Respuestas de favonoides y fitooxilipinas en hojas de granada (Punica Granatum L.) Parte 1

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Resumen:El jasmonato de metilo (MeJA) producido en las plantas puede mediar en su respuesta al estrés ambiental. También se ha demostrado que la aplicación exógena de MeJA activa las vías de señalización e induce la acumulación de fitoalexina en muchas especies de plantas. Para comprender cómo las plantas de granada responden bioquímicamente al estrés ambiental, se realizó un análisis de metabolitos en hojas de granada sujetas a la aplicación de MeJA y se revelaron cambios únicos en taninos hidrolizables, flavonoides y fitooxilipinas. Además, los análisis de transcriptoma y qPCR en tiempo real de hojas de granada tratadas con MeJA y simuladas identificaron genes metabólicos expresados ​​diferencialmente y factores de transcripción que están potencialmente involucrados en el control dehidrolizablevías de taninos, flavonoides y fitooxilipinas. Caracterización molecular, bioquímica y bioinformática de los únicoslipooxigenasacon expresión sostenida inducida por MeJA mostró que es capaz de oxidar ácidos grasos poliinsaturados, aunque no se encuentra en el compartimento subcelular donde se produjeron fitooxilipinas que no son jasmonato (no JA). Estos resultados sugirieron colectivamente que, si bien la amplia supresión de flavonoides y antocianinas se controla al menos parcialmente a nivel transcripcional, la biosíntesis inducida de no-JAFitooxilipinases probable que no esté regulado transcripcionalmente. En general, una mejor comprensión de cómo las hojas de granada responden al estrés ambiental no solo promoverá la salud y la productividad de las plantas, sino que también tendrá un impacto en la salud humana, ya que los frutos producidos por las plantas de granada son una rica fuente de compuestos nutricionales.

Palabras clave:jasmonato de metilo.Flavonoide·Antocianina· Ácido graso.fitooxilipina·Lipooxigenasa

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Introducción

Cuando son heridas o atacadas por herbívoros y patógenos, las plantas producen y emiten metil jasmonato (MeJA), que es percibido por los tejidos de las plantas no heridas y las plantas vecinas para activar la respuesta de defensa (Cheong y Choi 2003). Además, se ha demostrado que la aplicación exógena de MeJA a una planta provoca vías de señalización, así como la producción de proteínas relacionadas con la patogénesis y sustancias químicas de defensa conocidas como fitoalexinas. Las fitoalexinas fenólicas, por ejemplo, flavonoides y antocianinas, han mostrado una mayor acumulación en respuesta al tratamiento con MeJA en diferentes plantas, como Arabidopsis thaliana, uva (Vitis vinifera), plátano (Musa acuminate), manzana (Malus Domestica) y frambuesa roja (Rubus idaeus). )(Pandey et al.2016; Portu et al.2015; De Geyteret al.2012; Shafiq et al.2011; Flores y Ruiz del Castillo 2014). La biosíntesis de flavonoides y antocianinas comienza con la formación de naringenina chalcona a partir de cumaroil CoA y tres moléculas de malonil CoA catalizadas por chalcona sintasa (CHS) y la posterior isomerización de naringenina chalcona a naringenina por chalcona isomerasa (CHI). Luego, la naringenina se usa para generar los esqueletos centrales de flavonoides y antocianinas, que se modifican aún más con grupos funcionales glucosilo, metilo, hidroxilo y prenilo para dar lugar a diversas estructuras y funciones (Tian et al. 2008).

