Efectos del momento de la nefrectomía contralateral y las condiciones isquémicas sobre la fibrosis renal después de una lesión por isquemia-reperfusión renal unilateral
Oct 27, 2023
Introducción
la incidencia deLesión renal aguda(IRA) ha aumentado dramáticamente en todo el mundo en los últimos años [1]. La IRA puede ser causada por trasplante de órganos, postoperatorio bajo perfusión, sangrado, deshidratación, shock y sepsis en la práctica clínica [2]. Estudios epidemiológicos y experimentales recientes han demostrado que la gravedad, la frecuencia y la duración de la IRA están estrechamente asociadas con la incidencia posterior deenfermedad renal crónica(ERC). La fibrosis renal después de una IRA puede provocar ERC o inclusoenfermedad renal terminal(ESKD) [3–5], lo que implica que la IRA y la ERC son síndromes relacionados [6]. Sin embargo, los mecanismos que subyacen a la transición de IRA a ERC siguen siendo desconocidos a pesar de numerosos estudios experimentales y clínicos. Los modelos animales son herramientas importantes para investigar los mecanismos por los cuales la IRA conduce a la ERC. La lesión por isquemia-reperfusión renal (IRI) es una de las principales causas de IRA, y se han desarrollado varios modelos animales de IRA inducida por IRI [7], incluido el modelo IRI bilateral (bIRI), el modelo IRI unilateral con riñón contralateral intacto , el modelo uIRI con nefrectomía contralateral simultánea y el modelo uIRI con nefrectomía contralateral tardía.
El modelo bIRI es menos consistente porque cuando la lesión isquémica de ambos riñones es demasiado leve, no hay cambios fibróticos significativos a largo plazo. Cuando la IRA es demasiado grave, los ratones pueden morir en la fase de lesión aguda. Además, pequeñas diferencias en la lesión de ambos riñones pueden dar lugar a diferencias significativas en su patología renal crónica al cabo de unas semanas [8,9]. El modelo uIRI con nefrotomía contralateral simultánea es similar al modelo bIRI ya que solo queda el riñón lesionado debido a la nefrectomía del otro lado [10]. En el modelo IRI con un riñón contralateral intacto, la fibrosis del riñón isquémico es grave [11,12]. Este modelo es muy consistente y confiable para la observación a largo plazo por parte de los investigadores. Sin embargo, debido a la presencia de un riñón contralateral no dañado, no se puede utilizar para la evaluación de la tasa de filtración glomerular estimada (eGFR), la creatinina sérica (SCr) y el nitrógeno ureico en sangre (BUN) [11-14]. En comparación con los dos modelos uIRI mencionados anteriormente, el modelo uIRI con nefrectomía contralateral tardía supera estos problemas y puede usarse tanto para observaciones a largo plazo después de IRA como para monitorización de la función renal. Por tanto, este modelo es adecuado para estudiar la transición IRA-ERC [15].
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Sin embargo, las diferentes condiciones isquémicas y el intervalo entre la nefrectomía contralateral y la uIRI pueden tener impactos significativos en la progresión y la gravedad de la ERC después de una IRA. Estudios anteriores se han centrado en el efecto de la duración de la isquemia sobre la fibrosis renal post-IRA y no han prestado mucha atención a la temperatura corporal central durante la isquemia. Por ejemplo, Skrypnyk et al. [12] controlaron la temperatura isquémica a 38 C mediante un sistema de baño de agua, con una duración isquémica de 30 minutos, y el riñón contralateral intacto se extrajo 8 días después de la uIRI. El resultado mostró que el riñón isquémico tenía cambios fibróticos significativos 28 días después de la uIRI. Con la misma duración isquémica, Xiao et al. [8] mostraron que se produjeron cambios fibróticos significativos 11 días después de la uIRI cuando la temperatura isquémica se controló a 37 C 38 C y el intervalo de tiempo entre la uIRI y la nefrectomía contralateral fue de 10 días. Algunos investigadores, como Colombaro et al. [14] y Li et al. [16] no mencionaron la temperatura isquémica en sus estudios.
Mientras tanto, pocas personas investigaron el efecto del intervalo de tiempo entre la nefrectomía contralateral y la uIRI en este modelo, lo que dio como resultado resultados muy variables entre los diferentes laboratorios, lo que también afectó dramáticamente a los experimentos posteriores. En este estudio, investigamos los efectos de los principales factores que afectan la fibrosis renal después de una IRA, incluido el intervalo de tiempo entre la nefrectomía contralateral y la uIRI, la temperatura corporal central durante la isquemia y la duración de la isquemia. Nuestro objetivo era proporcionar una referencia para crear un modelo animal apropiado para estudiar la transición AKI CKD.
