o igual a 0.10, nueve metabolitos), lo que sugiere que son sustratos de OAT1 o que sus concentraciones séricas dependen en OAT1. Para los ratones Oat3 KO, encontramos que diez metabolitos en la Supervía de aminoácidos aumentaron significativamente, mientras que 11 tendieron a aumentar significativamente (Tabla complementaria S2). Como complemento a los valores de p, también calculamos la d de Cohen, que mostró tamaños de efecto grandes (que van de 1,76 a 4,17) para los metabolitos de triptófano. En consonancia con otros datos farmacológicos y fisiológicos obtenidos de los ratones knockout OAT1 y OAT3 o de su tejido que indican importantes diferencias funcionales (23, 36, 38), la comparación de los cambios en los metabolitos séricos en la vía Amino Acid Superpath entre Oat1 KO (63 metabolitos) y Los ratones Oat3 KO (21 metabolitos) revelaron solo diez metabolitos superpuestos en estos subconjuntos (Tabla complementaria S3).
Cada metabolito se clasificó usando el software de Metabolon en una de las ocho supervías (aminoácidos, carbohidratos, cofactores y vitaminas, energía, lípidos, nucleótidos, péptidos, xenobióticos) y una de las 90 subvías. De los 17 metabolitos que se acumularon significativamente en el suero de los animales Oat1 KO y Oat3 KO, cuatro pertenecían a la vía secundaria del metabolismo del triptófano, lo que indica que estos dos transportadores tienen un papel importante compartido en la regulación del metabolismo sistémico del triptófano (Fig. 2) . Independientemente, el metabolismo del triptófano se encontraba entre las subvías más enriquecidas para ambos modelos knockout (Fig. 3). Dieciséis Figura 3. El metabolismo del triptófano es una de las vías más alteradas en ambos ratones knockout. Un gráfico de volcán para Oat1 KO (n=5) muestra los metabolitos de triptófano frente a todos los demás metabolitos medidos. B, el metabolismo del triptófano es la segunda vía más rica para metabolitos significativamente elevados. C, diagrama de volcán para Oat3 KO (n=3) que muestra los metabolitos de triptófano frente a todos los demás metabolitos medidos. D, el metabolismo del triptófano es la vía más enriquecida para metabolitos significativamente elevados según el análisis de la subvía metabólica. Papel de OAT1 y OAT3 en el metabolismo del triptófano 4 J. Biol. química (2021) 296 100575los metabolitos de triptófano se midieron en el suero de ambos ratones y 12 se alteraron significativamente en al menos un grupo. Los ratones Oat1 KO tenían 11 metabolitos elevados, incluido uno (tranilato de N-formilante) que no se midió en el suero de Oat3 KO (Tabla 3). El análisis de Oat3 KO reveló que seis de los 16 metabolitos estaban significativamente alterados o tendían a hacerlo. Se sabe que algunos de estos metabolitos, incluidos los derivados de bacterias en la microflora intestinal, tienen efectos distales en varios otros órganos. Por ejemplo, el 3-sulfato de indoxilo está asociado con la progresión deriñónenfermedad y síndrome urémico (12, 40). Los datos indican que OAT1 y OAT3 trabajan juntos para regular el metabolismo sistémico del triptófano y, sin embargo, también tienen funciones específicas dentro del metabolismo del triptófano al manejar distintos conjuntos de metabolitos que afectan diferentes reacciones bioquímicas.
Evaluación de las interacciones fármaco-metabolito en humanos que involucran un fármaco inhibidor de OAT y metabolitos de triptófano
El probenecid, un fármaco utilizado para tratar la gota, se administró a humanos para determinar el impacto a corto plazo de un fármaco de unión a OAT de alta afinidad en los niveles de metabolitos circulantes. El probenecid tiene tres dianas bien establecidas: SLC22A12 (URAT1, Rst), OAT1 y OAT3, todos ellos genes estrechamente relacionados en el grupo de transportadores de aniones orgánicos de la familia SLC22 de transportadores de solutos. URAT1 es un transportador de ácido úrico ubicado en la membrana apical (lado que mira hacia la orina) del túbulo proximal, por lo que se espera que OAT1 y OAT3, que son multiespecíficos y se expresan en el lado del túbulo proximal que mira hacia la sangre, ejerzan una efecto más profundo sobre el metaboloma sérico. Las comparaciones de las mediciones metabólicas en la sangre antes y 5 h después de la dosificación muestran cambios importantes en la vía secundaria del metabolismo del triptófano (Tabla 4). Debido a las diferentes plataformas, había 22 metabolitos en esta vía secundaria, 16 de los cuales estaban significativamente alterados. Catorce metabolitos se midieron en las tres plataformas y revelaron varios puntos en común entre los ratones knockout y los humanos tratados con probenecid (Fig. 4). Por ejemplo, se observaron aumentos en el 3-sulfato de indoxilo, la quinurenina, la N-acetilquinurenina y el lactato de indol tanto en los grupos de ratones knockout como en los humanos. Sin embargo, hubo más superposición entre el ratón Oat1 KO y los humanos tratados con probenecid. Los ocho metabolitos que estaban significativamente elevados en Oat1 KO también estaban significativamente elevados en los seres humanos tratados con el fármaco. Solo la serotonina, que estaba elevada en el ratón Oat3 KO, no se alteró en los humanos.