Cistanche puede mejorar la inmunidad

In addition to phenolic phytoalexins, the production of Phyto-oxylipins upon MeJA induction has also been reported in a few plant species (Deboever et al.2020). Phyto-oxylipins are oxygenated fatty acids and derivatives that play a role in plant growth, development, stress response, and innate immunity(Wasternack and Feussner 2018). The initial step of Phyto-oxylipin biosynthesis involves oxidation of polyunsaturated fatty acids(PUFAs) to fatty acid hydroperoxides (HPOs)by lipoxygenases(LOXs)(Andreou and Feussner 2009). Plant LOXs are grouped into two subfamilies according to their protein sequences; type ILOXs are highly homologous(>75 por ciento de similitud) y no contienen un péptido señal, mientras que las LOX de tipo II poseen una similitud general de secuencia baja (<35%)but all="" contain="" a="" chloroplast="" target="" peptide="" (feussner="" and="" wasternack="" 2002).="" plant="" loxs="" can="" also="" be="" classified="" based="" on="" enzymatic="" activities;9-loxs="" and="" 13-loxs="" target="" the="" c-9="" and="" c-13="" position="" of="" the="" fatty="" acid="" substrate,="" respectively="" (feussner="" and="" wasternack="" 2002).="" hpos="" generated="" by="" loxs="" can="" be="" further="" transformed="" to="" various="" phyto-oxylipins,="" such="" as="" hydroxy="" fatty="" acids="" by="" reductases,="" keto="" fatty="" acids="" by="" loxs,="" epoxy="" fatty="" acids="" by="" per-oxygenases(pxgs),="" and="" dihydroxy="" fatty="" acids="" by="" loxs="" or="" α-dioxygenase="" α-doxs).="" notably,13-hydroperoxy-linolenic="" acid(an="" hpo)produced="" from="" linolenic="" acid="" by="" 13-lox="" can="" initiate="" a="" series="" of="" reactions="" to="" form="" jasmonic="" acid(ja),="" meja,="" and="" the="" bioactive="" ja-isoleucine="">

La granada (Punica granatum L.) es un cultivo hortícola de especialidad valorado por los abundantes compuestos fenólicos en su fruto, como flavonoides, antocianinas y taninos hidrolizables (HT) que se derivan de un intermediario de la ruta del shikimato (Ono et al.2016). ). Hasta ahora, muchos estudios se han centrado en el papel de los compuestos fenólicos de la granada para aliviar el estrés y las enfermedades en los seres humanos (Wu y Tian 2017). Por el contrario, se sabe poco sobre la función de los compuestos fenólicos y otros fitoquímicos en la defensa de la granada contra factores abióticos y bióticos (por ejemplo, heridas, patógenos, inducción de MeJA) en hojas y frutos. Dos informes recientes evaluaron el tratamiento MeJA previo a la cosecha en la calidad poscosecha de las frutas de granada (Koushesh Saba y Zarei 2019; Garcia-Pastor et al.2020). Las antocianinas totales, los flavonoides y los fenoles de las frutas tratadas con MeJA, pero no de las hojas, se analizaron colectivamente usando un espectrofotómetro. Uno de los estudios también analizó antocianinas individuales mediante espectrometría de masas (Garcia-Pastor et al.2020). Sin embargo, no está claro cómo los tejidos de la planta de granada, ya sean hojas o frutos, responden al estrés ambiental antes del cuajado.

Para comenzar a diseccionar las interacciones entre las plantas de granada y los factores ambientales, investigamos la respuesta metabólica de las hojas de granada a la aplicación de MeJA exógeno mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) y cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem de ionización por electropulverización (LC-ESI-MS/MS) . Se observaron cambios únicos en HT, flavonoides y antocianinas, así como alteraciones en lípidos, ácidos grasos y fitooxilipinas en hojas de granada tratadas con MeJA. El análisis comparativo del transcriptoma, validado por análisis de qPCR en tiempo real, reveló que los genes estructurales y/o reguladores involucrados en el metabolismo de HT, flavonoides, antocianinas y fitooxilipinas se expresaron de manera diferencial en hojas de granada tratadas con simulacro y MeJA. El único gen LOX que exhibió una expresión regulada al alza sostenida en hojas tratadas con MeJA se sometió a caracterización molecular, bioquímica y filogenética adicional.

materiales y métodos

Los estándares de -glucogalina y pentagaloil glucosa se adquirieron de Shanghai Yuanye Bio-Technology Co. Ltd (Shanghai, China). Los productos químicos utilizados en el ensayo LOX se obtuvieron de los siguientes proveedores: ácido 3-(dimetilamino)benzoico (DMAB) (Adamas Reagent, Co., Ltd., Shanghai, China), ácido linoleico (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.),3-metil-2-benzotiazolinona (MBTH) y hemoglobina (Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghái, China).

