El echinacósido protege contra la 6-disfunción mitocondrial inducida por hidroxidopamina y las respuestas inflamatorias en las células PC12 mediante la reducción de la producción de ROS

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Yue-Hua Wang,1,2 Zhao-Hong Xuan,3 Shuo Tian,1 y Guan-Hua Du1,2

La enfermedad de Parkinson (EP) es un trastorno neurodegenerativo caracterizado por la pérdida progresiva de neuronas dopaminérgicas (DA) en la sustancia negra. La disfunción mitocondrial y las respuestas inflamatorias están involucradas en el mecanismo de daño celular en la EP. La 6-hidroxidopamina (6-OHDA), un análogo de la dopamina, daña específicamente las neuronas dopaminérgicas.equinacósido(ECH) es un glucósido feniletanoide aislado de los tallos deCistanche salsa, mostrando una variedad de efectos neuroprotectores en estudios previos. El presente estudio fue para investigar su efecto contra la neurotoxicidad inducida por 6-OHDA y los posibles mecanismos en las células PC12. Los resultados mostraron que 6-OHDA redujo la viabilidad celular, disminuyó la actividad de oxidación-reducción, disminuyó el potencial de la membrana mitocondrial e indujo la apoptosis mediada por mitocondrias en comparación con las células PC12 no tratadas. Sin embargo,echinacósidoel tratamiento atenuó significativamente estos cambios inducidos por 6-OHDA. Además,echinacósidotambién podría aliviar significativamente las respuestas inflamatorias inducidas por 6-OHDA. Investigaciones posteriores mostraron queechinacósidopodría reducir la producción de ROS inducida por 6-OHDA en células PC12. Estos resultados sugieren que el mecanismo subyacente deechinacósidocontra la 6-neurotoxicidad inducida por OHDA puede implicar atenuar la disfunción mitocondrial y las respuestas inflamatorias al reducir la producción de ROS.

1. Introducción

Enfermedad de Parkinson (EP)es un trastorno neurodegenerativo caracterizado por la degeneración lentamente progresiva de las neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra pars compacta [1]. Aunque las características neuropatológicas de la EP están bien descritas, la etiología aún no está definida. En particular, varias observaciones sugieren que la disfunción mitocondrial está involucrada en la patogénesis de la EP y la degeneración de las neuronas dopaminérgicas [2, 3]. Las mitocondrias contienen muchas enzimas redox y las ineficiencias naturales de la fosforilación oxidativa generan especies reactivas de oxígeno (ROS) [4]. Recientemente, la creciente evidencia de estudios en humanos y animales ha sugerido que la neuroinflamación también contribuye de manera importante a la pérdida neuronal en la EP [5].

La 6-hidroxidopamina (6-OHDA) es específica de las neuronas dopaminérgicas en modelos de roedores intraestriatales y en algunas células [6–11]. La célula PC12 se ha convertido en un modelo celular popular para la investigación de la enfermedad de Parkinson porque esta línea celular posee muchas características de las neuronas DAérgicas. Se ha utilizado como modelo in vitro para el estudio de la EP y para determinar el efecto de agentes protectores y terapéuticos. El echinacósido (Figura 1) es un glucósido feniletanoide aislado y purificado de los tallos deCistanche salsa[12], una planta parásita originaria del noroeste de China, que se utiliza para probar los mecanismos subyacentes del equinacósido contra el daño inducido por 6-OHDA en las células PC12.

2. Materiales y métodos

2.1. Materiales. El echinacósido se obtuvo de los Institutos Nacionales para el Control de Alimentos y Medicamentos (Beijing, China). RPMI-1640 y suero bovino fetal se obtuvieron de Gibco

(Grand Island, Nueva York, EE. UU.). 6-OHDA, MTT, 2,7-diclorodihidrofluoresceína diacetato, yoduro de propidio (PI) y resazurina se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). El kit de ensayo bioluminiscente de ATP se obtuvo de Promega (Madison, EE. UU.). El kit de ensayo de yoduro de 5,5,6,6 -tetracloro-1,1,3,3 -tetraetil benzimidazolil carbocianina (JC-1) se obtuvo del Beyotime Institute of Biotechnology (Haimen, Jiangsu, China). El kit ELISA de citocromo C y el sustrato fluorogénico Ac-DVD-AMC se obtuvieron de Invitrogen (Carlsbad, CA, EE. UU.). Los kits ELISA IL-1 e IL-6 se obtuvieron de Boster Bio-engineer limited company (Wuhan, China). El lector de microplacas Spectramax M5 se adquirió de la empresa Molecular Devices (Sunnyvale, CA, EE. UU.).