Ratones tratados con un fármaco inhibidor de OAT muestran alteraciones en el metabolismo del triptófano
Como intermediario entre nuestros modelos de ratones knockout y los humanos, tratamos ratones de tipo salvaje con probenecid, un fármaco inhibidor de OAT bien establecido. Este tratamiento farmacológico condujo a la elevación de seis metabolitos de triptófano, incluidos quinurenina, quinurenato e indolelactato (Fig. 5). Estos metabolitos se elevaron en uno o ambos experimentos de inactivación y en los seres humanos tratados con probenecid.
Por lo tanto, los resultados generales en humanos y ratones tratados con probenecid, así como en los ratones knockout, respaldan el papel de OAT1 y OAT3 en la regulación de los niveles circulantes de metabolitos de triptófano.
Los metabolitos del triptófano interactúan con los ensayos de transporte in vitro de OAT1 y OAT3 humanos Para confirmar nuestros hallazgos, realizamos ensayos de transporte in vitro utilizando células que sobreexpresan OAT1 y OAT3 humanos. Muchos de los metabolitos de esta vía secundaria se han probado contra estos transportadores (Tabla 3), pero otros metabolitos siguen sin explorarse. Los ensayos de transporte de ácido indolacético (ILA) revelaron que ILA interactúa con OAT1 y OAT3 (IC50=229.1 ± 74,56 μM, 74,49 ± 23,29 μM respectivamente) (Fig. 6). Además, la serotonina, que estaba excepcionalmente elevada en Oat3 KO, interactuó solo con OAT3 in vitro (IC50=288.2 ± 167.0 μM) (datos no mostrados). Los valores de IC50 luego se integraron con valores de Km conocidos para calcular las constantes inhibitorias. La constante inhibitoria (Ki) para ILA con OAT1 fue de 119,3 μM.
El análisis de la tarea metabolómica del riñón Knockout indica un papel fundamental para OAT1 en la detección de metabolitos de triptófano en el túbulo proximal
Utilizamos datos de micromatrices de lariñonesde Oat1 KO, Oat3 KO y sus controles de tipo salvaje para identificar cómo las alteraciones del transportador influyen en elriñónfunciones metabólicas. Con este fin, utilizamos un método de biología de sistemas (análisis de tareas metabólicas (41) de la herramienta CellFie) que predice cómo los cambios en la expresión génica afectan una lista predefinida de 175 tareas metabólicas (Tabla complementaria S4), que cubre los sistemas metabólicos generales de un celular (energía, nucleótidos, carbohidratos, aminoácidos, lípidos, vitaminas y cofactores, y metabolismo de los glicanos). Como se describe en Métodos, el cálculo de una "puntuación de tarea metabólica" toma datos transcriptómicos y atribuye una puntuación de actividad génica para cada gen. Se utiliza un modelo de metabolismo a escala del genoma para compilar una lista de reacciones necesarias para llevar a cabo cada una de las 175 tareas metabólicas. Por lo tanto, el análisis transcriptómico se puede usar directamente para comparar cuantitativamente la actividad relativa de cada función metabólica en las diversas condiciones (p. ej., de tipo salvaje frente a Oat1 KO, de tipo salvaje frente a Oat3 KO).