Materiales vegetales Los frutos y semillas de granada (cv. Wonderful) fueron proporcionados generosamente por la Academia Panzhihua de Ciencias Agrícolas y Forestales e identificados por el Dr. Binjie Ge en el Jardín Botánico Shanghai Chenshan. Se depositó un espécimen de muestra (No. CSHO173966) en el herbario del Jardín Botánico Shanghai Chenshan, Shanghai, China. Se cultivaron plántulas de granada en una sala de crecimiento con temperatura controlada durante 6 semanas a 25 grados y 16 horas de luz/8 horas de oscuridad. Según se informa, la concentración de MeJA para la aplicación por aspersión en los tejidos de las plantas oscila entre 100 y 250 μM（Ku et al.2014; Hickman et al.2017). Inicialmente se aplicaron diferentes concentraciones de MeJA a hojas de granada, de las cuales 200 μM de MeJA dieron lugar a una respuesta metabólica perceptible en el análisis preliminar y se utilizaron para los análisis de metabolitos y expresión génica descritos en este estudio. Antes del tratamiento con MeJA, la mitad de las plantas de granada se trasladaron a otra sala de crecimiento con condiciones similares. Mientras que las plantas en una sala de crecimiento se rociaron con MeJA 200 μM, las de la otra sala de crecimiento se rociaron con agua (es decir, control simulado). A las 2-h,3-h,6- h,12-h,24-h, 30-h,36-h,48-h,y72-h después del tratamiento, sale de3 Se agruparon hasta 5 plantas tratadas con simulacro o MeJA, que constituyen una réplica biológica. Se recolectaron tres réplicas biológicas para los experimentos de tratamiento simulado y MeJA; cada réplica biológica se dividió en alícuotas para el análisis de perfiles de metabolitos y expresión génica.

Análisis de perfiles de metabolitos

Las hojas de granada se liofilizaron, pesaron y molieron hasta obtener un polvo fino usando perlas de zirconio en un batidor de perlas (Mixer Mill MM 400, Retsch GmbH, Haan, Alemania) durante los años 90 a 30 Hz. Para el análisis de HPLC, la muestra de hoja se extrajo en metanol al 70 por ciento durante 60 min bajo sonicación y se centrifugó a 13,000 rpm durante 10 min. El sobrenadante se transfirió a un vial de HPLC, del cual se inyectaron 30 μL en una HPLC de fase inversa (Agilent 1200, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.) y se analizó como se describió anteriormente (Wil-son et al.2019). Los metabolitos se detectaron por absorción UV a 254 nm, 280 nm, 320 nm y 360 nm. Se construyeron curvas de calibración estándar de -glucogalina y pentagaloil glucosa; se usaron para convertir las áreas de los picos que coinciden con los tiempos de retención y los espectros de absorción de -glucogalina y pentagaloil glucosa a las concentraciones respectivas.

