La danegaptida previene el daño inducido por TGF 1-en las células epiteliales del túbulo proximal humano del riñón

edmund.chen@wecistanche.com

Resumen:Crónicoenfermedad del riñon(ERC) es un problema de salud mundial asociado a una serie de comorbilidades. La evidencia reciente implica una mayor liberación mediada por hemicanal de trifosfato de adenosina (ATP) en la progresión de la fibrosis tubulointersticial, la principal patología subyacente de la ERC. Aquí, evaluamos el efecto de la danegaptida en el bloqueo de los cambios mediados por hemicanal en la expresión y función de las proteínas asociadas con la progresión de la enfermedad en el epitelio tubular.riñóncélulas. Las células epiteliales primarias del túbulo proximal humano (hPTEC) se trataron con la isoforma beta1 del factor de crecimiento transformante de citoquinas profibróticas (TGF 1) ± danegaptida. La qRT-PCR y la inmunotransferencia confirmaron la expresión de ARNm y proteínas, mientras que una matriz de anticuerpos de citoquinas evaluó la expresión/secreción de citoquinas proinflamatorias y profibróticas. La captación de colorante de carboxifluoresceína y la biodetección de ATP midieron la actividad hemicanal y la liberación de ATP, mientras que la resistencia eléctrica transepitelial se utilizó para evaluar la permeabilidad paracelular. La danegaptida anuló la captación de colorante de carboxifluoresceína y la liberación de ATP y protegió contra los cambios de proteínas asociados con la lesión tubular. El bloqueo de la liberación de ATP mediada por Cx43- fue paralelo a la restauración parcial de la expresión de inhibidores del ciclo celular, adherentes y proteínas de unión estrecha y disminución de la permeabilidad paracelular. Además, la danegaptida inhibió los cambios inducidos por TGF 1-en la expresión y secreción de adipocinas, citocinas, quimiocinas, factores de crecimiento e interleucinas clave. Los datos sugieren que, como modulador de enlaces gap y bloqueador hemicanal, la danegaptida tiene potencial en el tratamiento futuro de la ERC.

Palabras clave:danegaptida; conexina; hemicanal; ATP; enfermedad renal crónica; inflamación; fibrosis; hPTEC; TGF1; riñón, renal

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Introducción

Crónicoenfermedad del riñon(ERC) es un problema de salud creciente asociado con un mayor riesgo de enfermedad cardiovascular y morbilidad [1]. Se estima que afecta al 10 por ciento de la población mundial [2], los factores de riesgo incluyen la edad, la diabetes, la hipertensión, la dislipidemia y la obesidad [3]. La enfermedad se caracteriza por una disminución de la tasa de filtración glomerular (TFG), además de proteinuria, con glomeruloesclerosis, atrofia tubular y fibrosis tubulointersticial (TIF), que son cambios histopatológicos comunes [4]. Culminando en la pérdida de la estabilidad epitelial, la inflamación persistente y el aumento de la deposición de la matriz extracelular [5,6], el tratamiento de la TIF y la ERC avanzada representa una necesidad clínica no satisfecha [3]. En consecuencia, se requieren abordajes terapéuticos urgentes. La expresión y la función alteradas de la conexina (Cx) se han implicado en la patología de varias formas de la enfermedad (como se revisó en [7]), incluida la ERC (como se revisó en [8,9]). Las conexinas son una familia de proteínas unidas a la membrana que se oligomerizan en ensamblajes hexaméricos denominados conexones [10]. Cuando las células vecinas se alinean, las conexiones se acoplan para formar uniones gap, poros continuos a través de los cuales se pueden intercambiar moléculas mensajeras, lo que permite una ruta directa de comunicación [10]. Cuando no se unen, las conexiones forman hemicanales a través de los cuales se pueden liberar moléculas, por ejemplo, trifosfato de adenosina (ATP), en el espacio extracelular local para influir en las células vecinas a través de la activación de los purinorreceptores [11]. La expresión del receptor purinérgico P2X7 (P2X7R) está regulada positivamente en elrenaltúbulos de personas con diabetesenfermedad del riñon[12] y ha estado fuertemente implicado en la progresión de la fibrosis tanto en elriñón[13–17] y en otros tipos de tejidos [18–21]. Como era de esperar, la orientación de la señalización purinérgica ha recibido una atención considerable. Sin embargo, hasta la fecha, los ensayos clínicos no han podido demostrar los efectos beneficiosos del antagonismo de P2X7R en numerosas afecciones inflamatorias, un efecto quizás asociado con la variación genética dentro del receptor [22]. La orientación aguas arriba de la liberación de ATP evitaría estos problemas.

La evidencia relaciona la expresión y/o actividad aberrante de las conexinas con diversas formas de ERC [12,23-26]. Los estudios iniciales de Abed et al. informaron que ratones heterogéneos (Cx43 plus /-), con obstrucción ureteral unilateral (UUO), exhibieron una reducción de la deposición de matriz extracelular (ECM) y una disminución de la inflamación [27], mientras que el mimético específico de Cx43-, GAP{{6} }, fue capaz de inhibir la adhesión de monocitos y atenuar la expresión de colágeno I en el modelo de ratón transgén de renina (RenTG) de ERC dependiente de renina [25]. Más recientemente, identificamos que la isoforma de conexina predominante expresada en el túbulo proximal, Cx43, está elevada en material de biopsia aislado de individuos con nefropatía diabética, una observación paralela a una mayor liberación de ATP mediada por hemicanal en pacientes primarios tratados con TGFp1- células del túbulo proximal [12]. Al evaluar el impacto de los aumentos locales en las concentraciones extracelulares de ATP, determinamos que la comunicación mediada por Cx43- aberrante inicia el desmontaje de los adherentes (p. ej., E-cadherina) y los complejos de unión estrechos (p. ej., Zona Occludens) a través de la activación de P2X7R. Estos efectos, que fueron anulados en un modelo de ratón heterogéneo Cx43 plus /- de UUO [12], sugieren un vínculo claro entre Cx43 y lesión tubular. Si bien la ablación parcial de Cx43 confirma el papel de las conexinas en el inicio de los cambios fenotípicos de la lesión tubular, la intervención farmacológica con el péptido bloqueador de hemicanal Cx435 estableció que la naturaleza protectora de esta actividad disminuida de Cx43 proviene de la inhibición de la liberación de ATP mediada por hemicanal. El uso de péptidos miméticos para subrayar la naturaleza protectora detrás del bloqueo de la actividad del hemicanal se ha informado con éxito en otros modelos de enfermedades, como la retinopatía [28], la neuroinflamación [29], el glioma [30,31] y la degeneración macular relacionada con la edad [32, 33]. En última instancia, los estudios relacionan la actividad alterada de la conexina con el aumento de la inflamación [34-36] y la fibrosis [37-40] y sugieren que la estabilización de la comunicación mediada por hemicanal y/o unión comunicante (GJIC, por sus siglas en inglés) puede retrasar la aparición del daño observado en varios modelos de lesión. En consecuencia, la inhibición de los hemicanales de conexina proporciona un medio atractivo para reducir la inflamación y tiene un interés terapéutico considerable.

