Efectos de las presiones de perfusión sobre la pérdida de podocitos en el riñón de ratón perfundido aislado

edmund.chen@wecistanche.com

Resumen

Antecedentes/Objetivos: Los podocitos se pierden en la mayoría de las enfermedades glomerulares, lo que lleva a la glomeruloesclerosis y progresivaenfermedad del riñon. En general, se supone que los podocitos están expuestos al flujo de filtración y, por lo tanto, a fuerzas de cizallamiento significativas que impulsan su desprendimiento de la membrana basal glomerular (GBM). En este contexto, el borramiento del pie se ha propuesto como una posible respuesta adaptativa para aumentar la adhesión de los podocitos a la GBM. Métodos: hemos probado estas hipótesis utilizando limpieza óptica y análisis morfométrico dimensional 3-de alta resolución en el murino perfundido aisladoriñón.Investigamos la dinámica del desprendimiento de podocitos a diferentes presiones de perfusión (50, 300 y más de 450 mmHg) en ratones sanos jóvenes o viejos (20 vs. 71 semanas de edad), o ratones inyectados con un suero anti-GBM para inducir pie global. borrado del proceso. Resultados: Los resultados muestran que los podocitos sanos en ratones jóvenes están fuertemente adheridos al GBM e incluso las presiones supramáximas no causaron un desprendimiento significativo. En comparación con ratones jóvenes, en ratones viejos y ratones con nefritis anti-GBM y borramiento del proceso del pie, ya se había producido una pérdida progresiva gradual de podocitos antes de la perfusión. Las altas presiones de perfusión dieron como resultado una pérdida adicional relativamente menor de podocitos en ratones de edad avanzada. En ratones con nefritis anti-GBM, se produjo una pérdida adicional significativa de podocitos en este punto de tiempo temprano al aumentar las presiones de perfusión a 300 mmHg o más. Conclusión: Este trabajo proporciona la primera evidencia experimental de que los podocitos son extraordinariamente resistentes a las presiones de perfusión agudamente aumentadas en un ex vivo aisladoriñónmodelo de perfusión Solo en la enfermedad glomerular, un número significativo de podocitos lesionados se desprendieron luego de aumentos agudos en la presión de perfusión.

Palabras clave:hipertensión glomerular; hiperfiltración glomerular; Estres mecanico; Progresión; enfermedad renal cronica

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Introducción

La hipertensión glomerular y la hiperfiltración dañan el glomérulo y conducen a una enfermedad glomerular progresiva. Se cree ampliamente que el aumento de la presión de perfusión expone el penacho a un mayor estrés mecánico que desafía la adhesión de los podocitos a la membrana basal glomerular (GBM), lo que contribuye a su desprendimiento [1, 2]. Los podocitos son células posmitóticas altamente diferenciadas, esenciales para una barrera de filtración glomerular intacta. La pérdida de podocitos probablemente sea el resultado del desprendimiento de células viables de la GBM en lugar de la apoptosis o la necrosis [3-6], ya que ha sido posible cultivar podocitos recuperados de la orina de los pacientes [4]. El desprendimiento de podocitos viables del GBM puede deberse a mecanismos de unión deteriorados o fuerzas altemecánicas. La unión deteriorada al GBM puede deberse a una lesión celular o a una expresión reducida de moléculas de adhesión y se asocia principalmente con enfermedades glomerulares inflamatorias. Con respecto a las fuerzas mecánicas relevantes para el podocito, existen dos determinantes clave, a saber, la presión de filtración y el flujo de filtrado [7-9]. La presión de filtración genera tensión en la pared circunferencial y actúa como una fuerza de distensión en el GBM. Las variaciones en la presión hidrostática transmural son compensadas de manera efectiva por la capacidad de la GBM para actuar como una membrana elástica y expandirse o contraerse en el área superficial [8, 10]. Por otro lado, el flujo de filtrado a través de la GBM ejerce fuerzas tangenciales sobre la superficie de los podocitos, es decir, tensión de cizallamiento. Sabemos por estudios in vitro que los podocitos son muy susceptibles a la tensión de cizallamiento que se desprende de su sustrato cuando se exponen a tensiones de cizallamiento superiores a 0,025 Pa [11] y adoptan un fenotipo intermedio que puede ayudarlos a contrarrestar las fuerzas derivadas del flujo [12]. Aún no está claro si la hipertensión glomerular afecta a los podocitos a través de un aumento de la presión de filtración y/o un aumento de la filtración. En este estudio, proporcionamos el primer análisis de la capacidad de los podocitos para resistir el aumento de las fuerzas mecánicas en un modelo ex vivo. La pérdida de podocitos se cuantificó con alta resolución mediante limpieza de tejido y 3-análisis morfométrico dimensional en ratones jóvenes y sanos

