La fisetina atenúa las respuestas inflamatorias inducidas por lipopolisacáridos en macrófagos

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Varios estudios han reportado la eficacia y seguridad de los polifenoles en la salud humana; sin embargo, la verificación de su eficacia sigue siendo insuficiente. El objetivo de este estudio fue examinar si la fisetina, uno de los flavonoides predominantemente presentes en frutas y verduras, podría suprimir la inducción de lipopolisacáridos (LPS-)inflamatoriorespuestas en macrófagos. LPS aumentó la abundancia de ARNm proinflamatorio (MCP 1, IL-1ß e iNOS), pero fueron suprimidos por fisetina. El incremento de óxido nítrico por LPS, un factor de estrés oxidativo, fue atenuado por fisetina. Además, se redujo la fosforilación mejorada por LPS de la proteína quinasa activada por mitógeno (ERK y JNK). Finalmente, la fisetina atenuó la expresión o actividad de uPA, uP AR, MMP-2 y MMP-9, que se conocen como factores asociados de reclutamiento o infiltración de macrófagos. En conclusión,fisetinaes un agente terapéutico prometedor para las enfermedades inflamatorias relacionadas con los macrófagos, como la sepsis y la aterosclerosis.

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1. Introducción

El uso terapéutico de componentes naturales ha ganado más atención en las últimas 2 décadas. Basado en su gran eficacia y baja toxicidad, el 40 por ciento de los agentes terapéuticos aprobados por la FDA son componentes de base natural o sus derivados [1]. La toxicidad asociada con otras drogas ha sido prevenida exitosamente por diferentes productos naturales [2]. Por lo tanto, es muy importante y significativo explorar más a fondo los compuestos naturales derivados de plantas.

polifenolesson los metabolitos secundarios de las plantas y están ampliamente presentes en alimentos y bebidas de origen vegetal, frutas, verduras, especias, té y vino. Aunque no se consideran micronutrientes esenciales, varios tipos de literatura evidencian sus efectos beneficiosos sobre la salud humana, especialmente en dietas asociadas con un alto consumo de frutas y verduras [3-5]. Se han realizado numerosos estudios durante décadas para investigar los efectos farmacológicos de los polifenoles, lo que sugiere beneficios para la salud. La creciente evidencia ha demostrado que algunos polifenoles poseenantiinflamatoriopropiedades

[6-8]. Además, estudios recientes han demostrado que varios tipos de polifenoles pueden inhibir las enzimas reguladoras o los factores de transcripción que están involucrados en la inflamación [9].

La dieta influye en las diferentes etapas de la inflamación y demuestra un impacto importante en varias enfermedades inflamatorias [10,11]. La inflamación juega un papel clave en el desarrollo de enfermedades como la diabetes, el asma, las enfermedades cardiovasculares y el cáncer [12]. Por lo tanto, controlar la inflamación puede prevenir estas enfermedades. Dado que los macrófagos son los principales mediadores de la inflamación, tienen diversas funciones en la homeostasis y la inflamación de los tejidos. Por lo tanto, los agentes que modulan eficazmente sus funciones son de gran valor clínico ya que la activación aberrante de los macrófagos puede provocar respuestas inmunitarias perjudiciales. La tendencia de investigación actual indica claramente que los productos naturales son una de las fuentes más importantes de nuevos fármacos [13].

Un polifenol, la isetina (3,3',4',7-tetrahidroxiflavona), se encuentra abundantemente en la fresa, la manzana, el tomate, la cebolla, la naranja, el melocotón, la uva, el kiwi, el caqui, el té y el vino [14] . Hasta ahora, la fisetina ha reportado un fuerte efecto antiinflamatorio [15-17],

efectos antioxidantes [18], antitumorigénicos [19,20, antiangiogénicos [21], antidiabéticos [22], neuroprotectores [23] y cardioprotectores [24] tanto en cultivos celulares como en modelos animales relevantes para enfermedades humanas. Aunque la fisetina tiene muchos efectos fisiológicos, no se informa mucho sobre su efecto sobre los macrófagos.

En el presente estudio, investigamos los efectos beneficiosos de la fisetina sobre la respuesta inflamatoria de los macrófagos activados porlipopolisacárido(LPS).