La danegaptida ((2S, 4R)-1-(2-aminoacil)-4-benzamidopirrolidina2-ácido carboxílico), también conocida como ZP1609 o GAP-134, es una pequeña dipéptido derivado de rotigaptida (AAP10, ZP123). Originalmente desarrollado como un agente antiarrítmico [41], interactúa con Cx43 [42] y actúa como un potente modificador de enlaces gap [43]. El compuesto ha demostrado propiedades protectoras y antiarrítmicas y ha mostrado previamente efectos significativos en modelos preclínicos establecidos de lesiones cardíacas por isquemia por reperfusión [44,45]. Mientras que los ensayos clínicos de fase 2 en humanos, lamentablemente, no lograron alcanzar su criterio de valoración [46], los estudios de otros grupos han explorado el potencial terapéutico de la danegaptida en otros tipos de tejidos y modelos de enfermedad [41,47–49]. Además, aunque se sabe poco sobre su papel en la modulación de la actividad hemicanal, se ha demostrado que la danegaptida reduce la captación de colorante mediada por hemicanal en las células de glioma C6 [43]. A pesar de esto, queda por confirmar el papel de este compuesto en el bloqueo de la liberación de ATP mediada por hemicanal en otros tipos de tejido.

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El estudio actual investigó la eficacia de la danegaptida para negar la liberación de ATP hemicanal mediada por conexina en células epiteliales del túbulo proximal humano (hPTEC) tratadas con TGF primario 1-, antes de delinear su función protectora contra la expresión y los cambios funcionales comúnmente asociados con la progresión. de fibrosis tubulointersticial. Usando técnicas para determinar los cambios en la expresión (qRT-PCR, inmunocitoquímica, inmunotransferencia, matrices de anticuerpos) y función (biodetección de ATP, captación de colorante, resistencia eléctrica transepitelial, matrices de anticuerpos), nuestros hallazgos demuestran que las concentraciones nanomolares de danegaptide bloquean el ATP mediado por hemicanal Cx liberar y atenuar parcialmente los cambios inducidos por TGF 1-en la expresión de proteínas del ciclo celular (p. ej., p16, p21, ciclina D1) y factores renoprotectores (p. ej., Klotho). Además, la danegaptida reduce los cambios que se observan a menudo en las lesiones tubulares, incluido el desmontaje de las uniones adherentes (incluida la pérdida de E-cadherina) y las uniones estrechas (incluida la pérdida de la zona occludens 1 (ZO-1) y la claudina 2). Es importante destacar que la matriz del perfilador de proteomas demostró la capacidad de la danegaptida para restaurar los cambios en la expresión y secreción de proteínas clave de la matriz extracelular, adipocinas, quimiocinas y factores de crecimiento inducidos por TGF 1. En consecuencia, nuestros datos in vitro sugieren que la danegaptida (50–100 nM ) puede bloquear con éxito la liberación de ATP mediada por hemicanal en hPTEC primarios y proteger parcialmente contra los cambios asociados con la inflamación y la fibrosis, como se observa en la ERC en etapa tardía.

2. Resultados

2.1. La danegaptida no afecta la viabilidad de las células epiteliales tubularesHumanoriñón2 (HK2) se cultivaron en glucosa baja (5 mM) durante 48 h, antes de privarse de suero durante la noche y posteriormente se trataron con la concentración óptima de TGF 1 (10 ng/mL) [12,24] ± danegaptide (50 nM–1 µM) durante 48 h (Figura 1A, n=3). Un ensayo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-bromuro de difeniltetrazolio (MTT) confirmó que ni el TGF 1 (101,9 ± 11,7 por ciento) ni la danegaptida sola alteró la viabilidad celular (95,2 ± 7 por ciento (50 nM), 103 ± 5,7 por ciento (100 nM) y 96,6 ± 5,3 por ciento (1 µM)) en comparación con los controles. No se observó ningún efecto cuando las células tratadas con TGF 1- se coincubaron con danegaptida (104,1 ± 2,2 por ciento (50 nM), 93,4 ± 1,6 por ciento (100 nM) y 89,3 ± 3,7 por ciento (1 µM)). Para corroborar estos datos, se realizó un ensayo con cristal violeta (CV) y lactato deshidrogenasa (LDH). La liberación de LDH en las células tratadas con TGF 1-fue comparable a la de los controles (109,3 ± 11,3 por ciento) y la coincubación con danegaptida no tuvo ningún efecto adicional (106,4 ± 11,6 por ciento (50 nM), 113,9 ± 15,6 por ciento (100 nM) y 113,2 ± 4,3 por ciento (1 µM)). Como era de esperar, la danegaptida sola no alteró significativamente la liberación de LDH en comparación con los controles (104,4 ± 4,3 % (50 nM), 95,3 ± 4,7 % (100 nM) y 92,6 ± 3,3 % (1 µM)). La tinción celular con cristal violeta recapituló estos hallazgos, con datos para TGF 1 (10 ng/ml; 96,9 ± 7,3 por ciento) y TGF 1 más danegaptida (50 nM–1 µM) comparables a los controles (98,2 ± 1,9 por ciento (50 nM) , 97,5 ± 1,8 por ciento (100 nM) y 85,8 ± 5,3 por ciento (1 µM). Por último, la danegaptida sola no alteró la tinción con cristal violeta (98,3 ± 2,5 por ciento (50 nM), 99,6 ± 2,7 por ciento (100 nM) y 98,5 ± 2,2 por ciento (1 µM) de los controles). A la luz de estos datos, se seleccionó una concentración de 50–100 nM para estudios posteriores.