Materiales y métodos

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las pautas de la ley alemana para el bienestar de los animales y fueron aprobados por Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen (Az 84-02.04. 2015.A469). Los ratones se alojaron en una instalación específica libre de patógenos con libre acceso a comida y agua y un ciclo de día/noche de 12- horas. La reproducción y el genotipado se realizaron de acuerdo con los procedimientos estándar. Los ratones Pod-rtTA/LC1/R26R/H2BeGFP en un fondo genético FVB/N se han descrito antes [13]. Para activar la expresión transgénica de Pod-rtTA-eGFP, los ratones recibieron doxiciclina a través del agua potable ad libitum durante 7 días (2 g/l, 5 % de sacarosa, protegidos de la luz) seguido de un período de lavado de 1 semana según informes anteriores. La nefritis anti-GBM se indujo mediante una única inyección intraperitoneal de 5 mg/g de suero nefrotóxico de peso corporal como se describió previamente [14].

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Perfusión renal

el aisladoriñónmodelo de perfusión se utilizó como se describe en otra parte [15]. Brevemente, los ratones fueron narcotizados con una inyección intraperitoneal de xilazina/ketamina (0, 1 ml/10 g de peso corporal ip), y luego los riñones fueron perfundidos con una solución de Krebs-Henseleit modificada compleja (Tabla 1) complementada con 5 por ciento de albúmina de suero bovino (BSA) a 37 grados para imitar el entorno fisiológico durante el experimento. Vasodilatación máxima de lariñónla vasculatura se indujo mediante 1. inyección subcutánea de verapamilo (50 µl) inmediatamente después de la inducción de la anestesia y 2. adición de papaverina a la solución de perfusión. Después de la perfusión inicial durante 5 minutos a 50 mmHg, se inyectó una lectina marcada con fluorescencia (Communis I - RCA120; Vector Laboratories: RL-1082; 4 ul en 986 ul de solución salina) para marcar las células endoteliales.Riñonesfueron perfundidos durante 5 minutos adicionales con la solución de Krebs-Henseleit modificada con 5 por ciento de BSA. Después de eso, la izquierdariñónque sirvió como control emparejado en cada experimento se eliminó después de la ligadura cuidadosa de la izquierdarenalrecipientes, cortados en rodajas y sumergidos directamente en paraformaldehído (PFA) al 3 por ciento en solución salina tamponada con fosfato (PBS). La derechariñón was perfused either for additional 5 minutes at 300 mmHg or with supramaximal pressure (>>300 mmHg, se estimó que las presiones de filtración estaban muy por encima de 400 mmHg), aplicado manualmente, volumen total de 50 ml de solución de perfusión. losriñonesfueron perfundidos con una presión constante de 50 mmHg o 300 mmHg usando una bomba controlada por presión (Universal Perfusion Systems UP-100, Hugo-Sachs Electronics, Alemania). entonces la derechariñónse retiró, se cortó en rodajas de 2 mm y se sumergió en paraformaldehído al 3 por ciento (PFA) en solución salina tamponada con fosfato (PBS).