For LC-ESI-MS/MS analysis, the homogenized leaf sample(100 mg) was extracted in 1 mL of 70% methanol at 4℃Covernight.On the following day, the methanolic extract was centrifuged at 10,000×g for 10 min and the supernatant was passed through a CNWBOND Carbon-GCB SPE cartridge（ANPEL, Shanghai, China） and a 0.22-μm syringe filter(ANPEL) prior to metabolite analysis. The extract （2 μL） was analyzed using LC-ESI-MS/MS (Shim-pack UFLC, Shimadzu, Kyoto, Japan; QTRAP6500, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)and a reverse phase C1s column(ACQUITY UPLC HSS T3,1.8 βm, 2.1 mm×100 mm, Waters, Milford, MA, USA).Metabolites were eluted using solvents(A)water containing 0.04%acetic acid,and(B)acetonitrile containing0.04% acetic acid at a gradient of 0-11 min,95-5%A;11-12 min,5% A;12-12.1 min,5-95%A;12.1-15min,95%A.The flow rate was maintained at 0.4 mL min-1. Linear ion trap (LIT) and triple quadrupole(QQQ)MS scans were acquired in positive-and negative-ion modes. The turbo spray ion source was operated at 500℃C with an ionization voltage of 5500 V. The ion source gas I, gas I, and curtain gas were set at 55 psi,60 psi, and 25 psi, respectively. The collision gas (nitro-gen) was set at 5 psi. For the MRM analysis, declustering potential (DP)and collision energy(CE) were optimized for each precursor-product ion transition. For metabolite identification, the LC-ESI-MS/MS data were compared with an MS2T library of commercial standards and previously identified compounds published in mass spectral databases (when commercial standards are not available)(Chen et al.2013). Pomegranate metabolites were annotated based on the retention times, accumulate m/z values, and fragmentation patterns that match the MS2T library entries(Chen et al.2013). Metabolite quantification was performed using the MRM method as described by Dresen et al. (Dresen et al.2010). The biological replicates of each treatment (mock or MeJA)were averaged for comparative metabolite analysis. The Variable Importance in Projection(VIP) value was obtained from the Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis(OPLS-DA)model. Metabolites with ILog, FCl>1, and VIP>=1 se consideraron cambiados significativamente.

Análisis transcriptómico

El ARN total se extrajo de hojas de granada con el reactivo TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.) y se cuantificó con Nanodrop2000 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.). La integridad de las muestras de ARN se verificó mediante separación en gel de agarosa (sin degradación visible) y determinación de la relación OD20/28o (entre 1,8 y 2,2) utilizando Nanodrop2000. El enriquecimiento del ARNm a partir del ARN total se llevó a cabo utilizando perlas magnéticas oligo (dT) (Invitrogen). Las bibliotecas de ARNm-Seq se construyeron utilizando el kit de preparación de bibliotecas de ARN Truseq (Illumina, San Diego, CA, EE. UU.). El análisis del transcriptoma se realizó en Illumina HiSeq4000 y se obtuvieron 55-60 millones de 150-pb lecturas de extremo emparejado (PE150) para cada biblioteca de muestras. Los datos de la secuencia sin procesar se procesaron eliminando las secuencias del adaptador y las secuencias cortas (<50 bp),="" low="" quality=""><30), and="" poly(="">10%)reads using SeqPrep (https://github.com/jstjohn/seqprep)and Sickle (HTTPS: GitHub. com/Joshi/sickle). Over 95% of the cleaned reads were uniquely mapped to the reference pomegranate genome for each sample library using HISAT2(Kim et al.2015) and the mapped reads were assembled using StringTie(Pertea et al.2015). The assembled transcriptome sequences were annotated using NCBI NR(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/). Transcript abundance was determined by the RNA-Seq by Expectation-Maximization(RSEM) method and expressed as Transcripts Per Kilobase Million(TPM)(Li and Dewey 2011). Differential gene expression analysis was performed using DESeq2 (Love et al.2014), with a thresh-old of the log, FCl>1, y valor de P ajustado<>

Análisis qPCR en tiempo real

El ARN total se extrajo de hojas de granada simuladas y tratadas con MeJA utilizando el kit RNAprep Pure Plant (Tiangen Biotech Co., Ltd., Beijing, China). La transcripción inversa (RT) se realizó utilizando ARN total y el kit de reactivos PrimeScriptTM RT (Takara Bio Inc., Kusatsu, Japón). La PCR cuantitativa (qPCR) se llevó a cabo utilizando el kit TB GreenTM Premix Ex Taq TM (Tli RNaseH Plus) ( Takara) y un sistema de PCR en tiempo real StepOnePlus (Ther-moFisher Scientific). Se realizó un análisis de la curva de fusión y mostró un solo producto de amplificación para cada par de cebadores. Para el análisis de RT-qPCR, se examinaron tres réplicas biológicas y cada una con tres réplicas técnicas para muestras tratadas con simulacro y MeJA. La expresión génica se analizó usando el método comparativo C,(△AC) (Livak y Schmittgen 2001), y los niveles de significación se determinaron usando una prueba t de Student de dos colas. Las secuencias de cebadores para el análisis de qPCR en tiempo real y las eficiencias de amplificación de los pares de cebadores se muestran en la Tabla S1.