2. Materiales y métodos

2.1. Aislamiento de macrófagos peritoneales residentes.

Se obtuvieron ratones BALB/c del Instituto de Ciencias Médicas de la Universidad de Tokio y se mantuvieron en el Centro de Recursos Animales de la Universidad de Okayama. Todos los experimentos con animales se realizaron de conformidad con las directrices NIH (Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio). El protocolo experimental fue aprobado por los comités de revisión ética para la experimentación con animales de la Facultad de Medicina, Odontología y Ciencias Farmacéuticas de la Universidad de Okayama (OKU-2018449). Todos los ratones se mantuvieron en una instalación de barrera y se alimentaron con una dieta de laboratorio normal. Ratones machos y hembras BALB/c, de 16 ± 4 semanas de edad, fueron anestesiados con isoflurano y sacrificados mediante dislocación cervical. Los macrófagos se recogieron mediante lavado peritoneal usando solución salina (5 ml). La solución de lavado peritoneal se centrifugó a 1500 rpm durante 5 minutos. El sedimento se suspendió en un poco de DMEM (SIGMA, Cat. No. D6046). Los glóbulos rojos se lisaron usando una solución de cloruro de amonio. El número de macrófagos se calculó usando un hemocitómetro, luego se resuspendió en DMEM que contenía FBS inactivado por calor (10 por ciento vv), penicilina (10 U/mL) y estreptomicina (10 mg/mL) y se sembró en 6-bien placas (Corning Incorporated, Cat. No. 3516) [25, 26].

2.2. Condiciones de cultivo celular.

Después de la privación de suero durante la noche, los macrófagos se incubaron con concentraciones seleccionadas de fisetina (10, 30 y 100 μM); SIGMA, Gato. No. F4043) o vehículo durante 3 horas e incubado en presencia o ausencia de LPS (10 ng/mL; SIGMA, Cat. No. L4391) durante un tiempo apropiado. Luego, se recogieron el medio y las células. El medio se utilizó para el ensayo de óxido nítrico (NO) y zimografía de gelatina. Los lisados ​​​​celulares se usaron para la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) y la transferencia Western.

2.3. Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real.

Los ARNm se extrajeron de los macrófagos usando RNeasy Mini Kits (QIAGEN, Cat. No. 74104). La transcripción inversa se realizó usando un kit de síntesis de cDNA iScript (Bio-Rad, Cat. No. 1708891). La qPCR se realizó con un sistema de PCR en tiempo real ABI Step One (Applied Biosystems, QuantStudio 3) utilizando una mezcla de PCR en tiempo real Fast SYBR Green (Applied Biosystems, n.º de catálogo 4385612)[27]. Cebadores para proteína quimiotáctica de monocitos 1 (MCP-1) (Takara Bio Inc, Cat. No. MA066003), interleucina 1 beta (IL-1) (Takara Bio Inc., Cat. No. MA025939), óxido nítrico sintasa inducible (iNOS)(Takara Bio Inc, Cat. No. MA083369), metaloproteinasa de matriz-(MMP-)2 (Takara Bio Inc., Cat. No. MA127110), MMP-9(Takara Bio Inc ., Cat. No. MA031311) y ARN ribosomal 18S (18S) (Takara Bio Inc., Cat. No. MA050364) estaban disponibles comercialmente. Cada muestra se normalizó a valores de expresión de ARNm 18S (método AACT) [27].

2.4. Ensayo de óxido nítrico.

Los sobrenadantes de cultivos celulares individuales se recogieron y centrifugaron durante 10 minutos a 14,000rpm a 4 grados. Luego, el sobrenadante se usó para el ensayo de óxido nítrico (NO). El ensayo de NO se realizó como se describe en los kits comercialmente disponibles (BioAssay Systems, Cat. No. D2NO-100). El kit de ensayo de óxido nítrico QuantiChrom de BioAssay Systems es un ensayo colorimétrico para la determinación de la producción de NO después de la reducción de nitrato a nitrito utilizando el método Griess mejorado.