Imágenes 3D y análisis computacional sumergido en PFAriñónlos cortes se incubaron en un agitador mecánico durante 5 días a temperatura ambiente. Posteriormente, las muestras fijadas se lavaron en PBS 1x y se colocaron en un agitador mecánico durante la noche a temperatura ambiente.RiñónLuego, las rebanadas se colocaron en etanol al 100 por ciento de alto grado (Merck; 100983) durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación suave (al menos 1 cambio a etanol fresco), seguido de inmersión directa en cinamato de etilo (ECi) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO; 112372) y se dejaron durante la noche en un agitador suave a temperatura ambiente bajo protección de la luz. La translucidez del tejido se logró en menos de 1 hora. Para los microscopios verticales, utilizamos cámaras desechables construidas internamente como se describió anteriormente [16]. La mayoría de los experimentos se realizaron con un 2-microscopio de fotones (LaVision BioTec TriMScope, "Medizinische Fakultät RWTH Aachen, IZKF Aachen, Core Facilities). El software de imágenes de Fiji se utilizó para moverse a través del eje Z de cada pila de secciones ópticas en serie. y para aislar glomérulos individuales a través de cultivos 3D [16] 40 glomérulos porriñón(20 subcorticales y 20 yuxtamedulares) fueron seleccionados para el análisis. Así, en total se analizaron 1200 glomérulos en este estudio para obtener resultados con suficiente precisión. Los podocitos se identificaron como células eGFP plus. La cuantificación del volumen capilar, el volumen glomerular, así como el número de núcleos (puntos) y el volumen se realizó utilizando un software de análisis y representación 3D (Imaris v9.1; Bitplane AG, Zúrich, Suiza) La distancia de los podocitos desde el polo vascular se calculó utilizando Bitplane XTension "Punto más cercano. Distancia". La cuantificación automatizada de podocitos se realizó como se describió anteriormente [17]. El análisis de imágenes se realizó con Imaris (Biplane AG Zurich, Suiza). Cada glomérulo fue definido por su arteriola aferente marcada con lectina. 20 subcorticales y 20 yuxtamedulares (definidos por su distancia a la superficie cortical).

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Microscopía óptica e inmunofluorescencia

Para microscopía óptica, el 4 por ciento tamponado fijado en formalinariñónlos fragmentos se deshidrataron, se incluyeron en parafina y se tiñeron con ácido peryódico de Schiff (PAS). El porcentaje de glomérulos anormales/lesionados se calculó con base en la identificación de 50 cortes transversales glomerulares representativos por ratón seleccionado durante un recorrido sistemático por elrenalcorteza. Nuestro protocolo de inmunofluorescencia estándar [18] se realizó en secciones incluidas en parafina de 2 μm. Se utilizaron los siguientes anticuerpos: anti-GFP policlonal de pollo (ab13970; Abcam), anti-sinaptopodina monoclonal de ratón (sc-515842; Santa Cruz Biotechnology), anti-p57 de ratón policlonal de conejo (sc-8298; Santa -Cruz Biotechnology), conejo policlonal anti-WT1 (sc-192; Santa-Cruz Biotechnology), burro Cy2 anti-pollo (703-225-155; Dianova, Hamburgo, Alemania), Alexa Fluor546 cabra anti-ratón IgG1 (A-21123; Thermo Fischer), burro policlonal anti-conejo AF555 (A31572; Life Technologies, Carlsbad, CA).

Microscopio de electrones

Se fijaron pequeños trozos de la corteza en solución de Karnovsky y se incrustaron en Epon (Serva, Heidelberg, Alemania). Las secciones ultrafinas se examinaron con un microscopio electrónico de transmisión ZEISS Leo 906 a 60 kV con un aumento de 3597-6000x. Las muestras se lavaron en fosfato de Soerensen 0,1 M (Merck, Darmstadt, Alemania), se fijaron posteriormente en OsO 4 al 1 % (Roth, Karlsruhe, Alemania) en tampón de sacarosa al 17 % (Merck, Darmstadt, Alemania) y se deshidrataron mediante series ascendentes de etanol ( 30, 50, 70, 90 y 100 por ciento) durante 10 min cada uno. El último paso se repitió 3 veces. Los especímenes deshidratados se incubaron en óxido de propileno (Serva, Heidelberg, Alemania) durante 30 min, en una mezcla de resina Epon (Serva, Heidelberg, Alemania) y óxido de propileno (1:1) durante 1 h y finalmente en Epon puro durante 1 h. La polimerización con epón se realizó a 90 grados durante 2 horas. Las secciones ultrafinas (70-100 nm) se cortaron con un ultramicrótomo (Reichert Ultracut S, Leica con un cuchillo de diamante (Leica) y se recogieron en rejillas de Cu/Rh (HR23 Maxtaform, Plano, Wetzlar Alemania). El contraste se mejoró con tinción con acetato de uranilo al 0,5 por ciento y citrato de plomo al 1 por ciento (ambos EMS, Munich, Alemania) Las muestras se observaron a un voltaje de aceleración de 60 kV usando un microscopio electrónico de transmisión Zeiss Leo 906 (Carl Zeiss, Oberkochen, Alemania).