Materiales y métodos Modelos animales.
Los ratones macho C57BL/6J (de 8 a 10 semanas de edad, aproximadamente 22 g de peso; GemPharmatech Co., Ltd., Nanjing, China) tuvieron acceso gratuito a alimentos y agua en el Centro de Experimentación Animal de la Universidad Médica de Shanxi. Las condiciones de reproducción fueron las siguientes: humedad 40–70 %, temperatura 23 C, limpieza del aire clase 7, ciclo de luz/oscuridad controlado 12- h en condiciones libres de patógenos, irradiación con Co60 y agua purificada. Todos los procedimientos para este estudio fueron aprobados por el Comité de Ética Animal del Segundo Hospital de la Universidad Médica de Shanxi (número de ética: DW2022028).
Protocolos
Teniendo en cuenta que la duración de la isquemia, la temperatura corporal central durante la isquemia y los tiempos de resección del riñón contralateral ileso pueden tener impactos en la gravedad de la IRA y la fibrosis renal posterior, investigamos los efectos de los tres factores anteriores individualmente, con los otros dos fijos. Se realizaron tres experimentos de la siguiente manera.
Protocolo 1: Para observar el efecto del intervalo entre la nefrectomía contralateral y la uIRI sobre la función renal y la fibrosis post-IRA, el tiempo de isquemia del riñón izquierdo se fijó en 24 min y la temperatura corporal central se fijó en 37 C durante la fase renal. isquemia mientras tanto. La resección del riñón derecho se realizó el día 7, el día 10 y el día 14, respectivamente (n=8 por grupo) después de la IRI del riñón izquierdo. Determinamos la duración de la isquemia y la resección renal según los resultados de estudios previos [8,10,12,15] y nuestros resultados preexperimentales. Consulte la Figura 1 (A – C) para ver el protocolo del estudio.
Protocolo 2: Para observar el efecto de la temperatura corporal central durante la isquemia en la transición AKI-CKD, el tiempo de isquemia del riñón izquierdo se fijó en 24 min y el riñón derecho se extrajo 14 días después de la IRI del riñón izquierdo. La temperatura corporal central se controló a 36 C, 36,5 C, 37 C, 37,5 C y 38 C, respectivamente (n=8 por grupo). Consulte la Figura 1 (D) para ver el protocolo del estudio.
Protocolo 3: Para observar el efecto de las duraciones de la isquemia renal en la transición de IRA a ERC, la temperatura corporal central se fijó en 37 C durante la isquemia y se extirpó el riñón derecho 14 días después de la IRI del riñón izquierdo. Elegimos este momento porque la fibrosis renal, que era el cambio típico después de una IRA a una ERC, era muy evidente según los informes [8,10,12,15] y nuestros resultados preexperimentales. El tiempo de isquemia del riñón izquierdo se controló a 21 min, 24 min, 27 min y 30 min, respectivamente (n=8 por grupo). Consulte la Figura 1 (E) para ver el protocolo del estudio.
Todos los ratones fueron sacrificados 8 semanas después de la IRI del riñón izquierdo. Parte del tejido del riñón izquierdo se almacenó a 70 C para el posterior análisis de RT-PCR y Western blot, y la otra parte se fijó en formalina neutra para el análisis histopatológico. Se recogieron muestras de sangre a través del seno retroorbitario para realizar pruebas bioquímicas.
Figura 1. Protocolos de la lesión por isquemia-reperfusión unilateral (uIRI) con nefrectomía contralateral tardía. (A–C): el riñón izquierdo se sometió a IRI el día 0 y la resección del riñón derecho se realizó en diferentes momentos (día 7, día 1 0 y día 14) con la duración isquémica fijada a los 24 min con la temperatura corporal central fijada a 37 C durante la isquemia renal. (D): El riñón izquierdo se sometió a IRI el día 0 y la resección del riñón derecho se realizó bajo diferentes temperaturas corporales centrales (36 C, 36,5 C, 37 C, 37,5 C y 38 C) con el paciente isquémico. el tiempo del riñón izquierdo se fijó en 24 min, y el riñón derecho se extrajo 14 días después del IRI del riñón izquierdo. (E): El riñón izquierdo se sometió a IRI el día 0, y la resección del riñón derecho se realizó en diferentes duraciones isquémicas (21 min, 24 min, 27 min y 30 min) con la temperatura corporal central fijada en 37 C durante la IRI. isquemia y el riñón derecho se extirpó 14 días después de la IRI del riñón izquierdo. Se evaluaron el peso renal, la función renal, la lesión histológica renal y la fibrosis renal hasta el día 56.