Descubrimos que las tareas metabólicas relacionadas con el triptófano eran comunes entre aquellos con una gran diferencia entre los ratones Oat KO y los de tipo salvaje. Sin embargo, lo inesperado fue que elriñónLas tareas metabólicas relacionadas con el triptófano dependían de OAT1 pero no de OAT3. En los ratones Oat1 KO, la síntesis de quinurenina, quinurenato, antranilato y N-para-milantranilato a partir de triptófano había aumentado las puntuaciones de tareas metabólicas, mientras que cada una de esas tareas tenía una puntuación de tareas metabólicas disminuida en Oat3 KO. Esto es consistente con los análisis de metabolómica sérica, que muestran elevaciones significativas en los niveles de quinurenina, quinurenato, antranilato y N-para-milantranilato en Oat1 KO.
Discusión
OAT1 y OAT3 son reconocidos por su papel en la eliminación de cientos de fármacos (42). Sin embargo, estudios in vivo e in vitro de OAT1 y OAT3 han demostrado que estas proteínas están involucradas en el transporte de numerosos metabolitos endógenos y derivados de microbios intestinales, toxinas urémicas, moléculas de señalización, nutrientes ingeridos, toxinas industriales y productos naturales (9, 24, 26, 34, 35, 43). Este también parece ser el caso de otros transportadores de fármacos multiespecíficos, lo que sugiere que su contribución al metabolismo endógeno está muy subestimada (44).
Estos transportadores de fármacos multiespecíficos están altamente expresados en casi todos los tejidos y juegan un papel particularmente crítico en la Figura 4. Los metabolitos de triptófano estaban elevados en ratones knockout para Oat y humanos tratados con probenecid. Un diagrama de Venn de metabolitos de triptófano significativamente alterados en ratones knockout y humanos tratados con probenecid. De los 14 metabolitos comunes a las tres plataformas, 12 estaban significativamente elevados en al menos uno de los experimentos. Cuatro metabolitos se elevaron significativamente en cada experimento. B, estructuras químicas de los metabolitos elevados en cada experimento: 3-sulfato de indoxilo, indolelactato, quinurenina y N-acetilquinurenina. C, diagramas de caja para cada metabolito en humanos tratados con probenecid (n=20), ratones Oat1 KO (n=5) y ratones Oat3 KO (n=3). Las líneas en los diagramas de caja indican la mediana. Papel de OAT1 y OAT3 en el metabolismo del triptófano. Biol. química (2021) 296 100575 7barreras epiteliales y endoteliales entre la sangre y otros fluidos/compartimentos corporales (p. ej., barrera hematoencefálica, barrera hematorretiniana, barrera hematoencefálica, barrera nariz-cerebro, barrera hematoencefálica). Como reguladores del metabolismo sistémico, así como del metabolismo local dentro de su tejido de expresión, el tipo de estudios y análisis que hemos descrito aquí, si se realizan para todos los transportadores de "fármacos", pueden alterar radicalmente nuestra visión fisiológica de estas proteínas conservadas evolutivamente.
La importancia farmacéutica clínica de estos transportadores es inmensa, y las agencias reguladoras han recomendado la detección de nuevas entidades farmacológicas contra al menos siete transportadores de fármacos multiespecíficos (OAT1, OAT3, OATP1B1, OATP1B3, OCT2, P-GP, BCRP) Interacciones medicamentosas (DDI): casos en los que dos o más medicamentos compiten por el acceso al mismo transportador. Los DDI mediados por transportadores pueden alterar la concentración de los fármacos en la sangre, lo que podría provocar efectos clínicos adversos (45). Teniendo en cuenta la cantidad de sustratos para OAT1 y OAT3, puede ocurrir un fenómeno similar entre las drogas y los metabolitos en circulación. Estos DMI también tienen el potencial de afectar la función del tejido, ya que los metabolitos y las moléculas de señalización pueden no poder ingresar a la célula y ejercer sus efectos en la fisiología celular normal. El presente estudio apoya esta posibilidad.