análisis estadístico

Los análisis estadísticos se realizaron con el software GraphPad Prism v8. Todos los valores se expresan como medias ± SD. Para una comparación de 2 grupos, se utilizó una prueba t. La comparación de varios grupos se realizó mediante análisis de varianza; Se utilizó la corrección post hoc de Tukey para comparaciones múltiples. Todas las pruebas fueron 2-con cola y la significación estadística se definió como P <>

Resultados

Método semiautomático para determinar el número de podocitos por glomérulo Se estudiaron tres grupos, es decir, ratones jóvenes y viejos sanos y ratones con glomerulonefritis anti-GBM (♂:♀ 1:1). Los ratones jóvenes y sanos tenían 15-21 semanas de edad, mientras que los viejos (envejecidos) tenían 74 semanas. Se indujo el borramiento global del proceso del pie en ratones de 14-20 semanas de edad mediante una sola inyección de suero anti-GBM 3 días antes de establecer el perfundido aislado.riñónmodelo (Fig. 1A), como se describió previamente [19].

Para determinar la influencia de la presión de perfusión intrarrenal en los podocitos,riñonesfueron sometidos a diferentes presiones de perfusión en los aisladosriñónmodelo de perfusión Primero, ambosriñonessiempre fueron perfundidos a 50 mmHg durante 5 min. Para probar si nuestra solución de perfusión preservó la integridad del glomérulo en el viable no fijadoriñones, se perfundieron 2 ratones a una presión constante de 100 mmHg durante 90 min. La perfusión, el flujo urinario (25 µl/min/gr de peso corporal), así como el aclaramiento de inulina (22 µl/min) se mantuvieron estables durante todo el tiempo (Fig. 1 complementaria; para ver todo el material complementario, consultewww.cellphysiolbiochem.com).En ratones experimentales, después de la perfusión inicial a 50 mmHg, la izquierdariñón was removed and served as a control in all experiments. Next, constant pressure of 300 mmHg or a pressure significantly higher than 300 mmHg (>>300 mm Hg; presión de filtración supramáxima de alrededor de 450 - 500 mmHg) se aplicaron a la derecha restanteriñóndurante 5 min. (Fig. 1B). En el aislado perfundidoriñones, los podocitos se identificaron mediante marcado nuclear con eGFP-histona en nuestros ratones transgénicos que expresan eGFP bajo el promotor de podocina (eGFP: ratones Pod-rtTA). El número de podocitos se cuantificó usando una combinación de este marcaje metabólico in vivo y morfometría 3D (Fig. 1C).

Pérdida de podocitos en ratones sanos y envejecidos

Healthy mice contained 87.46 ± 5.66 (SD) podocytes per glomerulus at baseline (i.e.at physiological perfusion pressure of 50 mmHg) (Fig. 2A). Juxtamedullary glomeruli were larger than those in the outer cortex (Supplementary Fig. 2), but this was not associated with higher podocyte numbers (87.0± 23.65 vs. 90.1 ± 18.49, respectively, Fib 2B). No differences in the number of podocytes related to sex were observed (see below). In young mice, there was no significant loss of podocytes at high (300 mmHg) or maximal (>>300 mmHg) perfusion pressures (85.62 ± 10.83 and 81.98 ± 6.45 podocytes per glomerulus, respectively) (Fig. 1A). On PAS sections, mild histological changwere observed particularly in aged mice (Fig. 2A), which were independent of perfusion pressures. In addition, tubular dilatation and interstitial edema were apparent as a result of perfusion. In humans, older age (53 ± 10 years) has been associated with absolute and relative podocyte depletion [20]. Compared to young mice, our mice aged 72 weeks contained significantly lower numbers of podocytes per glomerulus at baseline (52.81 ± 13.8 SD), indicating that about 40% of the podocytes had been lost. Perfusion at high or maximal pressures resulted in only a very mild reduction of podocyte numbers (48.65 ± 16.8 SD and 41.06 ± 17.7 SD, respectively). Because of the precision of the counting method (absolute podocyte numbers in 40 glomeruli per mouse) [21], the loss of podocytes of 7.9% and 22% after perfusion with 300 or >>300 mmHg respectivamente en comparación con la línea de base sugiere que este aumento menor en la pérdida de podocitos con una presión más alta no es un hallazgo coincidente. En las secciones PAS, se observaron cambios glomerulares leves en ratones envejecidos al inicio del estudio (expansión mesangial y esclerosis ocasional, Fig. 2F). A