2.2. Cultivo y Tratamiento Celular. Las células PC12 se cultivaron en RPMI-1640 suplementado con suero de caballo al 10 por ciento y suero bovino fetal al 5 por ciento. Las condiciones se mantuvieron a 37∘C en una atmósfera humidificada que contenía un 5 % de CO2 [19]. Las células se sembraron en 96-placas de pocillos a una densidad de 2 × 105 células/ml. Después de una confluencia del 80 por ciento, las células se preincubaron con diferentes concentraciones de equinacósido en un medio RPMI-1640 sin suero durante 1 hora. Luego, se añadió 6-OHDA a los pocillos a una concentración final de 100 M y se incubaron durante otro tratamiento. Después del tratamiento, se observaron los cambios morfológicos bajo un microscopio. La viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo MTT [19]. Brevemente, después del tratamiento, se añadió MTT a la concentración final de 0,5 mg/ml a cada pocillo y se incubó durante 4 ha 37°C.

2.3.Ensayo de cambios morfológicos y viabilidad de células PC12. Después del tratamiento, se observaron cambios morfológicos bajo un microscopio. La viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo MTT [19]. Brevemente, después del tratamiento, se añadió MTT a la concentración final de 0,5 mg/ml a cada pocillo y se incubó durante 4 ha 37°C. Luego, se eliminó el sobrenadante y el producto de formazán se disolvió en 100 l de sulfóxido de dimetilo con agitación durante 15 min en un agitador de placas de microtitulación y se leyó la absorbancia a 570 nm usando un lector de microplacas Spectramax M5. Medicina complementaria y alternativa basada en la evidencia

2.4. Ensayo de nivel de ATP intracelular. El nivel de ATP celular se midió con un kit de ensayo bioluminiscente de ATP de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La luminiscencia se controló en un lector de microplacas en el modo de luminiscencia tras la adición de 100 l de luciferina y luciferasa [20].

2.5. Medición de la actividad de oxidación-reducción de las mitocondrias por resazurina. Después del tratamiento, se añadió resazurina a una concentración final de 5 M en los pocillos y se examinó la intensidad de la fluorescencia con una excitación de 530 nm y una emisión de 590 nm [21].

2.6. Medición del potencial de la membrana mitocondrial por JC-1. El potencial de la membrana mitocondrial se midió utilizando el kit de ensayo JC-1 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después del tratamiento, se retiró el medio de cultivo y se cargó con solución de JC-1 durante 15 min a 37∘C en la oscuridad. La intensidad de fluorescencia de la relación rojo/verde se determinó a una excitación de 490 nm y una emisión de 530 nm (monómeros fluorescentes verdes) y 590 nm (agregados fluorescentes rojos), respectivamente [22].

2.7. Cuantificación de la liberación de citocromo C. Los niveles de citocromo C citosólico se midieron utilizando un kit ELISA de acuerdo con las instrucciones del fabricante [23]. Brevemente, después del tratamiento, las células se lisaron y centrifugaron a 1000 g durante 15 min, y luego se recogió el sobrenadante como una fracción citoplasmática y se usó para medir la liberación de citocromo C.

2.8. Determinación de la Actividad de Caspasa-3. La actividad de caspasa-3 se realizó de acuerdo con las referencias con modificaciones [24]. Brevemente, después del tratamiento, se añadió el tampón de lisis a cada pocillo y se centrifugó a 12 000 g durante 10 min. La actividad de caspasa-3 se probó en los sobrenadantes resultantes midiendo la escisión proteolítica del sustrato fluorogénico Ac-DVD-AMC con una longitud de onda de excitación de 380 nm y una longitud de onda de emisión de 460 nm.

2.9. Ensayo de citometría de flujo en células PC12. Después del tratamiento, las células se tripsinizaron, se lavaron dos veces con PBS, se centrifugaron a 1000 r/min durante 5 min y luego se fijaron con etanol al 70 por ciento durante la noche a 4°C. Las células se centrifugaron y se lavaron dos veces con PBS, se resuspendieron en PBS (que contenía 50 g/ml de ARNasaA), se tiñeron con PI a la concentración final de 10 M durante 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad y se leyeron en un citómetro de flujo a 488ºC. excitación nm [10].