Procedimiento quirúrgico
Antes de la cirugía, todos los ratones ayunaron durante 12 h con libre acceso al agua y se les inyectó pentobarbital sódico al 3%, 50 mg/kg por vía intraperitoneal. Durante la anestesia, la temperatura rectal se mantuvo a 36 C, 36,5 C, 37 C, 37,5 C o 38 C, respectivamente, en diferentes grupos experimentales. Para lograr esto, se colocó al ratón con su espalda sobre una almohadilla térmica (CW{{10}}, BARBAROUS GROWTH, Zhejiang, China) en una posición con la cabeza y el cuello extendidos para asegurar que sus vías respiratorias permanecieran sin obstrucciones y los ojos se cubrieron con una gasa salina tibia para evitar que se sequen durante el procedimiento. Después de la anestesia, se afeitó el pelo de la parte posterior izquierda del ratón con el cortapelos. Luego se limpió la piel del área quirúrgica con un hisopo con alcohol al 75%. Generalmente, la temperatura corporal del ratón desciende después del afeitado. El procedimiento quirúrgico se llevó a cabo cuando la temperatura corporal central se volvió constante, lo que podía durar unos 15 minutos. El riñón izquierdo se pudo ver cortando la piel dorsal izquierda 0,5 cm junto a la línea media y 0,5 cm en el borde inferior de la caja torácica del ratón. Luego apretamos el abdomen izquierdo con una mano para sacar el riñón izquierdo de la cavidad del cuerpo, levantamos el riñón con unas pinzas curvas y romas (teniendo cuidado de no dañar el riñón), separamos el pedículo del riñón y lo sujetamos rápidamente, y colocamos el riñón debajo de la piel para mantenerla caliente e hidratada. La isquemia exitosa se caracterizó por un cambio gradual de color del riñón de rojo a púrpura oscuro, que duró 21 min, 24 min, 27 min y 30 min respectivamente, en diferentes grupos experimentales. El color del riñón volvió a ser rojo entre 2 y 5 minutos después de soltar la pinza. Luego cerramos la cavidad abdominal con suturas en capas. Se realizó una incisión en la piel y el músculo dorsal derecho el día 7, el día 10 y el día 14 después de la uIRI, respectivamente, en diferentes grupos experimentales, y se resecó el riñón derecho. Luego cierre la herida con suturas estándar. Después de cada cirugía, se inyectaron 500 l de solución salina por vía intraperitoneal para compensar la pérdida de líquido durante la cirugía. Al mismo tiempo, el ratón se mantuvo sobre una almohadilla térmica durante aproximadamente 2 a 3 h hasta que recuperó la conciencia total antes de ser transferido a la jaula. El grupo simulado no pinza el pedículo del riñón y el resto de las operaciones quirúrgicas fueron las mismas que las del grupo uIRI. Todas las operaciones quirúrgicas fueron realizadas por la misma persona con más de 2 años de experiencia en el funcionamiento de este modelo.
Ensayo de función renal
Los niveles de SCr se midieron mediante el kit de creatinina (Método Jaffe, 100020170, Biosino Biotechnology and Science). Los niveles de BUN se midieron con el kit de urea (Método de ureasa-glutamato deshidrogenasa, Biosino Biotechnology and Science).
Ensayo de peso del riñón
Después de orinar, se midió el peso corporal de los ratones mediante una balanza electrónica de precisión. Los riñones frescos se enjuagaron tres veces con solución salina previamente enfriada y luego se secó el exceso de agua de los riñones con papel de filtro. Se despegaron las cápsulas de riñón sobre hielo y se pesaron los riñones inmediatamente. Se calculó la relación entre el peso del riñón y el peso corporal para evaluar el peso del riñón corregido en mg/g.
Tinción con hematoxilina-eosina (HE) y puntuación de lesión renal
Los tejidos renales neutros fijados con formalina se deshidrataron de forma rutinaria, se incluyeron en parafina, se seccionaron (3 lm) y se tiñeron con HE para observar el daño de los tejidos renales. Se capturaron diez campos seleccionados al azar de la corteza renal de cada sección con microscopía óptica con un aumento de 400. Dos patólogos calificaron por separado la lesión del glomérulo y de los túbulos renales. La lesión tubular se calificó en una escala de {{20}}–4 utilizando los siguientes criterios [17]: 0, sin lesión; 1, que afecta entre el 1 y el 25% del área del riñón; 2, que afecta entre el 26 y el 50% del área del riñón; 3, que afecta entre el 51 y el 75% del área del riñón; y 4, que afecta entre el 75 y el 100% del área renal. El grado de lesión tubular se evaluó de forma semicuantitativa calculando el área de lesión tubular renal. La lesión glomerular se evaluó y calificó en una escala de 0 a 4 según el porcentaje de área de expansión mesangial o esclerosis utilizando los siguientes criterios [17]: 0, glomérulos normales; 1, 1-25% del área lesionada; 2, 26-50% del área lesionada; 3, 51-75% del área lesionada; y 4, 76-100% del área lesionada. La puntuación final de daño glomerular es ¼ 0 (% de glomérulos de grado 0) + 1 (% de glomérulos de grado 1) + 2 (% de glomérulos de grado 2) + 3 (% de glomérulos de grado 3) + 4 (% de glomérulos de grado 4). Se puntuaron más de 50 glomérulos por ratón.