Figura 1. La danegaptida previene los aumentos provocados por TGF 1-en la captación de colorante mediada por hemicanal. En el panel (A), humanoriñón2 (HK2) se cultivaron células en glucosa baja (5 mM) ± TGF 1 (10 ng/ml) ± danegaptida (50, 100 y 1000 nM) durante 48 h y se determinó la viabilidad celular. juzgado. Los resultados se presentan como la media ± SEM (n=3). La incubación con TGF 1 (10 ng/mL ± danegaptide (50–1000 nM)) no alteró 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,{{ 19}}captación de bromuro de difeniltetrazolio (MTT), liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) o tinción con cristal violeta (CV). En los paneles (B) y (C), se utilizó la captación de colorante de carboxifluoresceína para evaluar la actividad hemicanal en células HK2 y células epiteliales del túbulo proximal humano (hPTEC), siendo el grado de carga de colorante directamente proporcional a la apertura. Las células se cultivaron en glucosa baja (5 mM) ± TGF 1 (10 ng/ml) ± danegaptida (50 o 100 nM) durante 48 h. La danegaptida evitó los aumentos provocados por el TGF 1-en la captación de tinte de carboxifluoresceína en células HK2 (panel (B)) y hPTEC (panel (C)). Se produjo una carga de colorante mínima en las células de control, mientras que la carga de colorante aumentó significativamente en las células tratadas con TGF 1. La adición de danegaptida (50 o 100 nM) redujo la captación de colorante, devolviendo la intensidad de fluorescencia FL a los niveles de control. La intensidad se expresa como porcentaje en comparación con los controles bajos en glucosa y es representativa de 3 experimentos separados. Los datos se presentan como la media ± SEM (n=3), con la significación clave indicada (** p < 0,01,="" ***="" p="">< 0,001;="" anova="" unidireccional="" y="" prueba="" posterior="" de="">

2.2. Danegaptide bloquea los cambios provocados por TGF 1-en la captación de colorante mediada por hemicanal en células epiteliales tubularesAnteriormente hemos demostrado que el TGF 1 aumenta la actividad hemicanal mediada por Cx43- y la liberación de ATP de las células epiteliales del túbulo proximal [24]. Se utilizó un ensayo de captación de colorante de carboxifluoresceína para determinar si la danegaptida puede anular la captación de colorante inducida por TGF 1-a través de los hemicanales en células HK2 y hPTEC primarios. Como se esperaba, el TGF 1 (10 ng/mL) aumentó la captación de colorante al 354,9 ± 32,6 % de los controles en células HK2, mientras que la coincubación con danegaptida (50 nM y 100 nM) redujo significativamente la respuesta a 165,5 ± 17,9 por ciento y 147,6 ± 18,1 por ciento, respectivamente (Figura 1B; p menor o igual a 0,001, n=4). La danegaptida sola no alteró la captación del colorante. La captación de colorante de carboxifluoresceína aumentó con TGF 1 (10 ng/ml) en hPTEC primarios (310,8 ± 38,6 % de los controles), una respuesta anulada en parte por la coincubación de danegaptida (100 nM; 145 ± 19,7 %) en comparación con los controles (Figura 1C; p Menor o igual a 0.01, n=4).

2.3. Danegaptide niega la liberación de ATP mediada por hemicanal inducida por TGF 1-en células HK2Determinar si la danegaptida (5{{10}}–100 nM) podría prevenir la liberación de ATP inducida por TGF 1 (10 ng/mL) de hemicanales en células HK2, utilizamos biodetección de ATP [24,50]. TGF 1 (10 ng/mL) aumentó la liberación de ATP de 0.33 ± 0.11 µM a 3.60 ± {{40} }.29 µM (Figura 2A,B,E; p menor o igual a 0.001), un efecto parcialmente anulado por la danegaptida a 50 nM (1.90 ± 0.26 µM; p menor o igual a 0.01 ) y 100 nM (0,79 ± 0,19 μM; p menor o igual a 0,001) (Figura 2D, E, n=3, seis repeticiones/número de muestra). La danegaptida sola no afectó la liberación de ATP (Figura 2C,E), con niveles de ATP registrados en 0,35 ± 0,10 µM (50 nM) y 0,31 ± 0,09 µM (100 nM) en comparación con los controles (Figura 2E).

2.4. Danegaptide revierte los cambios inducidos por TGF 1-en las proteínas del ciclo celular y un marcador de protección Reno en hPTECPara determinar si la danegaptida puede negar la regulación mediada por hemicanal del ciclo celular común y los marcadores renoprotectores, los hPTEC se incubaron con TGF 1 (10 ng/mL) ± danegaptide (100 nM) durante 12 h y la expresión del ARNm del gen candidato evaluada mediante análisis de qPCR. La adición de danegaptida a los hPTEC tratados con TGF 1-retornó la expresión de p16 de 358,8 ± 21,1 por ciento a 193 ± 18,5 por ciento de los controles, la expresión de p21 de 221,8 ± 12,9 por ciento a 142,2 ± 6,2 por ciento y la expresión de ciclina D1 de 253,2 ± 7,7 por ciento a 132,9 ± 15,0 por ciento (Figura 3; p menor o igual a 0,001, n=3). Además, la danegaptida revirtió parcialmente la disminución en Klotho de 43,3 ± 3,8 por ciento a 59,9 ± 11,7 por ciento de los controles (Figura 3, n=3).

2.5. Danegaptide restaura los cambios mediados por TGF 1-en adherentes y proteínas de unión estrecha y permeabilidad paracelular en hPTECEn elriñónla adhesión celular mediada por E-cadherina reducida (ECAD) inicia una serie de eventos que culminan en un fenotipo intermitente asociado con una transformación parcial de epitelio a mesenquima. La iniciación facilita el desmontaje tanto de los adherentes como de los complejos de unión estrecha, lo que culmina en la pérdida de adhesión, la disminución de la comunicación intercelular de la unión comunicante y el epitelio permeable [12,24,51]. Para determinar si la danegaptida puede negar los cambios mediados por TGF 1-en la adherencia y las proteínas de unión estrecha, se incubaron hPTEC con TGF 1 (10 ng/mL) ± danegaptide (10{{41 }} nM) durante 48 h y se evaluó la expresión de proteínas candidatas. Danegaptide restauró parcialmente la expresión de E-cadherina de 33,3 ± 3,3 por ciento a 89 ± 7,6 por ciento de los controles, la expresión de N-cadherina (NCAD) de 224,4 ± 29,6 a 161,9 ± 27,4 por ciento y la expresión de vimentina de 212,9 ± 13 por ciento a 147,3 ± 8,8 por ciento ( Figura 4A; p menor o igual a 0.001, p menor o igual a 0.01 y p menor o igual a 0.001, respectivamente; n {{43} }). La expresión de -catenina permaneció inalterada por el bloqueador hemicanal de 149,2 ± 11,2 por ciento (TGF 1 solo) a 151,6 ± 16,8 por ciento (TGF 1 más danegaptida, Figura 4B; p=NS, n=3). La evaluación de los efectos de la danegaptida en las proteínas de unión estrecha confirmó que el modulador de la unión comunicante restauró parcialmente la expresión de claudina-2 del 44,5 ± 5 % al 74,6 ± 5 % de los controles y ZO-1 del 27,8 ± 11,3 por ciento a 52,8 ± 5,4 por ciento en comparación con los controles (Figura 4B; p menor o igual a 0,05, n=3). Los estudios que examinaron la resistencia eléctrica transepitelial confirmaron que la reducción de la expresión de proteínas de unión estrecha observada con TGF 1 (10 ng/mL) es paralela a una pérdida de resistencia transepitelial de 57,33 ± 1,86 Ω·cm2 a 10 ± 1,53 Ω· cm2 (p Menor o igual a 0.001, n=3). Este aumento de la fuga se corrigió parcialmente mediante la coincubación con danegaptida (36 ± 2,08 Ω·cm2) (Figura 4C; p menor o igual a 0,001, n=3).