Pérdida de podocitos después de una lesión aguda

Se aplicó suero anti-GBM a ratones jóvenes sanos para inducir lesiones significativas y específicas en los podocitos. En el punto de tiempo muy temprano (es decir, 3 días) después de la inducción de glomerulonefritis anti-GBM, se observó borramiento generalizado del proceso del pie en todos los glomérulos mediante microscopía electrónica de transmisión (Fig. 3A-D). En perfusión aisladariñonesobtained from these mice, at baseline (i.e. perfusion with 50mmHg) podocyte numbers per glomerulus were reduced by 20% compared to controls (69.76 ± 7.07 vs 87.46 ± 5.66, respectively) (Fig. 3E). Perfusion with higher pressures (300 and >>300 mmHg) resulted in significant further reductions of podocyte numbers per glomerulus (50.84 ± 7.82 and 53.18 ± 4.26, respectively), i.e. 27% and 24% additional reduction (Fig. 3E). When analyzing individual glomeruli, the anti-GBM mice, perfusion with >>300 mmHg causaron más del 80 por ciento de pérdida de podocitos en una minoría de los glomérulos (Fig. 3E). Esto está en línea con la naturaleza focal del modelo de enfermedad anti-GBM. Dentro de los glomérulos yuxtamedulares, la pérdida de podocitos fue más pronunciada en comparación con los glomérulos subcorticales (56,66 ± 16,9 y 47,35 ± 17,07, respectivamente) (Fig. 3F)

By transmission electron microscopy (TEM), specific changes were observed after high perfusion pressures, in particular focal podocyte detachment from the GBM and denuded basement membrane (Fig. 3D). Cellular debris was present within the capillaries as well as within Bowman's space (>>300 mmHg); el endotelio no mostró cambios significativos. La tinción PAS identificó dilatación tubular. Tres días después de la inyección de suero anti-GBM, aún no se habían desarrollado lesiones semilunares (Fig. 3G-I). Los machos mostraron un mayor grado de pérdida de podocitos en comparación con las hembras (63,71 ± 2,11 frente a 75,81 ± 3,83 podocitos por glomérulo), lo que es coherente con la observación de que los ratones macho son más susceptibles al antisuero anti-GBM y forman más medias lunas celulares en el curso de la enfermedad (Fig. 3J). Sin embargo, la pérdida adicional de podocitos después de altas presiones de perfusión fue similar en hombres y mujeres (Fig. 3J).

Figura 3. Pérdida de podocitos tras lesión aguda. (AB) Microscopía electrónica de transmisión de un controlriñón per- fused at a low pressure and after supramaximal pressure (>>300 mmHg) shows normal foot process architecture. (C-D) Transmission electron microscopy reveals the typical finding of foot process effacement after injection of anti-GBM serum at baseline. After perfusion with higher pressure, areas of denuded basement membrane were observed. (E) Total number of podocytes per mouse in anti-GBM mice at baseline and under higher (300 mmHg) or supramaximal pressures (>> 300 mmHg); (each circle represents 1 kidney; n=7 control kidneys with 50mmHg, n=8 anti-GBM kidneys with 50mmHg, n=4 kidneys with 300 mmHg or >> 300mmHg). (F) Total number of podocytes per glomerulus in juxtamedullary and subcortical glomeruli; each circle represents 1 subcortical glomerulus (n= 20 glomeruli pro mouse) and each triangle represents 1 juxtamedullary glomerulus (n= 20 glomeruli pro mouse). (G-I) Histologic staining of anti-GBM mice at baseline identified protein casts, whereas three days after injection of anti-GBM serum no crescentic lesions could be found. After perfusion with higher pressure, tubule-interstitial dilatation and edema were observed. (J) Total podocyte number per mouse between males and females; each circle represents 1 kidney (n=4 control kidneys with 50mmHg, n=4 anti-GBM kidneys with 50mmHg, n=2 kidneys with 300 mmHg or >>300 mmHg). Para comparaciones múltiples ANOVA. ****PAGS<0.0001, ***p ="" <="" 0,0001,=""><0.01,><0.05 and="" ns="" and="" ns="not" statistically="" significant;="" error="" bars="" represent="" means="" ±="">