Tinción tricrómica de Masson
Los tejidos renales neutros fijados con formalina se deshidrataron de forma rutinaria, se incluyeron en parafina, se seccionaron (3 µm) y se tiñeron con tricrómico de Masson para observar la fibrosis renal. En los cortes teñidos con tricrómico de Masson, se capturaron veinte campos no superpuestos de corteza renal con 200 aumentos. Se utilizó el software de análisis de imágenes Image-Pro Plus para la medición y el análisis automáticos. El porcentaje del área fibrótica se utilizó para determinar el nivel de fibrosis intersticial renal [8].
RT-PCR
Se extrajo el ARNm total del tejido renal de cada grupo mediante Trizol y se midió su concentración, luego se convirtió en ADNc (kit de transcripción inversa Taka). Se utilizó el método de fluorescencia Taqman (TB Green Premix Ex Taq II Real-time RT-PCR) para cuantificar las expresiones de ARN de fibronectina (FN) y colágeno I (COL-I) en tejidos renales. Se utilizaron cebadores específicos para FN (directo: 50 -GGAGTGGCACTGTCAACCTC-30 e inverso: 50 -ACTGGATGGGGTGGGGAAT-30) y COL-I (directo: 50 -ACATGTTCAGCTTTGTGGACC{ {9}} y reverso: 50 -TAGGCCATTGTGTATGCAGC-30 ) [18] (proporcionado por Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China). Las condiciones de amplificación son las siguientes: 95 C durante 30 s, 95 C durante 5 s, 60 C durante 30 s, 40 ciclos; 95 C durante 10 s, 65 C durante 5 s y 95 C/5 C. Después de analizar las curvas de amplificación y las curvas de solubilidad de los productos, se determinaron los niveles relativos de ARNm mediante el método CT comparativo (2-DDCt) con 18SrRNA (adelante: 50 - CGGACACGGACAG GATTGACAG-30 y reverso: 50 -AATCGCTCCACCAACT AAGAACGG-30) como referencia interna.
mancha occidental
Se utilizó tampón de lisis del ensayo de radioinmunoprecitación (RIPA) para lisar los tejidos renales y la concentración de proteína se determinó mediante el método BCA. Se utilizó electroforesis en gel en gradiente para separar las proteínas de 50 lg de muestras. Luego las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Después de bloquear con leche descremada al 5% durante 2 h, las membranas se secaron durante la noche a 4 C con anticuerpo monoclonal anti-ratón de conejo contra la actina del músculo liso a (a-SMA) (1:1000, No.19245, Cell Signaling Technology). ), FN (1:1000, No.ab2413, ABCam) o COL-I (1:1000, No.72026, Tecnología de señalización celular), respectivamente. Al día siguiente, las membranas se volvieron a calentar a temperatura ambiente durante 0,5 h. Después de lavarlas con TBST, las membranas se incubaron con IgG anticonejo de cabra AffiniPure conjugada con HRP (H + L) (1:1000, n.º BA1054, tecnología biológica BOSTER) durante 2 h. Después de lavarlos nuevamente con TBST, se tiñeron con reactivo de quimioluminiscencia ECL de ultra alta sensibilidad para visualizar las inmunotransferencias. La actina β se midió en la misma membrana que la referencia interna. Las expresiones de proteínas se determinaron cuantificando las expresiones relativas de las proteínas diana frente a la b-actina.
Datos y análisis estadístico.
Todos los datos examinados se expresan como media ± desviación estándar. Se accedió a las comparaciones entre los dos grupos mediante una prueba t independiente. Se accedió a las comparaciones entre múltiples grupos mediante ANOVA unidireccional cuando la distribución de los datos es normal y la varianza es homogénea; se utilizó el ANOVA de Welch para evaluar la significación estadística cuando la varianza era heterogénea, seguido de la prueba post hoc de Tukey para comparaciones múltiples. Todos los análisis estadísticos se realizaron con el software GraphPad Prism 8.0. p < 0.05 se consideró estadísticamente significativo.
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