Expresión y purificación de proteínas recombinantes y ensayos enzimáticos

El marco de lectura abierto de Pgr025417 (que codifica una supuesta LOX) se sintetizó para un uso óptimo de codones en E. coli (Genewiz, Suzhou, China) y se clonó en pET28a. El plásmido recombinante se transformó en E. coli BL21 (DE3) células. Se inició un cultivo de 5-mL Luria Bertani (LB) con 50ug mL-Ikanamicina a partir de una sola colonia y se incubó durante la noche con agitación a 37C. El cultivo de toda la noche se usó para inocular 100-mL de medio LB con 50 ug mL-'kanamicina y se dejó crecer hasta una OD600 de 0,5. A continuación, se añadió isopropil- -D-tiogalactósido (IPTG) hasta una concentración final de 0,1 mM para la inducción de la expresión de proteínas. Después de la incubación con agitación a 16 grados durante 18 h, las células se recogieron por centrifugación. Los sedimentos celulares se resuspendieron en el tampón de lisis (NaH 50 mM, PO, pH 7,4, NaCl 300 mM, imidazol 10 mM) y se homogeneizaron usando un disruptor celular (Constant Systems Ltd, Northants, Reino Unido). Las proteínas marcadas con His se purificaron usando Perlas de Ni-NTA (ThermoFisher Scientific) con el tampón de lavado (NaH,PO 50 mM, pH 7,4, NaCl 300 mM, imidazol 25 mM) y el tampón de elución (NaH,PO 50 mM, pH 7,4, NaCl 300 mM, 500 mM) imidazol). Las proteínas purificadas se separaron en un gel SDS-PAGE al 10 por ciento para la visualización de la pureza de la proteína. La concentración de las proteínas purificadas se determinó utilizando el ensayo de Bradford (Bradford 1976).

Para el ensayo LOX, se utilizó ácido linoleico como sustrato en un método colorimétrico de dos pasos con ligeras modificaciones (Anthon y Barrett 2008) . La mezcla de reacción 500-μL, que incluye fosfato de sodio 50 mM, pH 6, DMAB 10 mM, ácido linoleico 0,5 mM y varias cantidades de proteínas recombinantes purificadas (1,5 mg mL -), se incubó a 25 grados durante 10 min. Se añadió una segunda solución (500 μL) que contenía MBTH 0,2 mM y 0,1 mg mL-'hemoglobina a la mezcla de reacción, que se incubó durante 5 min más. La reacción se terminó añadiendo 500 μl de laurilsulfato de sodio al 1 por ciento (p/v). Se determinó la absorción de luz a 598 nm. Localización subcelular y análisis filogenéticos Una búsqueda del genoma de la granada anotado (Qin et al. 2017) identificó 1l LOX putativos de longitud completa (786 aa a 970 aa), incluidos Pgr025413, Pgr020032, Pgr025418, Pgr025417, PgrO18982, PgrO18980, PgrO16852 (full -secuencia de longitud en GenBank XP_031395793), Pgr009839, Pgr008562, Pgr025678 y PgrO13780. La localización subcelular y los sitios de escisión de los péptidos señal para las LOX de granada se predijeron utilizando TargetP 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)(Almagro Armenteros et al.2019).

Análisis del sitio de unión de TF

Para predecir los sitios de unión de los TF, se obtuvieron 1000 pb aguas arriba del codón de inicio ATG de los genes objetivo de GenBank y se buscaron contra los TF de Eucalyptus Grandis en PlantRegMap (versión 5) (Tian et al.2020). El valor umbral para la unión la identificación del sitio se estableció en P menor o igual que le-4. El análisis estadístico para la cuantificación de metabolitos, el transcriptoma y los datos de qPCR en tiempo real se describen en las secciones respectivas.