2.6. La danegaptida previene la regulación positiva provocada por TGF 1-de las proteínas de la matriz extracelular en hPTECCausada por un desequilibrio entre la formación y la degradación, la acumulación de ECM es un sello distintivo importante de la ERC. El papel del TGF 1 en este proceso está bien establecido [52], y entender cómo contrarrestar estos cambios tiene implicaciones claras para la progresión de la enfermedad. Para examinar el efecto de la danegaptida en los cambios provocados por el TGF 1-en la expresión de las proteínas de la MEC, se cultivaron hPTEC en glucosa baja (5 mM) durante 48 h, se privaron de suero durante la noche y se trataron con TGF 1 (1{{ 28}} ng/mL) ± danegaptide (100 nM) durante 48 h. En comparación con los controles, el TGF 1 aumentó la expresión de las proteínas ECM colágeno I (334,6 ± 30,14 por ciento), colágeno IV (354,5 ± 16,9 por ciento), fibronectina (301,7 ± 50,4 por ciento) y laminina (324,8 ± 36,4 por ciento) (Figura 5A, B; p menor o igual a 0.001, n=3). La coincubación con danegaptida atenuó significativamente estos cambios, restaurando la expresión a 180,7 ± 27,3 por ciento (colágeno I), 164 ± 6,9 por ciento (colágeno IV), 161,3 ± 4 por ciento (fibronectina) y 149 ± 20,4 por ciento (laminina) (p Menos mayor o igual a 0.001; n=3 en cada caso). La danegaptida (100 nM) también redujo los cambios provocados por el TGF 1 (10 ng/mL) en la quinasa 1 ligada a la integrina (ILK1) de 378,9 ± 16,8 por ciento a 251,8 ± 33 por ciento (p menor o igual a 0,001), pero tuvo un efecto mínimo en la metaloproteinasa de matriz 3 (MMP3), reduciendo la expresión de 185,3 ± 19,6 por ciento con la citocina sola a 147,1 ± 12,2 por ciento cuando se coincuba con danegaptida (Figura 5B)

2.7. La danegaptida reduce los cambios provocados por TGF 1-en la expresión de adipocinas, quimiocinas, factores de crecimiento e interleucinas de hPTEC

La respuesta inflamatoria en y alrededor de los túbulos proximales involucra tanto la activación de múltiples tipos de células como la secreción de numerosos marcadores inflamatorios. Específicamente, las quimiocinas solubles, las citocinas y los factores de crecimiento reclutan y activan las células inmunitarias infiltrantes y estimulan los fibroblastos residentes. La activación sostenida de estas células media la fibrosis tubulointersticial. Utilizamos la matriz del perfilador de proteomas para determinar si la danegaptida anula los cambios inducidos por TGF 1-en la expresión y secreción de mediadores inflamatorios clave de proin. Los hoteles primarios se cultivaron, como se describió anteriormente, y se trataron con TGF 1 (10 ng/ml) ± danegaptida (100 nM) durante 48 h. Se proporciona una lista de cambios en el lisado (Figura 6) y el sobrenadante (Figura 7) para 31 proteínas candidatas agrupadas por función principal.

3. Discusión

En 2017, la incidencia mundial de ERC fue de 697,5 millones de casos, y la afección se identificó como la 12.ª causa de muerte en todo el mundo [53]. Hasta la fecha, no existen opciones terapéuticas curativas para la etapa terminalenfermedad renal(ESRD). Además, con las bajas tasas de supervivencia de la diálisis y la escasez mundial deriñóndonantes, existe una necesidad apremiante de desarrollar terapias que puedan prevenir la progresión de la ERC y mejorar la calidad de vida del paciente. En la ERC, la gravedad de la inflamación en el túbulo proximal determina la rapidez con la que seriñónfallará. Contribuido por la activación de múltiples tipos de células, parece, en parte, involucrar la comunicación de célula a célula mediada por conexina [9]. Las conexinas facilitan la comunicación celular directa y local mediada por paracrinos a través de su capacidad para oligomerizarse en conexiones hexámeras. Cuando las celdas vecinas se alinean, las conexiones se acoplan para formar uniones comunicantes [10]. Estos canales continuos proporcionan una ruta directa para la transferencia de información, lo que permite que las células se conecten a una frecuencia particular y sincronicen la actividad. A diferencia de las uniones comunicantes, que normalmente se abren en condiciones fisiológicas, las conexiones no acopladas, también denominadas hemicanales, tienen una baja probabilidad de apertura y se abren en respuesta a una lesión [10]. La actividad hemicanal alterada se asocia con la fisiopatología de múltiples estados patológicos, con evidencia que vincula la comunicación alterada de célula a célula con una mayor senescencia [54], inflamación [34,55,56] y fibrosis [18–21]. Los datos de nuestro propio laboratorio demuestran que la isoforma de conexina predominante en el túbulo proximal (Cx43) está regulada al alza en la ERC avanzada y se correlaciona con niveles elevados de TGF 1 y la gravedad de la fibrosis y la inflamación [24]. Además, esta expresión alterada se traduce en una pérdida de la comunicación intercelular de la unión gap, que se acompaña de una mayor liberación de ATP mediada por hemicanal y cambios indicativos de una lesión tubular temprana. En consecuencia, el bloqueo de la liberación de ATP hemicanal mediada por Cx43-puede representar un objetivo viable para el tratamiento del daño en etapa tardía que se desarrolla en individuos con ERC.