Rastreando los podocitos perdidos en los túbulos

Se observaron regularmente eGFP más podocitos dentro de la luz de los túbulos proximales donde parecían adherirse al borde en cepillo de las células del túbulo proximal (Fig. 4A). Estos podocitos no fueron lavados en hiperperfundidosriñóns, en cambio, se adhirieron con bastante fuerza al borde del cepillo para soportar el flujo extraordinario de la orina primaria a presiones de perfusión muy altas. Para confirmar su identidad, los podocitos se tiñeron conjuntamente con marcadores específicos de podocitos (es decir, p57, sinaptopodina y WT-1) además del marcador de rastreo de linaje genético nuclear eGFP (Fig. 4B). El número de podocitos fue significativamente menor en aquellos glomérulos con podocitos adheridos en el túbulo proximal asociado, y la presencia de podocitos en los túbulos se correlacionó inversamente con el número de podocitos por glomérulo (Fig. 4C).

Pérdida preferencial de podocitos en localización perihiliar

Finally, we investigated whether podocyte loss driven by an acute increase in perfusion pressures might occur in preferential locations of the glomerulus (i.e. at the vascular pole vs. the tubular pole of the glomerular tuft). To analyze the spatial distribution of podocyte detachment, the vascular pole was marked in each glomerulus (acquired in 3D) based on the lectin signal and the distance of each podocyte from the vascular pole was determined semi-automatically. The individual distances from the vascular pole were separated into quartiles (Fig. 4E). As depicted in Fig. 4E, the majority of podocytes clustered in the 2 middle quartiles (i.e. quartile 2 and 3). Less than 12 % of the podocytes localized to either in the first, i.e. vascular pole, or the fourth quartile, i.e. most distant from the vascular pole. Upon perfusion with pressures >>300 mmHg, no se observaron cambios significativos en la distribución espacial de los podocitos en ratones jóvenes y sanos. En ratones de edad avanzada, las distancias de los podocitos desde el polo vascular generalmente aumentaron, probablemente reflejando hipertrofia glomerular, mientras que la hiperperfusión resultó en un desprendimiento preferencial de podocitos cerca del polo vascular (el primer cuartil se redujo del 11,5 al 4,9 por ciento en ratones de edad, Fig. 4E ). De manera similar, se observó un desprendimiento preferencial de podocitos cerca del polo vascular en podocitos borrados (anti-GBM, 1er cuartil reducido del 25 al 5 por ciento).

Discusión

En este estudio, examinamos los efectos agudos de la presión de filtración elevada y el flujo de filtración en la pérdida de podocitos en el riñón murino perfundido aislado, utilizando el método más preciso actualmente para determinar el número de podocitos. El primer hallazgo importante de nuestro estudio fue que los podocitos sanos no son susceptibles al estrés de cizallamiento agudo in vivo, como sugirieron previamente los estudios de cultivos celulares [11]. Para nuestra sorpresa, ni siquiera las presiones suprafisiológicas extremas (más de 450 mmHg) indujeron un desprendimiento podocitario significativo. Más bien, la microscopía electrónica de transmisión reveló que las tres capas de la barrera de filtración permanecieron relativamente bien conservadas. Los ratones más viejos mostraron un número reducido de podocitos (como se informó anteriormente) y esto se asoció con una susceptibilidad aumentada muy limitada a presiones de perfusión altas. El segundo hallazgo importante fue que la lesión previa de los podocitos hizo que los podocitos fueran susceptibles al desprendimiento a altas presiones de perfusión. Los ratones anti-GBM mostraron un borramiento global de los procesos podales tres días después de la inyección del antisuero anti-GBM y un número significativo se desprendió a altas presiones de perfusión. En ratones envejecidos, planteamos la hipótesis de que la fisiología de los podocitos está relativamente bien conservada, lo que los hace menos susceptibles al desprendimiento. Al aplicar un enfoque de conteo semiautomático, cada glomérulo se analizó por separado (un total de 1200 glomérulos analizados). Confirmamos que los glomérulos yuxtamedulares tienen un volumen mayor que los glomérulos subcorticales. Curiosamente, el número de podocitos fue el mismo, lo que muestra que la densidad de podocitos se reduce en los glomérulos yuxtamedulares. Además, los glomérulos yuxtamedulares también eran más vulnerables al aumento de las presiones de filtración en comparación con los glomérulos subcorticales. Estos hallazgos podrían explicar en parte por qué las lesiones de GEFS se pueden observar con mayor frecuencia en glomérulos tan grandes [22, 23].