En nuestros análisis metabolómicos del suero de ratones knockout para Oat1 y Oat3, hubo marcadas alteraciones en los metabolitos relacionados con el triptófano. Los aumentos en los niveles sistémicos de metabolitos, debido a la ausencia de estos transportadores en la interfaz de la sangre con elriñón, planteó la posibilidad de una concentración intracelular disminuida enriñóncélulas del túbulo proximal. ¿Cómo podrían responder estas células a su vez? Utilizamos análisis de tareas metabólicas basadas en transcriptómica para abordar esta pregunta. Identificamos múltiples tareas metabólicas locales (riñón) relacionadas con el triptófano afectadas por la ausencia de los transportadores. Estos cambios en las puntuaciones de tareas metabólicas son causados por aumentos compensatorios en la expresión de los genes asociados a tareas metabólicas en el contexto de la deficiencia de OAT1. Si bien muchas vías metabólicas fueron examinadas mediante análisis de tareas metabólicas basadas tanto en la metabolómica como en la transcriptómica, el uso de ambos enfoques nos brindó información única sobre cómo ciertos transportadores de fármacos participan en la comunicación entre el tejido y el entorno extracelular. Por lo tanto, mientras que los metabolitos del triptófano estaban regulados por ambos transportadores a nivel sistémico, las tareas metabólicas relacionadas con el triptófano dentro del riñón dependían principalmente de OAT1.
Los resultados indican que el túbulo proximal delriñón, donde se encuentran OAT, no es simplemente un conducto para la eliminación renal de metabolitos de triptófano; detecta los metabolitos del triptófano y responde a los cambios en su abundancia intracelular. En conjunto, los datos respaldaron la opinión de que OAT1 desempeña un papel clave no solo en la eliminación de metabolitos relacionados con el triptófano de la circulación al promover su absorción por elriñónpero también que este transportador regula el metabolismo intracelular, en particular el metabolismo del triptófano.
Esto respalda la opinión de que el transporte de quinurenina, quinurenato, antranilato y N-para-milantranilato mediado por OAT es importante parariñónfunción (Fig. 8). Estos cuatro metabolitos pertenecen a la subvía de la quinurenina de degradación del triptófano y, a excepción del quinurenato, están involucrados en la producción de energía celular a través de la síntesis de NAD plus (46). Por lo tanto, es posible que la falta de OAT1 provoque un deterioro del metabolismo celular que puede recuperarse, al menos en parte, mediante la producción de estos metabolitos.
Casi todo el triptófano ingerido se metaboliza en tres subvías principales: quinurenina, serotonina e indol (47, 48). Además de su papel en la producción de NAD plus, la subvía de la quinurenina produce metabolitos que tienen una variedad de funciones tanto en estados sanos como enfermos (46, 49). La vía de la serotonina produce el neurotransmisor serotonina, que desempeña un papel en numerosos procesos fisiológicos, sobre todo como regulador de la función del SNC (50). La vía secundaria del indol, que está mediada por el microbioma intestinal, produce moléculas de señalización que participan en la comunicación entre el huésped y el microbio (51). Sistémicamente, OAT1 y OAT3 modulan la biodisponibilidad de los metabolitos de triptófano de cada una de las tres subvías, aunque la mayoría de los metabolitos provienen de las subvías de quinurenina e indol.
Teniendo en cuenta la gran cantidad de funciones de señalización que tienen los metabolitos elevados, existe la posibilidad de que OAT1 y OAT3 influyan en muchos aspectos de la fisiología. Por ejemplo, el quinurenato activa GPR35, un objetivo farmacológico y un GPCR involucrado en respuestas inflamatorias y enfermedades cardiovasculares (52). Muchos de los metabolitos de triptófano significativamente alterados también son ligandos putativos o establecidos del receptor de hidrocarburos arílicos (AhR) (Tabla 3), un regulador transcripcional que se expresa en casi todos los tejidos que responden a los xenobióticos (53).
Los estudios de metabolómica de los dos ratones knockout mostraron que una función endógena clave de OAT1 y OAT3 es regular los niveles sistémicos de metabolitos de triptófano. Por lo tanto, se esperaría que un fármaco dirigido a OAT1 y OAT3 tuviera un impacto similar en el metaboloma. Como se predijo, el potencial de traducción de nuestros ratones knockout como modelos de DMI fue fuertemente respaldado por los resultados de humanos tratados con probenecid, un fármaco inhibidor de OAT que se usa en todo el mundo para tratar la gota. Varios de los metabolitos de triptófano estaban elevados tanto en el suero de humanos como en el de ratones knockout.