La danegaptida es un pequeño péptido terapéutico que, hasta hace poco, se ha utilizado por su capacidad para restaurar el acoplamiento de enlaces gap en múltiples modelos de lesiones, incluidas la isquemia [43,44] y la retinopatía [49]. Se ha demostrado que la danegaptida bloquea la actividad de los hemicanales y la captación de colorantes en las células de glioma C6 [43]; sin embargo, queda por confirmar el papel del compuesto en el bloqueo de la liberación de ATP mediada por hemicanal, y aún no hay estudios que hayan evaluado los efectos de la danegaptida en pacientes lesionados.riñóntúbulos. En el estudio actual, presentamos pruebas convincentes de que la danegaptida bloquea la liberación de ATP mediada por hemicanal inducida por TGF 1-en células epiteliales primarias del túbulo proximal humano. Además, el compuesto restaurado TGF 1-provocó cambios en la expresión y secreción de proteínas relacionadas con la inflamación y la fibrosis. En la ERC, la fibrosis tubulointersticial se desarrolla en respuesta a diversos cambios morfológicos y fenotípicos, incluida la transición epitelial a mesenquimatosa (EMT), la infiltración de células inflamatorias, la activación de fibroblastos y la remodelación de la matriz extracelular (ECM) [57]. La evidencia reciente sugiere que la senescencia celular puede desempeñar un papel clave en la progresión de la enfermedad crónica.enfermedad del riñon[58], con senescencia vinculada a EMT, un secretoma proinflamatorio y depósito de matriz extracelular [59–62]. La senescencia denota una detención irreversible del crecimiento proliferativo con cambios asociados en la organización de la cromatina, la transcripción de genes y la secreción de proteínas [63,64]. En consecuencia, se sabe que las células senescentes exhiben una mayor expresión de los inhibidores de la cinasa dependiente de ciclina (CDK) (CKI), incluidos p21Cip1 (p21) y p16Ink4a (p16), y una expresión alterada de Klotho renoprotector [65–68]. En el estudio actual, la expresión de ARNm de los inhibidores de CDK p16, p21 y ciclina D1 se elevó significativamente en las células epiteliales tubulares tratadas con TGF 1-, mientras que la proteína antienvejecimiento renoprotectora Klotho demostró una expresión reducida en comparación con los controles. Curiosamente, la expresión de p16, p21 y ciclina D1 mejoró cuando las células se coincubaron con danegaptida. La importancia de esta observación está respaldada por numerosos estudios in vivo [69,70], incluido un trabajo reciente en el modelo de ratón de doble knockout p16 INK4a. Cuando se indujo con UUO para exhibir inflamación intersticial avanzada y fibrosis, estos ratones exhibieron disminución de la apoptosis, senescencia, disminución de los niveles de señalización de TGF 1/Smad y una reducción en la infiltración de células inflamatorias en comparación con los animales de tipo salvaje [70]. Además, las células del túbulo proximal aisladas del modelo UUO exhibieron niveles elevados de p21, cuya supresión es paralela a una reducción en los marcadores comúnmente asociados con EMT [71,72]. Ya se ha establecido un vínculo directo con la senescencia celular y la inducción de EMT [73].

La pérdida de la adhesión celular mediada por E-cadherina es un desencadenante inicial de la EMT, con un aumento concomitante de N-cadherina (el interruptor de cadherina), acompañado por el desmontaje de la unión adherente y la adquisición de proteínas comúnmente asociadas con un fenotipo de fibroblastos, p. , vimentina y proteína específica de fibroblastos [74]. En elriñón, está bien establecido que la lesión tubular provoca una serie de cambios morfológicos y fenotípicos característicos de la EMT parcial, si no total. Nuestros estudios recientes demostraron que los cambios provocados por la glucosa en TGF 1 median el desmontaje de los adherentes y el complejo de unión estrecha mediante la regulación de los cambios en la expresión de proteínas de adherencia (ECAD, NCAD, -catenina) y unión estrecha (ZO-1). Además, la administración in vitro de ATP no hidrolizable disminuyó la expresión de E-cadherina en regiones proximales.riñóncélulas, cuya pérdida fue paralela a una reducción en las fuerzas de ligadura intercelular, disminución de los eventos de ruptura de ataduras y remodelación del citoesqueleto [51]. Mediado por P2X7R, los efectos se revirtieron en el modelo heterogéneo Cx43 plus /- UUO [12]. Sobre la base de estos hallazgos, la eficacia de la danegaptida subraya un papel protector para bloquear la liberación de ATP mediada por hemicanal en la prevención de la expresión alterada de epiteliales clave (ECAD, -catenina, ZO-1, claudina 2) y mesenquimales (NCAD, vimentina) proteínas, cuyas implicaciones son de interés terapéutico.