Resultados

MeJA modula la señalización celular y las vías metabólicas en hojas de granada

Para comprender la respuesta transcripcional de todo el genoma de la granada a la obtención de MeJA, los transcriptomas de las hojas de la granada a las 2-h,6-h,24-h y 72-h después de MeJA o Se analizaron tratamientos simulados (cada uno con tres réplicas biológicas) (Fig. S1). Se obtuvieron aproximadamente 55 millones de lecturas de secuencia sin procesar (2 × 150 pb de extremo emparejado) para cada transcriptoma con un contenido de GC de alrededor del 52 por ciento y valores de Q30 que oscilan entre el 91,6 y el 95 por ciento (Tabla S2). Para todos los transcriptomas, más del 96 % de las lecturas de secuencias limpias se asignaron al genoma de granada de referencia (Qin et al. 2017) (Tabla S3). La mayoría de las transcripciones ensambladas tenían menos de 1000 pb (34,3 %), 1000 pb: 2000 pb (32,9 por ciento), o 2000 pb—3000 pb (18,1 por ciento) (Tabla S4).

To identify pathways that are significantly enriched with differentially expressed genes (DEGs)at the above-mentioned time points, genes that show significantly different expression(log, FCl>1, P ajustada<0.05)between meja-="" and="" mock-treated="" leaves="" were="" compared="" to="" the="" kyoto="" encyclopedia="" of="" genes="" and="" genomes(kegg)database="" (fig.s1).="" application="" of="" meja="" modulated="" the="" expression="" of="" genes="" in="" plant="" hormone="" and="" mitogen-activated="" protein="" kinase="" (mapk)signaling="" pathways="" as="" well="" as="" fatty="" acid="" metabolism="" at="" all="" time="" points,="" with="" the="" only="" exception="" of="" those="" in="" plant="" hormone="" pathways="" at="" 24-h="" (fig.="" s1).="" while="" changes="" in="" aromatic="" amino="" acid="" metabolic="" (including="" the="" shikimate="" pathway)genes="" became="" evident="" at="" 6-h="" after="" meja="" treatment="" (fig.s1b),="" a="" surge="" of="" modified="" expression="" of="" flavonoid="" metabolic="" genes="" was="" observed="" for="" the="" 24-h="" and="" 72-h="" post-meja="" treatment="" leaves="" (figs.="" slc="" and="" s1d).="" shikimate="" and="" ht="" pathway="" genes="" and="" ht="" metabolites="" were="" induced="" in="" meja-treated="" pomegranate="" leave="" as="" revealed="" in="" the="" transcriptome="" and="" kegg="" pathway="" enrichment="" analysis,="" three="" shikimate="" biosynthetic="" path-way="" genes="" showed="" upregulated="" expression="" in="" meja-treated="" leaves="" relative="" to="" mock="" controls="" at="" 6-h,="" including="" 3-deoxy-d-arabinose-heptulosonate-7-phosphate="" synthase="" (dahps),="" 3-dehydrogenate="" synthase(dhs),="" and="" the="" bifunctional="" 3-dehydrogenate="" dehydratase/shikimate="" dehydrogenase="" (dhq/sdh;="" abbreviated="" as="" sdh)(figs.s1b="" and="" la).in="" particular,="" three="" isoforms="" of="" pomegranate="" sdhs="" were="" identified="" and="" showed="" differential="" expression="" in="" the="" transcriptome="" analysis,="" pgr020271,="" pgr019030,="" and="">

Para determinar si los cambios en la cantidad de transcritos de genes biosintéticos de shikimato y HT pueden afectar el nivel de metabolitos derivados de estas vías, se extrajeron metabolitos fenólicos de hojas cosechadas a las 24-h, 30-h. 36-h,48-h y 72-h después de MeJA o aplicación simulada y analizado por HPLC (Fig. 2). Cabe señalar que estos puntos de tiempo se eligieron para tener en cuenta el tiempo necesario para la síntesis de proteínas y la producción y acumulación de metabolitos después de los cambios de expresión observados de los genes biosintéticos de shikimato y HT a las 6-h. Los tiempos de retención y los espectros de absorción de dos metabolitos eluidos a los 4,57 min (pico 1) y 24,98 min (pico 2) coincidieron con los de los intermedios de la vía HT -glucogalina y aleaciones Penta-glucosa, respectivamente (Figs. la y 2a). Ambos picos mostraron cambios significativos en las áreas de los picos integrados en múltiples puntos de tiempo (Fig. 2b). Específicamente, el pico 1 aumentó en las hojas tratadas con MeJA en relación con los controles simulados a las 30-h, 36-h y 48-h (Fig. 2b). Curiosamente, el pico de hojas tratadas con MeJA de 2 pulgadas disminuyó inicialmente a las 24-h, pero posteriormente aumentó a las 30-h y 36-h antes de volver a un nivel similar a los controles simulados a las 48- h y 72-h (Fig. 2b). La reducción de la mayoría de los flavonoides y antocianinas, así como el aumento de flavonas y flavonoles metilados, fueron evidentes en las hojas de granada tratadas con MeJA