Fig. 4. Detección de podocitos en la prox. adyacente. tubito. (A) Imagen representativa que muestra eGFP más podocitos (verde) en los túbulos. (B) Tinción de inmunofluorescencia de podocitos comarcados por el transgén histona eGFP (verde) y los marcadores endógenos de podocitos p57 (rojo), wt-1 (rojo) y sinaptopodina (púrpura). (C) Asociación del número de podocitos por glomérulo con el número de podocitos identificados en el túbulo (n=81 glomérulos de ratones control, n= 41 glomérulos de ratones viejos y n= 81 glomérulos de ratones anti GBM). Para comparaciones múltiples, se utilizó ANOVA. ****PAGS<0.0001,>< 0.01="" and="" ns="not" statistically="" significant;="" error="" bars="" represent="" means="" ±="" sd;="" in="" the="" graph,="" each="" circle="" represents="" 1="" podocyte;="" (d)="" schematic="" showing="" how="" the="" distance="" of="" podocytes="" from="" vascular="" pole="" was="" calculated.="" (e)="" distances="" of="" individual="" podocytes="" from="" the="" vascular="" pole.="" the="" individual="" distances="" from="" the="" vascular="" pole="" were="" separated="" into="">

Una limitación de este estudio es el corto período de observación, ya que no se pueden sacar conclusiones sobre la adaptación a largo plazo de los podocitos a presiones de filtración aumentadas. Se ha propuesto que la primera respuesta de los podocitos expuestos al esfuerzo cortante es sufrir cambios estructurales protectores [8, 24]. Estos cambios incluyen la pérdida de rendijas de filtración (es decir, FPE) y el reemplazo de diafragmas de hendidura por oclusión o uniones estrechas. Las uniones oclusivas se han descrito previamente en varios modelos de enfermedades glomerulares [25-28]. Sin embargo, en nuestro estudio, observamos que los podocitos con FPE eran más susceptibles a presiones de perfusión más altas=. Por lo tanto, nuestros resultados mostraron que estos cambios adaptativos no fueron suficientes para proteger contra el desprendimiento o, potencialmente, incluso lo contrario, que hacen que los podocitos sean más susceptibles al desprendimiento. A continuación, se puede argumentar que el aislado perfundidoriñónno es un sistema fisiológico y que las presiones aplicadas fueron mucho más altas que en condiciones in vivo. Hasta donde sabemos, ningún otro modelo que utilice un viable intactoriñónexiste que permitiría investigar directamente los efectos del aumento de las presiones de perfusión. Mediante la aplicación de vasodilatadores antes y durante la perfusión, se induce la dilatación máxima de los vasos preglomerulares para permitir el flujo sin restricciones (hiperfiltración) y la transmisión máxima de presiones de perfusión aumentadas al glomérulo. En el presente estudio, se estudiaron los efectos agudos de presiones de perfusión más altas. Los efectos a largo plazo de la hiperperfusión patológica podrían ser más nocivos y provocar una pérdida aún mayor de podocitos. Sin embargo, nuestro estudio sugiere que esta pérdida crónica de podocitos no está impulsada por la pura fuerza del flujo de filtración per se, sino más bien por los cambios (mal)adaptativos en los podocitos que disminuyen su adherencia al GBM. Los pacientes con enfermedades glomerulares se benefician del tratamiento antihipertensivo al prevenir los cambios estructurales (mal)adaptativos de los podocitos.

Conclusión

Este trabajo proporciona la primera evidencia in vivo de que los podocitos sanos están extraordinariamente unidos al GBM en riñones de ratones sanos y pueden resistir incluso presiones de perfusión muy altas. El envejecimiento o incluso la lesión podocitaria aguda más pronunciada con borramiento global, hace que los podocitos sean susceptibles al desprendimiento a presiones de perfusión aumentadas.