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La unión adherente se ensambla cuando la cola citoplásmica de la E-cadherina se une a la -catenina, mediando la unión a la red del citoesqueleto y asegurando que se mantengan la polaridad y la arquitectura celular [75]. A pesar de su papel en el mantenimiento de la polaridad celular, el desmontaje de estas uniones permite la liberación de -catenina en el citosol, que cuando es activada por proteínas Wnt u otros reguladores aguas arriba, por ejemplo, quinasa ligada a integrina (ILK), puede trasladarse al núcleo. y regular los efectos específicos de las células. La quinasa ligada a integrina es una serina/treonina-proteína quinasa intracelular que juega un papel fundamental en la regulación de la adhesión celular, supervivencia, proliferación y depósito de matriz extracelular (MEC) [76]. Es importante destacar que la inhibición de ILK atenúarenalfibrosis en múltiples modelos de ERC [77]. En el estudio actual, los aumentos inducidos por TGF 1-en la expresión de ILK1 se restauraron, en parte, cuando las células se coincubaron con danegaptida, un efecto que fue paralelo a una disminución en la expresión de -catenina y proteínas relacionadas con ECM. Curiosamente, aunque la danegaptida no logró alterar significativamente el aumento inducido por TGF 1-en la expresión de -catenina, es importante señalar que la ausencia de un cambio en la expresión no refleja la ausencia de su función dentro de la célula. La vía canónica de Wnt implica la translocación nuclear de -catenina y la activación de genes diana a través de un grupo de factores de transcripción llamado factor de células T/factores potenciadores linfoides (TCF/LEF) [78]. Normalmente, la señalización de Wnt/ -catenina es silenciosa, pero se reactiva después de una lesión en varios modelos diferentes de enfermedad crónica.enfermedad del riñon[79,80]. Además, la señalización aberrante de Wnt/-catenina está altamente asociada con el inicio de la senescencia, un efecto paralelo a la pérdida de expresión de Klotho, una proteína antienvejecimiento que actúa como un regulador negativo de la vía canónica de Wnt [81], y en el estudio actual se reguló a la baja en células tratadas con TGF 1- (Figura 3). En consecuencia, la activación sostenida de la señalización de Wnt/ -catenina está relacionada con la progresión de la fibrosis tanto en elriñóny otros tipos de tejidos [79,82,83]. Una vez trasladada al núcleo, la -catenina se asocia con una mayor expresión del factor de transcripción SNAIL y de la metaloproteinasa de matriz MMP7. Curiosamente, estos eventos están asociados con la represión transcripcional y el desprendimiento de la membrana del dominio extracelular de E-cadherina, el último de los cuales ve un aumento en la reserva citoplasmática de -catenina libre [84]. En consecuencia, la señalización de Wnt es un activador clave de la EMT en condiciones de lesión [85]. Además, con la evidencia de que la señalización de Wnt/-catenina promueve la expresión de numerosos genes, incluidos fibronectina, FSP1, Snail1, MMP7 y ciclina D1, no sorprende que la atenuación de esta cascada de señalización se asocie con una mejorafunción renal, redujo la EMT [86] y disminuyó la inflamación [87] y la fibrosis [80,88]. En consecuencia, podría, en parte, explicar el aumento de expresión y secreción inducido por TGF 1-de proteínas de matriz extracelular (Figura 5), ​​citocinas proinflamatorias y quimiocinas observadas en este estudio (Figuras 6 y 7). El aumento de la deposición de ECM y la secreción de moléculas proinflamatorias son características de la fibrosis tubulointersticial, con diferentes tipos de células, que incluyenrenalSe sabe que las células epiteliales tubulares secretan una gran cantidad de factores que se definen colectivamente como el fenotipo secretor asociado a la ERC (CASP). Caracterizado por numerosas moléculas, incluidas las interleucinas, las proteínas de la matriz extracelular y las quimiocinas, este CASP muestra sorprendentes similitudes con el fenotipo secretor asociado a la senescencia (SASP), con componentes del CASP fuertemente asociados con la patología de la fibrosis tubulointersticial [89]. Cuando se liberan, estos factores proinflamatorios actúan sobre las células sanas vecinas de forma paracrina, lo que impulsa la progresión de la fibrosis en la ERC. Dado que se sabe que muchos factores asociados con el CASP inducen fibrosis en elriñón(p. ej., TGF, interleucina (IL)-1 e interleucina (IL)-6), apuntar antes de estos intermediarios de señalización inflamatoria podría resultar una estrategia alternativa eficaz para el tratamiento de la ERC. Usando una matriz de perfil de proteoma, el sobrenadante celular de las células tratadas con TGF 1 ± danegaptida se incubó en una membrana celular preabsorbida con anticuerpos generados contra proteínas inflamatorias clave. Como se destaca en las Figuras 6 y 7, la incubación conjunta de células con TGF 1 y danegaptida restauró la expresión y secreción de varias proteínas candidatas cuyo papel enenfermedad del riñonestá bien establecido como perjudicial (factor de necrosis tumoral alfa, interleucina 1-alfa, interferón-gamma) o protector (factor de crecimiento de hepatocitos). Además, en la ERC, las quimiocinas solubles, las moléculas de adhesión y los factores de crecimiento reclutan y activan las células inmunitarias infiltrantes y los fibroblastos residentes para mediar la inflamación y la fibrosis en los lesionados.riñón. Los datos de nuestra matriz confirman que la modulación de Cx43 y el bloqueo de la liberación de ATP mediada por hemicanal en las células epiteliales tubulares anula, en parte o en su totalidad, la secreción de muchos mediadores inflamatorios, incluidas las quimiocinas, la proteína quimioatrayente de monocitos (MCP1) y la activación regulada, T normal Cell Expressed and Secreted (RANTES), los cuales están involucrados en el reclutamiento de monocitos. Elevado tanto en humanos como en experimentos.enfermedades renales, la secreción de MCP1 es desencadenada por interleucina-1, factor de necrosis tumoral alfa [90] e interferón-gamma [91], todos los cuales fueron inducidos en nuestro modelo por TGF 1, pero bloqueados cuando se aplicaron junto con danegaptida. Además, también se observó que la danegaptida previene la secreción inducida por TGF 1-de la molécula de adhesión celular intercelular (ICAM1) [92], el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) [93] y el péptido activador de neutrófilos epiteliales (ENA78) [94]. En conjunto, estos se han relacionado con la progresión de la ERC y con otras proteínas patogénicas clave, incluida la dipeptidil peptidasa 4 (DPPIV) [95] y el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) [96], y se han identificado como objetivos terapéuticos potenciales. A pesar de estas observaciones, el análisis de matriz identificó una serie de proteínas a las 48 h, donde la regulación inducida por TGF 1- parecía ser independiente de la liberación de ATP mediada por hemicanal. Como se evidencia por la expresión del ligando FLT3 en el lisado celular, la danegaptida no logró alterar significativamente los cambios inducidos por TGF 1-en la expresión de células enteras. El ligando FLT3 se sintetiza inicialmente como una proteína unida a la membrana, que debe escindirse para convertirse en un factor de crecimiento soluble. En las células tratadas con TGF 1-, se observó un aumento de FLT3L unido a la membrana en comparación con los controles en el lisado celular, una respuesta que no se vio afectada cuando las células se coincubaron con danegaptida. Aunque se sabe poco sobre la enzima implicada en la escisión proteolítica y la liberación de FLT3L, un estudio realizado por Horiuchi et al. demostraron que el desprendimiento de FLT3L y la liberación de la membrana dependen de la metaloproteasa y que este efecto en los fibroblastos depende de la enzima convertidora de TNF (TACE) [97]. Si bien solo podemos especular, es posible que el bloqueo de la liberación de ATP mediada por Cx43-puede atenuar la actividad de una proteína requerida para el desprendimiento de la membrana FLT3 y, por lo tanto, en ausencia de liberación de FLT3L, los niveles de FLT3L en el sobrenadante son significativamente menores en las células tratadas con TGF 1 más danegaptida en comparación con los controles tratados con TGF 1-. Curiosamente, aunque la danegaptida no pareció revertir el aumento inducido por TGF 1-en el lisado de células FLT3L, sí tuvo un efecto sobre la forma secretada de la proteína.

El receptor soluble para productos finales de glicación avanzada (RAGE) es un biomarcador potencial de inflamación y estrés oxidativo [98]. Actúa como un receptor señuelo que evita que los productos finales de glicación avanzada se unan a RAGE unido a la membrana y a los efectos perjudiciales relacionados con RAGE. En el estudio actual, observamos un aumento del 70 por ciento en la secreción de sRAGE con TGF 1, un efecto restaurado al control por danegaptide. sRAGE es funcional y capaz de inducir un efecto cuando se secreta. El potencial de la danegaptida para anular significativamente esta secreción tiene un claro interés terapéutico. Curiosamente, sin embargo, no observamos un aumento en el lisado RAGE a las 48 h con TGF 1 ± danegaptide. Si bien estos experimentos se han realizado en células primarias del túbulo proximal humano, las limitaciones de nuestro modelo pueden tener efectos dependientes de la célula, el tiempo y la concentración. En consecuencia, si bien se necesita una mejor comprensión del mecanismo de acción de la danegaptida, los hallazgos de este estudio proporcionan evidencia inicial importante de los beneficios de usar la danegaptida para negar los cambios inducidos por TGF 1-en los marcadores de inflamación y lesión tubular a través del bloqueo de liberación de ATP mediada por hemicanal. Admitimos que nuestros datos in vitro brindan un modelo minimalista de los eventos multifactoriales que dan lugar a la fibrosis tubulointersticial y recomendamos precaución al traducir estos hallazgos novedosos a la situación in vivo, especialmente cuando los estudios en otras especies y modelos de lesiones han demostrado efectos variables. [41,44,46–49]. Ahora se requieren más estudios para determinar la selectividad de estos hemicanales y la capacidad del fármaco en modelos preclínicos de daño crónico, antes de probar la eficacia en ensayos clínicos en humanos.