2.10. Medición del nivel de IL-1 e IL-6 mediante ensayo ELISA. El medio de cultivo de células PC12 se recogió después del tratamiento y las concentraciones de IL-1 e IL-6 se midieron mediante kits ELISA disponibles en el mercado según el protocolo del fabricante.

2.11. Determinación del nivel de especies de oxígeno reactivo intracelular. Después de la incubación con 6-OHDA, las células se cargaron con H2DCFH-DA 10 M durante 30 min a 37 °C en la oscuridad. La intensidad de fluorescencia de DCF se midió en una excitación

Medicina alternativa y complementaria basada en la evidencia longitud de onda de 495 nm y longitud de onda de emisión de 530 nm en un lector de microplacas [25].

2.12. Análisis estadístico. Todos los datos se expresan como la media ± SD. El análisis estadístico de los resultados se llevó a cabo mediante un análisis de varianza (ANOVA) de una vía, seguido de una prueba. La significación estadística se aceptó en <>

3. Resultados

3.1. Efecto de la equinacoside sobre la morfología y la viabilidad celular en células PC12 dañadas por 6-OHDA. Como se muestra en la Figura 2(A), la viabilidad de las células PC12 no tuvo diferencias significativas a la concentración de 0.1∼10 M del tratamiento con equinacósido para

24 horas Como se muestra en la Figura 2(B), dentro de las 24 h del tratamiento con 6-OHDA solo, la mayoría de las células PC12 habían sufrido cambios morfológicos, como la formación de ampollas en la membrana y el encogimiento de las células. El cotratamiento con equinacósido protegió a las células del daño de 6-OHDA. El ensayo MTT mostró que el tratamiento de células PC12 con 6-OHDA solo dio como resultado una reducción de aproximadamente el 25 por ciento en la supervivencia celular dentro de las 24 h, mientras que el tratamiento conjunto con {{10}}.1 M, 1 M, y el equinacósido 10 M mostró una reducción de la citotoxicidad mediada por 6-OHDA (todas < 0,01,="" figura="">

3.2. Efecto del equinacósido sobre la disfunción mitocondrial inducida por 6-OHDA en células PC12. Los niveles de ATP celular se redujeron significativamente después de 24 h de incubación con 100 M 6-OHDA, mientras que el cotratamiento con 1 Man y 10 M de equinacósido alivió la disminución de ATP mediada por 6-OHDA en los cambios anabólicos en las células PC12 . Los resultados mostraron que el cotratamiento con 1 M y 10 M de equinacósido podría atenuar significativamente el deterioro de la actividad de oxidación-reducción de las mitocondrias inducido por 6-OHDA (ambos < 0,05="" y="" figura="">

Como se muestra en la Figura 3(c), el tratamiento con 100 M de 6- OHDA durante 24 h resultó en una disminución significativa del potencial de membrana mitocondrial en comparación con el grupo no tratado (< {="" {11}}.01).="" sin="" embargo,="" la="" disminución="" del="" potencial="" de="" membrana="" mitocondrial="" inducida="" por="" 6-ohda="" se="" atenuó="" significativamente="" mediante="" el="" cotratamiento="" con="" 0,1="" m,="" 1="" m="" y="" 10="" m="" de="" equinacósido="" (todos=""><>

3.3. Apoptosis de equinacósido mediada por antimitocondrias en células PC12 contra la neurotoxicidad 6-OHDA. Los resultados mostraron que la exposición a 6-OHDA resultó en un aumento del citocromo C citosólico en un 167 % en comparación con el grupo no tratado ( < 0.{{10}}1).="" el="" echinacósido="" a="" la="" dosis="" de="" 0.1="" m,="" 1="" m="" y="" 10m="" podría="" reducir="" significativamente="" la="" liberación="" de="" citocromo="" c="" en="" el="" citosol="" inducida="" por="" 6-ohda="" (="">< 0,05,="">< 0,01="" y="">< 0,01,="" respectivamente;="" figura="">