Por lo tanto, existe la posibilidad de que los compuestos elevados en estudios con humanos y roedores se utilicen como biomarcadores para nuevas entidades farmacológicas que pueden inhibir OAT1 y OAT3. Si bien los modelos de ratones knockout (que tienen una expectativa de vida normal) y los humanos tratados con probenecid estaban sanos, algunos de los metabolitos elevados son toxinas urémicas conocidas que aumentan en el suero de humanos que padecen insuficiencia renal crónica y se asocian con resultados negativos (54). , 55). La superposición de metabolitos implicados en aspectos de la ERC y nuestros estudios sugirieron que los OAT pueden desempeñar un papel clave en las manifestaciones de la ERC o su progresión, aunque también es posible que las concentraciones de metabolitos puedan aumentar debido a la pérdida de secreción como resultado de la alteración tisular. daños (56, 57). La ERC también puede conducir a una falla multiorgánica, en parte debido a la acumulación de toxinas urémicas, y esto puede deberse en parte a la absorción en otros tejidos a través de los transportadores de fármacos SLC y ABC (12, 58).
La ruta del metabolismo del triptófano requiere la función coordinada de varios órganos. El triptófano es absorbido por el intestino, modificado por el hígado u otros órganos, y los metabolitos son finalmente transportados por elriñón, en parte a través de la función de OAT1 y OAT3. Convencionalmente, esto se ve simplemente como una vía de eliminación. Nuestros resultados, que indican que las células delriñónresponder a la ausencia de estos metabolitos y moléculas de señalización preparándose para producirlos, sugiere lo contrario. Aunque su papel específico en lariñóntúbulo proximal está mal definido, está claro que muchos de los intermediarios producidos son neurotransmisores y tienen un papel importante en la función del SNC (46, 49, 59, 60). Además de la comunicación entre órganos, el metabolismo del triptófano también refleja la comunicación entre organismos entre el huésped y el microbioma intestinal. De hecho, el suero de ratones libres de gérmenes tiene niveles reducidos de 3-sulfato de indoxilo, indolpropionato y serotonina (61). Además, estudios previos han demostrado que dentro de las células renales OAT1-positivas, el 3-sulfato de indoxil funciona en la señalización celular activando AhR y regulando su propia secreción a través de OAT1 (62). Nuestros hallazgos de que los metabolitos derivados del intestino aumentaron en el suero de los ratones Oat1 KO y Oat3 KO, junto con nuestra demostración de que algunos son ligandos in vitro, brindan apoyo adicional para la importancia de estos transportadores en la regulación de la comunicación entre el huésped y el comensal. organismos En conjunto, nuestros resultados se alinean con la Teoría de Señalización y Detección Remota, que propone que los transportadores de fármacos y las enzimas metabolizadoras de fármacos participan en la comunicación entre órganos e interorganismos a través del transporte y la modificación de moléculas pequeñas para mantener la homeostasis (63, 64). Por lo tanto, es fundamental comprender la gama de funciones fisiológicas endógenas de los transportadores de fármacos sistémica y localmente.
Con datos de metabolómica mejorados, identificamos metabolitos afectados por la ausencia de OAT1 y OAT3 en modelos de roedores y metabolitos afectados por la inhibición de OAT1 y OAT3 en humanos tratados con fármacos inhibidores de OAT. Nuestro grupo utilizó previamente redes de reconstrucción metabólica para predecir la función metabólica e informó varias vías únicas y compartidas reguladas por OAT1 y OAT3 (43, 65). Sin embargo, estos estudios estaban limitados por las primeras versiones de las herramientas de reconstrucción y muy pocos datos de metabolómica. Aquí, utilizando un enfoque diferente, Metabolic Task Analysis puso un énfasis mucho mayor en el papel de OAT1 en el metabolismo del triptófano intracelular delriñón. Nuestro enfoque se puede aplicar para investigar las funciones endógenas de otros miembros de la familia SLC y ABC y construir redes separadas pero superpuestas para todos estos transportadores de fármacos, que se encuentran no solo en ratones sino también en su totalidad y gusanos (20, 66). Dichas representaciones también facilitarán la comprensión del alcance total de los DMI para medicamentos que interactúan con OAT1, OAT3 o ambos, que probablemente van más allá de la simple competencia a nivel del transportador.
Procedimientos experimentales
animales
Todos los protocolos experimentales que involucran el uso de animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de UCSD. Todos los animales fueron manipulados de acuerdo con las Directrices institucionales sobre el uso de animales vivos para la investigación. Los machos adultos WT, Oat1 KO y Oat3 KO se alojaron por separado en un ciclo de luz-oscuridad de 12- h y se les proporcionó acceso ad libitum a alimentos y agua. Estos animales han sido descritos en publicaciones anteriores (26, 27). A los ratones tratados con probenecid se les administró una inyección intraperitoneal diaria de 200 mg/kg de probenecid o PBS durante 3 días antes del sacrificio. La inyección final se administró 2 h antes del sacrificio. Los conjuntos de datos utilizados para este análisis también se han descrito parcialmente (23, 24). El conjunto de datos Oat1 KO se ha estudiado en parte desde una perspectiva quimioinformática, pero no se realizó un análisis detallado de la vía (23). El conjunto de datos Oat3 KO se volvió a analizar y solo se compararon dos grupos (24).