To investigate whether exogenous application of MeJA may trigger broad-scale metabolic changes in pomegranate, metabolite profiling analysis was conducted on leaves collected at 72-h after mock- or MeJA treatment using LC-ESI-MS/MS. Metabolite annotation and quantification were performed using an MS/MS spectral tag (MS2T)library and multiple reaction monitoring(MRM), respectively. Of the 658 metabolites that were detected,29 showed increased and 73 exhibited decreased accumulation in MeJA-treated leaves compared to the mock controls (ILog, FCl>1; Tablas S5 y S6). Para los metabolitos acumulados diferencialmente, hubo un enriquecimiento general de metabolitos involucrados en el metabolismo secundario/especializado de la planta (67 de 102), particularmente compuestos fenólicos (63 de 102) (Tabla S6).

Entre los compuestos fenólicos, fue evidente una reducción concertada en una amplia gama de flavonoides y antocianinas (42 de los 73 compuestos reducidos) en las hojas tratadas con MeJA (Fig. 3; Tabla S6). Curiosamente, tres flavonas y flavonoles mono- o di-O-metilados, incluida la di-O-metil quercetina, el crisoberilo O-hexosil-O-hexósido y la venta de 5-O-hexósido, aumentaron en las hojas tratadas con MeJA (Fig. 3; Tabla S6). Se detectaron varios intermediarios de las vías de los flavonoides y las antocianinas, incluidos luteolina, crisoberilo, dihidrokaempferol, dihidroquercetina, dihidromiricetina, epicatequina, delfinidina y pelargonidina, pero no mostraron cambios significativos en las hojas tratadas con MeJA (Fig. 3; Tabla S5). Los derivados de hidroxicina-namoilo, las isoflavonas y las cumarinas se encontraban entre otros compuestos fenólicos que mostraron una acumulación reducida tras la inducción de MeJA (Tabla S6). Por el contrario, dos ácidos fenólicos, 2,3-ácido dihidroxibenzoico y ácido protocatequiico (3,4-ácido dihidroxibenzoico), y una cumarina, 6-metilcumarina, aumentaron en las hojas tratadas con MeJA (Cuadro S6).

De acuerdo con la gran reducción de flavonoides y antocianinas en las hojas de granada tratadas con MeJA, las transcripciones de dos enzimas clave para la biosíntesis de flavonoides y antocianinas. CHS (Pgr005566) y CHI (Pgr025966), se redujeron significativamente a las 6-h y 24-h después de la aplicación de MeJA según el análisis del transcriptoma (Fig. 4). Se llevó a cabo un análisis de qPCR en tiempo real para examinar la expresión de CHS y CHI con puntos de tiempo adicionales, incluidos 2-h, 3-h, 6-h,12-h,{{ 11}}h,48-h y 72-h (Fig.4). Las transcripciones de CHS cayeron en las hojas tratadas con MeJA a las 3-h y siguieron siendo significativamente más bajas que las del simulacro. controles hasta las 72-h, con la mayor disminución a las 12-h. Por el contrario, la reducción en la expresión de CHI solo fue significativa a las 24-h, 48-h y 72-h después del tratamiento con MeJA (Fig. 4).

Este artículo está extraído de Planta (2021) 254:89 https://doi.org/10.1007/s00425-021-03735-9