La actividad de la caspasa{{0}} aumentó aproximadamente 3.3-veces en comparación con el grupo no tratado después de la exposición a 6-OHDA ( < 0.01="" ).="" por="" el="" contrario,="" el="" cotratamiento="" con="" 1="" m="" y="" 10="" m="" de="" equinacósido="" mostró="" una="" disminución="" significativa="" en="" la="" actividad="" de="" la="" caspasa-3="" en="" comparación="" con="" las="" células="" tratadas="" con="" 6-ohda,="" respectivamente="" (ambas="">< 0,05="" y="" figura="" 4(="" b)).pi="" es="" la="" permeabilidad="" de="" la="" membrana="" y="" generalmente="" se="" excluye="" de="" las="" células="" viables.="" por="" lo="" tanto,="" se="" usa="" comúnmente="" para="" identificar="" células="" muertas="" en="" una="" población.="" los="" resultados="" mostraron="" que="" la="" tasa="" de="" apoptosis="" aumentó="" significativamente="" después="" de="" 24="" h="" de="" incubación="" con="" ohda="" 100="" m="" 6-,="" mientras="" que="" el="" cotratamiento="" con="" equinacósido="" 1="" y="" 10="" m="" redujo="" significativamente="" la="" apoptosis="" inducida="" por="" 6-ohda="">< 0,05,="">< 0,01,="" respectivamente,="" figura="">

3.4. Efecto antiinflamatorio del equinacósido en células PC12 inducido por 6-OHDA. Los resultados mostraron que la exposición a 6-OHDA dio como resultado un aumento en el nivel de IL-1 en comparación con el grupo no tratado ( < 0.05;="" figura="" 4(a)).="" sin="" embargo,="" 10="" m="" de="" equinacósido="" podrían="" reducir="" significativamente="" la="" liberación="" de="" il-1="" inducida="" por="" 6-ohda="">< 0,05;="" figura="">

El nivel de IL{{0}} también aumentó significativamente en comparación con el grupo no tratado ( < 0.01).="" sin="" embargo,="" el="" cotratamiento="" con="" 0,1,="" 1="" y="" 10="" m="" de="" equinacósido="" disminuyó="" significativamente="" la="" liberación="" de="" il-6="" en="" comparación="" con="" las="" células="" tratadas="" con="" 6-ohda="" (ambas="">< 0,05="" y="" figura="">

3.5. Efecto de ECH en la producción de ROS inducida por 6-OHDA en células PC12. Las células tratadas con 6-OHDA mostraron un aumento significativo (alrededor de 1,4-veces) de ROS intracelular en comparación con las células no tratadas ( < 0.01).="" este="" aumento="" fue="" significativamente="" atenuado="" por="" la="" coincubación="" con="" 0.1,="" 1="" y="" 10="" mechinacósido="" (="">< 0.05,="">< 0.01="" y="">< 0.01,="" respectivamente;="" figura="" 6)="">

4. Discusión

El equinacósido es uno de los principales constituyentes de los glucósidos feniletanoides extraídos de un famoso equinacósido tradicional que tiene propiedades antiapoptóticas y neuroprotectoras en enfermedades neurodegenerativas [18]. El estudio in vivo informó que el equinacósido tenía efectos neuroprotectores y una mejora del comportamiento en el modelo de ratón de daño neuronal dopaminérgico inducido por MPTP, mientras que investigaciones posteriores revelaron que el equinacósido indujo una regulación a la baja de la caspasa-3 y la activación de la caspasa-8 en MPP plus inducida por la apoptosis de las neuronas granulares del cerebelo [16]. Otro estudio in vivo informó los efectos neuroprotectores del equinacósido en las neuronas dopaminérgicas del cuerpo estriado lesionadas por 6-OHDA [17]. Sin embargo, los mecanismos celulares y moleculares que subyacen a estas acciones no se comprenden completamente, especialmente por su influencia en la función mitocondrial y las respuestas inflamatorias. Por lo tanto, nuestro estudio actual investigó los efectos del equinacósido sobre la función mitocondrial y las respuestas inflamatorias para dilucidar su mecanismo contra la EP. Los resultados mostraron en primer lugar que el equinacósido alivió significativamente la neurotoxicidad inducida por 6-OHDA en las células PC12 mediante la protección de la función mitocondrial y la antiinflamación.

La disfunción mitocondrial se ha relacionado durante mucho tiempo con la muerte de las neuronas dopaminérgicas nigroestriatales en la enfermedad de Parkinson y sus modelos experimentales [26]. Las mitocondrias están profundamente involucradas en la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) a través de los transportadores de electrones de la cadena respiratoria en enfermedades neurodegenerativas [27]. Una amplia variedad de ERO se produce en el curso del metabolismo normal en los sistemas biológicos, pero su acumulación más allá de la

la cantidad requerida puede dañar potencialmente los lípidos, las proteínas y los ácidos nucleicos.

6-OHDA, un análogo de catecolamina, provoca una degeneración específica de las neuronas de la sustancia negra. La neurotoxicidad inducida por 6-OHDA se debe, en parte, a la producción de ROS [28–32].