Estudios humanos con probenecid
Todos los protocolos experimentales fueron revisados y aprobados por la Junta de Revisión Institucional y cumplen con la Declaración de Principios Éticos de Helsinki. Se recogieron muestras de sangre entera de 20 individuos (14 mujeres, seis hombres). La edad media fue de 30,85 ± 10,98 y el IMC medio de 24,18 ± 3,52. Participantes que no tomaban ningún medicamento y seguían dietas vegetarianas durante la duración del estudio. Se administró una dosis oral de 1 gramo de probenecid ya las 5 h se volvió a recolectar sangre completa. Cada muestra se mantuvo congelada a –80 grados hasta el análisis metabolómico.
Metabolómica Las muestras de suero humano se almacenaron inmediatamente a -80 grados y se enviaron en hielo seco a Metabolon Inc. Se recolectaron y analizaron muestras de suero de ratón, como se describió anteriormente (23, 24). Para recapitular brevemente, para cada muestra, Metabolon Inc. realizó un perfil metabolómico específico. Se utilizó el sistema MicroLab STAR de Hamilton Company para preparar cada muestra, y se agregaron varios estándares de recuperación para el control de calidad. El suero se precipitó con metanol y se agitó con Glen Mills GenoGrinder 2000 para eliminar las proteínas del suero y liberar las moléculas unidas a esas proteínas. La solución resultante se separó en cuatro muestras más pequeñas. Dos se analizaron mediante espectrometría de masas (MS) de cromatografía líquida de ultrarendimiento (UPLC) de fase inversa (RP) con ionización por electropulverización (ESI) en modo de iones positivos. Una muestra fue analizada por RP/UPLC-MS/MS con modo de iones negativos ESI. Una muestra fue analizada por HILIC/UPLC-MS/MS. El disolvente orgánico se eliminó colocando cada muestra en un TurboVap (Zymark).
Estadísticas
Tanto para muestras humanas como de ratones, los valores brutos se normalizaron a volumen, se transformaron logarítmicamente y los valores faltantes se reemplazaron con el valor más bajo observado para cada compuesto. En las muestras de suero humano, la significación estadística se determinó mediante contrastes ANCOVA que incorporan el IMC y la edad. Para las muestras de suero de ratón, la significación se determinó utilizando la prueba t de dos muestras de Welch con metabolitos que alcanzaron la significación estadística (p menor o igual a 0.05), así como aquellos que se aproximaban a la significación ( 0.05 Menor o igual a p Menor o igual a 0.10) incluido en análisis posteriores. El enriquecimiento se determinó usando la Ecuación 1, donde k es el número de metabolitos significativamente alterados en una subruta, m es el número de metabolitos en una subruta, n es el número de metabolitos significativamente alterados en el conjunto de datos total y N es el número de metabolitos medidos en el conjunto de datos total.
Análisis de tareas metabólicas
Utilizamos el análisis de tareas metabólicas, implementado en el módulo CellFie en GenePattern, para cuantificar lariñónfunciones metabólicas y la influencia de las alteraciones del transportador OAT a partir de datos de expresión génica (41) (es decir, datos de micromatrices de los riñones de Oat1 KO, Oat3 KO y sus controles de tipo salvaje). Este análisis predice la actividad de una colección seleccionada de cientos de tareas que cubren siete actividades metabólicas principales de una célula (generación de energía, nucleótidos, carbohidratos, aminoácidos, lípidos, vitaminas y cofactores, y metabolismo de glicanos) directamente a partir de datos transcriptómicos mediante el uso de genoma- modelos a escala del metabolismo humano. Más específicamente, el cálculo de la actividad relativa de una tarea metabólica (es decir, la puntuación de la tarea metabólica) se basa primero en el preprocesamiento de los datos transcriptómicos disponibles y la atribución de una puntuación de actividad génica para cada gen (67). El modelo a escala del genoma del metabolismo humano se utiliza además para identificar la lista de reacciones requeridas para realizar cada tarea metabólica y, al hacerlo, para identificar la lista de genes que pueden contribuir a la adquisición de una función metabólica basada en las reglas GPR (es decir, , Reglas de reacción de proteínas génicas). Por lo tanto, la puntuación de la tarea metabólica se calcula como la puntuación de actividad promedio de todos los genes que contribuyen a una función metabólica. Al hacerlo, los datos transcriptómicos se pueden usar directamente para cuantificar la actividad relativa de cada función metabólica en una condición específica.