4. Materiales y Métodos

4.1. Materiales

Humano clonalriñón2 (HK2) las células epiteliales y las células epiteliales primarias del túbulo proximal humano (hPTEC) se adquirieron de la American Type Culture Collection (ATCC) (LGC Standards). Los suministros de cultivo de tejidos se adquirieron de Invitrogen (Paisley, Reino Unido). La membrana de PVDF Immobilon-FL era de Millipore (Watford, Reino Unido), y el tampón de bloqueo Odyssey y los anticuerpos fluorescentes FL secundarios se adquirieron de LI-COR (Cambridge, Reino Unido). Los anticuerpos para E-cadherina, N-cadherina, ILK1, MMP-3, -catenina, vimentina y ZO-1 se obtuvieron de Cell Signaling Technologies (Hertfordshire, Reino Unido), mientras que claudin-2, Los anticuerpos contra laminina, colágeno I y colágeno IV se obtuvieron de ABCAM (Cambridge, Reino Unido). El anticuerpo de fibronectina se adquirió de Santa Cruz (Santa Cruz, CA, EE. UU.). El hTGF1 recombinante se obtuvo de Sigma (Poole, Reino Unido), al igual que todos los demás productos químicos generales. La danegaptida fue proporcionada por Zealand Pharmaceuticals. Los biosensores de ATP eran de Sarissa Biomedical Ltd. (Coventry, Reino Unido) y los platos de harina de WPI (Hertfordshire, Reino Unido). Los filtros de Transwell se adquirieron de Corning (Nottinghamshire, Reino Unido). El Proteome Profiler Human Cytokine Array Kit era de R&D Systems (Oxfordshire, Reino Unido).

4.2. Cultivo de tejidos

Las células epiteliales primarias del túbulo proximal humano (hPTEC) se mantuvieron en unrenalmedio basal de células epiteliales de la ATCC, suplementado con 0.5 por ciento de suero de ternera fetal (FCS wt/vol, triyodotironina (10 nM), rhEGF (10 ng/mL), hemisuccinato de hidrocortisona (100 ng/mL), rhInsulina (5 µg/mL), epinefrina (1 µM), transferrina (5 µg/mL) y L-alanil-glutamina (2,4 mM), en atmósfera humidificada a 37 ◦C con 5 por ciento de CO2. privación de suero antes del tratamiento.riñón2 (HK2) (pasajes 18–30) se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM)/medio Hams F12, complementado con FCS al 10 % peso/vol, glutamina (2 mmol/L) y factor de crecimiento epitelial (EGF) ( 5 ng/mL), en atmósfera humidificada a 37 ◦C con 5 por ciento de CO2. Las células HK2 se inmortalizaron mediante la transducción de los genes E6/E7 del virus del papiloma humano 16 (HPV-16) y estaban libres de micoplasma. En todos los experimentos, las células se sembraron en DMEM/F12 con bajo contenido de glucosa (5 mmol/L) durante 48 h y luego se privaron de suero durante la noche antes del tratamiento.

4.3. Ensayo de MTT Se realizó el ensayo de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT), como se describió anteriormente, para evaluar los efectos citotóxicos de la danegaptida sobre la proliferación celular [99]. Las células HK2 se sembraron en 96-placas de pocillos y se cultivaron en DMEM/F12 con bajo contenido de glucosa (5 mM) durante 48 h, antes de la privación de suero durante la noche, y luego se estimularon durante 48 h con TGF 1 (10 ng/ml). ) ± danegaptida (50–1000 nM). La medición colorimétrica de la producción de formazán correspondió al número de células viables.

4.4. Ensayo de lactato deshidrogenasaLa liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) en los medios como resultado del daño de la membrana plasmática se usa comúnmente para evaluar la muerte celular o la citotoxicidad. Las células HK2 se sembraron en 96-placas de pocillos y se cultivaron en DMEM/F12 con bajo contenido de glucosa (5 mM) durante 48 h antes de la privación de suero durante la noche. Luego, las células se estimularon durante 48 h con TGF 1 (10 ng/mL) ± danegaptide (50–1000 nM). Se usó el kit II de ensayo de citotoxicidad de LDH (Abcam) para cuantificar la LDH de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

4.5. Ensayo de cristal violetaEste sencillo ensayo se utiliza para medir la densidad relativa de las células adheridas a placas de varios pocillos. El cristal violeta tiñe el ADN y puede cuantificarse colorimétricamente después de la solubilización. Las células HK2 se sembraron en 12-placas de pocillos y se cultivaron en DMEM/F12 con bajo contenido de glucosa (5 mM) durante 48 h, antes de la privación de suero durante la noche, y luego se estimularon durante 48 h con TGF 1 (1{{16 }} ng/ml) ± danegaptida (50–1000 nM). El ensayo se ha descrito anteriormente [99]. Brevemente, las células se fijaron con paraformaldehído durante 10 minutos, se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente (TA) en una solución de cristal violeta al 0,1 por ciento. Después de varios lavados más, la mancha se solubilizó utilizando SDS al 1 por ciento y se midió la absorbancia mediante un lector de placas.

4.6. Transferencia occidentalLa preparación de proteínas citosólicas a partir de células HK2 y hPTEC, su separación mediante electroforesis en gel SDS y su transferencia a membranas de PVDF Immobilon-FL se han descrito anteriormente [12]. Las membranas se bloquearon con el tampón de bloqueo Odyssey (LI-COR) y luego se probaron durante la noche con anticuerpos contra E-cadherina (1:1000), N-cadherina (1:1000), claudina-2 (1:500), ZO -1 (1:1000), colágeno I (1:1000), colágeno IV (1:2000), fibronectina (1:2000), laminina (1:500), ILK1 (1:500), -catenina (1:2000), vimentina (1:500) y MMP3 (1:500). Las bandas se visualizaron con OdysseyFC y se semicuantificaron con ImageStudio (v5.2, LI-COR, Lincoln, NE, EE. UU.).