OHDA conduce a la muerte neuronal al afectar la función de las mitocondrias, incluida la disminución de la producción de ATP, la alteración del metabolismo de ROS y la inducción de la apoptosis [10, 33, 34]. En el presente estudio, nuestros resultados también demostraron que la 6-OHDA dañó la función de reducción oxidativa mitocondrial, disminuyó el potencial de la membrana mitocondrial, indujo la apoptosis mediada por mitocondrias y aumentó la producción de ROS en las células PC12.

La resazurina es un indicador fluorescente que es intermedio solo entre las reducciones finales de oxígeno molecular y la citocromo oxidasa. Por lo tanto, el potencial de oxidación-reducción de la resazurina permite que la cadena respiratoria funcione casi por completo, lo que proporcionará una indicación más precisa y sensible de la función mitocondrial. JC-1 es una sonda sensible al potencial de membrana que se localiza en la membrana mitocondrial interna donde forma monómeros (verde) o agregados (rojo) según el potencial de membrana mitocondrial. Por lo tanto, la resazurina y JC-1 son valiosas herramientas analíticas para examinar la función mitocondrial [35]. El presente estudio indicó que las disminuciones en la actividad de reducción oxidativa mitocondrial y el potencial de la membrana mitocondrial pueden desempeñar un papel importante en la neurotoxicidad dopaminérgica inducida por 6-OHDA. Nuestro resultado también mostró actividad de reducción oxidativa mitocondrial y potencial de membrana mitocondrial. Estos resultados proporcionan que la mejora de la disfunción mitocondrial puede ser una mejor manera de retardar la neurodegeneración dopaminérgica progresiva comúnmente asociada con la EP.

En general, se acepta que la apoptosis celular inducida por 6- OHDA está mediada por una disfunción mitocondrial, caracterizada por la liberación de citocromo C y la activación de caspasa-3 [36]. Un estímulo apoptótico desencadena la liberación de citocromo C de la mitocondria al citosol, donde luego activa la caspasa-3 y otras caspasas corriente abajo. En el presente estudio, los resultados mostraron que las células PC12 expuestas a 100 M de 6-OHDA mejoraron la liberación de citocromo C y que la caspasa inhibía de forma dependiente la liberación de citocromo C y las activaciones de caspasa- 3. Estos resultados sugieren que el equinacósido podría inhibir la apoptosis mediada por las mitocondrias al reducir la liberación de citocromo C de las mitocondrias al citosol y la activación de la caspasa-3.

La inflamación es una característica neuropatológica de los cerebros parkinsonianos y también en modelos experimentales de la enfermedad. Las estrategias terapéuticas orientadas a reducir la inflamación e inhibir la producción de estos factores inflamatorios pueden ser una estrategia neuroprotectora prometedora para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson y afecciones relacionadas [37]. Varios estudios también realizados en el líquido cefalorraquídeo y durante el análisis post mortem en pacientes parkinsonianos revelaron niveles elevados de citocinas, como interleucina-1 (IL-1) e interleucina-6 (IL{{4} }), lo que sugiere la activación de una respuesta proinflamatoria[38, 39]. En el presente estudio, los resultados mostraron que la exposición a 100 Mof6-OHDA indujo la liberación de IL-1 e IL-6 en células PC12. Sin embargo, el tratamiento con equinacósido podría inhibir de forma dependiente de la dosis la liberación de IL-1 e IL-6 inducida por 6-OHDA. Los resultados sugieren que la reducción de las respuestas inflamatorias también está involucrada en los mecanismos del equinacósido contra la neurotoxicidad inducida por 6-OHDA.

En conclusión, los resultados de esta investigación mostraron que el echinacósido pudo bloquear la neurotoxicidad inducida por 6-OHDA en las células PC12, y los mecanismos pueden estar relacionados con la protección mitocondrial y la antiinflamación mediante la reducción de la producción de ROS. La información proporcionada por este trabajo será útil para dilucidar el mecanismo del equinacósido para la lucha contra la EP. Se concluye que el echinacósido puede ser una opción terapéutica prometedora para la prevención y el tratamiento de la EP.

Conflicto de intereses

Los autores han declarado no tener conflicto de intereses

Expresiones de gratitud

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81473383) y el Proyecto Principal de Ciencia y Tecnología Nacional (2012ZX09103101-078; 2013ZX09103-001-008; y 2013ZX09102106).