Ensayos de transporte in vitro
embrionario humanoriñón(HEK)-293 células que sobreexpresan de forma estable OAT1 y OAT3 humana (Solvo Biotechnology) se cultivaron hasta la confluencia en medio de Eagle modificado de Dulbecco (Invitrogen) complementado con suero bovino fetal al 10 % y penicilina/estreptomicina al 1 % y se mantuvieron en 5 por ciento de CO2 a 37 C. Las células que expresan OAT1-se seleccionaron en presencia de blasticidina, y las células que expresan OAT3-se seleccionaron en presencia de puromicina. Ambas líneas celulares dieron negativo para la contaminación por Mycoplasma. Antes de los ensayos funcionales, las células se sembraron en 96-placas de pocillos, se incubaron durante 24 h y se complementaron con medios. Los experimentos de captación competitivos se llevaron a cabo incubando células en una solución tampón con una concentración fija de 10 μM de 6-carboxifluoresceína y una concentración diluida en serie del sustrato propuesto a partir de 2 mM. El tampón se eliminó después de 10-min de incubación a temperatura ambiente y las células se enjuagaron tres veces con DPBS. A continuación, se evaluó la fluorescencia FL utilizando un lector de placas fluorescentes FL. Los valores de IC50 se determinaron utilizando GraphPad Prism 8.
Los valores de intensidad fluorescente se normalizaron de modo que el valor más bajo se estableció en 0 por ciento y el valor más alto se estableció en 100 por ciento. Después de la normalización, los datos se ajustaron a un modelo no lineal y el IC50 se determinó utilizando la Ecuación 2.
Luego se calculó Ki para cada metabolito utilizando la ecuación de Cheng-Prusoff (Ecuación 3), con la Km para las células hOAT1 HEK293 derivadas de experimentos previos (68).
Disponibilidad de datos
Todos los datos de metabolómica relevantes se encuentran en el artículo y en el material complementario. Los datos transcriptómicos están disponibles a pedido de snigam@health.ucsd.edu. hipótesis, supervisó el proyecto, diseñó los experimentos y escribió y editó el artículo.
Financiamiento e información adicional—Este trabajo fue apoyado por una subvención de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) a SKN del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales (NIGMS) (R01GM132938). El apoyo a JCG proviene de la beca de capacitación otorgada por el Instituto Nacional de Imágenes Biomédicas y Bioingeniería (NIBIB) (T32EB009380) y un suplemento a R01GM132938. Este trabajo fue financiado en parte por la generosa financiación de NIGMS a NEL (R35GM119850), el Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas (NIAID) a NEL (UH2AI153029), una beca LIFA a AR y una beca a JMG del gobierno de México ( CONACYT) y el Instituto de la Universidad de California para México y Estados Unidos (UC-MEXUS). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los NIH. Algunas figuras fueron generadas usando Biorender. Este artículo está dedicado a la memoria de Vibha Bhatnagar, MD, MPH.
Conflictos de interés—Los autores declaran no tener conflictos de interés con el contenido de este artículo.
abreviaturas—Las abreviaturas utilizadas son: AhR, receptor de hidrocarburo de arilo; ERC crónicariñónenfermedad; DMI: interacción fármaco-metabolito; ESI, ionización por electropulverización; HEK, embrionario humanoriñón; ILA, ácido indol acético; KO, nocaut; RP/UPLC/MS, cromatografía líquida de ultra rendimiento de fase inversa, espectrometría de masas.
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Del 1Departamento de Bioingeniería, 2Departamento de Pediatría, 3Departamento de Biología, 4División de Bioestadística y bioinformática, Departamento de Medicina Familiar y Salud Pública, 5Departamento de Medicina Familiar y Preventiva, 6NovoNordisk Foundation Center for Biosustainability en UC San Diego, y 7Departamento de Medicina, Universidad de California SanDiego, La Jolla, California, EE. UU. Editado
por Mike Shipston
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