4.7. Resistencia transepitelialSe sembraron células HK2 (6 × 104 células/mL) en filtros Transwell (12 mm de diámetro, tamaño de poro 0,4 µM; Corning, NY, EE. UU.) y se cultivaron en DMEM/F12 bajo en glucosa (5 mM) para 48 h, privados de suero durante la noche y posteriormente estimulados con TGF 1 (10 ng/mL) ± danegaptide (100 nM) durante 48 h. La resistencia eléctrica transepitelial (TER) se midió utilizando el aparato EVOM (World Precision Instruments, Sarasota, FL, EE. UU.). Se sustrajo de cada lectura de resistencia una resistencia en blanco medida de un pocillo con medio solo.

4.8. Estudios de absorción de colorantesSe sembraron células HK2 y hPTEC en placas fluoradas (22 mm de diámetro) y se cultivaron en DMEM/F12 bajo en glucosa (5 mmol/L) durante 48 h. Después de la privación de suero durante la noche, las células se incubaron con TGF 1 (10 ng/ml) ± danegaptida (50–100 nM) durante 48 h. Para los pasos posteriores, una solución salina balanceada (BSS, pH 7,0) compuesta por NaCl (137 mM), KCl (5,4 mM), MgSO4 (0,8 mM), Na2HPO4 (0,3 mM), KH2PO4 (0,4 mM), NaHCO3 (4,2 mM ), se utilizó HEPES (10 mM) y glucosa (5 mM). Para inducir la absorción del colorante, las células se expusieron a Ca2 plus BSS libre (cero CaCl2 más EGTA (1 mM)) más carboxifluoresceína (200 µM) durante 10 min, seguido de un período de 5 min en Ca2 plus BSS (1,3 mM) más carboxifluoresceína (200 µM). Las placas se lavaron posteriormente con BSS que contenía Ca2+ (12 ml). Las imágenes se adquirieron con una cámara CCD Cool Snap HQ (Roper Scientific, Gottingen, Alemania) y el software Metamorph (Universal Imaging Corp., Marlow, Bucks, Reino Unido). ImageJ se utilizó para cuantificar la captación de tinte, donde se dibujó una región de interés (ROI) alrededor de cada celda (aproximadamente 10-15 celdas/placa) y se midió la intensidad media de píxeles. Se restó un valor de fluorescencia de fondo de cada ROI.

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4.9. Biodetección de ATPSe utilizaron biosensores de ATP (Sarissa Biomedical, Coventry, Reino Unido) en una configuración amperométrica de registro dual simultánea, como se describió anteriormente [12]. Se usó un biosensor nulo para tener en cuenta los artefactos electroactivos no específicos y se restó de la traza de ATP. Se incluyó glicerol (2 mM) en todas las soluciones de registro para permitir la detección de ATP. Las células HK2 se sembraron en cubreobjetos de vidrio (10 mm de diámetro) en DMEM/F12 bajo en glucosa (5 mmol/l) durante 48 h antes de la privación de suero durante la noche. A continuación, las células se incubaron con TGF 1 (10 ng/ml) ± danegaptida (100 nM) durante 48 h. Los cubreobjetos se transfirieron a una cámara que contenía BSS que contenía Ca2+ perfundida a 6 ml/min (37 ◦C) y se dejó durante 10 min para que se aclimatara. Los biosensores ATP y nulo se doblaron y bajaron para que el electrodo quedara paralelo a la monocapa celular. Una vez que se produjo una línea base estable, la perfusión de Ca2 más BSS libre estimuló la apertura del hemicanal. Después de la liberación de ATP, se usó BSS que contenía Ca2+ para cerrar los hemicanales, seguido de una solución de calibración de ATP (10 mM). Las grabaciones se adquirieron a 4 Hz con una interfaz Micro CED (Mark2) utilizando el software Spike (v8.03).

4.10. Matriz de anticuerpos de inflamación,Una matriz de anticuerpos contra la inflamación (RnD Systems) evaluó la regulación inducida por TGF 1-de 31 marcadores inflamatorios. La matriz se realizó siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, los hPTEC se cultivaron en DMEM/F12 con bajo contenido de glucosa (5 mM) durante 48 h, antes de la inanición de suero durante la noche, y luego se estimularon durante 48 h con TGF 1 (10 ng/mL) ± danegaptide (100 nM). Los lisados ​​celulares y el sobrenadante se recogieron y se incubaron durante la noche con membranas prebloqueadas manchadas por duplicado con anticuerpos de captura. Se usó una mezcla de estreptavidina fluorescente/cóctel biotinilado de 800 CW FL para visualizar los complejos de proteína/anticuerpo de expresión usando Odyssey FC y se semicuantificó usando ImageStudio (v5.2, LI-COR).

4.11. PCR cuantitativa en tiempo realEl ARN se extrajo utilizando un mini kit RNeasy (QIAGEN) y se transcribió inversamente (Invitrogen). La PCR en tiempo real (SYBR GreenER, Invitrogen) se realizó con un instrumento StepOne Plus (Applied Biosystems Inc, Foster City, CA, EE. UU.). La expresión de ADNc se obtuvo comparando con una curva estándar de ADNc diluido en serie. Se utilizaron los siguientes cebadores: p16 (adelante: CTCGTGCTGATGCTACTGAGGA, inverso: GGTCG GCGCAGTTGGGCTCC), p21 (adelante: AGGTGGACCTGGAGACTCTCAG, inverso: TCCTCTTGGAGAAGATCAGCCG), ciclina D1 (adelante: TCTACACCGACAACTCCATCCG, inverso: TCTGGCATTTTGGAGAGGAAGTG), Klotho (adelante: CCTCCTTTACCGATGACTAAAATCAG), Klotho (adelante: CCTCCTTTACCGATGACTAAAATCAG), Klotho (adelante: CCTCCTTTACCGATGACTAAAATCAG), Klotho (adelante: CCTCCTTTACCGATGACTAAAATC) y GAPDH (adelante: GTCTC CTCTGACTTCAACAGCG, atrás: ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA). El análisis de la curva de fusión confirmó la especificidad del cebador y comprobó la posible contaminación.

4.12. AnálisisPara todos los experimentos, el control bajo en glucosa (5 mM) se normalizó al 100 por ciento y todas las demás condiciones se compararon con sus respectivos controles. El análisis estadístico se realizó usando una prueba ANOVA unidireccional con la prueba posterior de comparación múltiple de Tukey. Los datos se expresan como la media ± SEM, donde n indica el número de muestra. Un valor de p menor o igual a 0,05 significó significación estadística.