2.5. Transferencia occidental.

Las proteínas de células completas se extrajeron de los macrófagos utilizando un tampón de lisis (Cell Signaling, Cat. No. 9803). Cada muestra se aplicó en SDS-PAGE al 10 por ciento y se transfirió a una membrana de fluoruro de polivinilideno, inmunotransferida con anticuerpos primarios (la fosforilación de la quinasa regulada por señales extracelulares (p-ERK); Cell Signaling, Cat. No.9101, la fosforilación de c-Jun N-terminal quinasa (p-JINK); Cell Signaling, Cat. No. 9251, el activador de plasminógeno de uroquinasa (uPA); Abcam, Cat. No.

ab20789, el activador y receptor de plasminógeno de uroquinasa (uPAR); R&D, Cat. No. AF534, y -actina; Gato Sigma. nº A5441)[28]. Luego, las membranas se incubaron con los anticuerpos secundarios apropiados y los complejos inmunes se visualizaron en quimioluminiscencia (Merck Millipore, Cat. no. WBLUF0100, Cat. no. WBLUC0100) y se cuantificaron usando un General Electric Imager (GE Healthcare, LAS4000 mini) [29].

2.6. Zimografía de gelatina.

Los sobrenadantes de cultivos celulares se resolvieron en condiciones no reductoras mediante SDS-PAGE (10 por ciento peso/vol) polimerizados en presencia de gelatina (0,1 por ciento peso/peso) para evaluar las actividades de MMP{ {4}}. Los geles se lavaron con Triton X-100(2,5 por ciento vol/vo) durante 60 min y agua destilada durante 15 min dos veces. Luego, los geles se incubaron durante la noche a 37 grados Cin 50 mM de tampón Tris que contenía cloruro de calcio (5 mM) pH 8,0. Después de la incubación, los geles se tiñeron con Coomassie Brilliant Blue R-250(Bio-Rad, Cat. No.{ {18}}) durante 30 minutos a temperatura ambiente, seguido de decoloración con Coomassie Brilliant Blue R-250 Distaining Solution (Bio-Rad, Cat. No.161-0438) hasta que aparecieron bandas claras. Las imágenes de gel se cuantificaron usando un General Electric Imager (GE Healthcare, LAS 4000 mini); las regiones digeridas translúcidas y sin teñir representaban áreas de actividad de MMP [30].

2.7. Estadísticas.

Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando Sigma Plot v14.0(Systat Software Inc, California, EE. UU.). Los datos se presentan como la media ± error estándar de la media. La significación estadística entre múltiples grupos se evaluó mediante un análisis de varianza de una o dos vías seguido de la prueba post hoc de Holm-Sidak o la prueba post hoc de Student-Newman-Keuls. pvalor<0.05 was="" considered="" statistically="">

3. Resultados

3.1. Mediadores inflamatorios atenuados con fisetina en macrófagos estimulados con LPS.

Dado que los macrófagos activados producen citocinas proinflamatorias y mediadores inflamatorios como el NO[8], examinamos los efectos de la fisetina sobre los mediadores inflamatorios en macrófagos estimulados con LPS. Primero, para estudiar si la fisetina ejerce el efecto antiinflamatorio a nivel transcripcional, determinamos los niveles de expresión de ARNm A de genes inflamatorios como MCP-1, IL-1 e iNOS (Figura 1(a) ). Como era de esperar, la fisetina suprimió las expresiones de estos genes inflamatorios de una manera dependiente de la dosis. A continuación, para confirmar si la fisetina suprime la respuesta inflamatoria en los macrófagos, evaluamos su capacidad para suprimir la producción de NO en los macrófagos tratados con LPS (Figura 1 (b)). Como era de esperar, la fisetina disminuyó la producción de NO de forma dependiente de la dosis.

3.2. Proteína Quinasa Activada por Mitógenos Reducida con Fisetina en Macrófagos Estimulados con LPS.

Dado que se informó que la fisetina inhibía las vías de la proteína quinasa activada por mitógeno (MAPK) en varios tipos de células [31, 32], examinamos los efectos de la fisetina en las MAPK en los macrófagos. Primero, se observó la activación de MAPK inducida por LPS en macrófagos (Figura 2 (a)). El aumento de p-ERK por LPS alcanzó su punto máximo a los 15 minutos después de la estimulación, mientras que el incremento de p-JNK por LPS alcanzó su punto máximo a los 30 minutos. Así, en los experimentos posteriores, se estimularon los macrófagos con LPS durante 30 minutos. El cotratamiento con fisetina disminuyó significativamente el aumento de p-ERK y p-JNK inducido por LPS (Figuras 2 (b) y 2 (c)).

3.3. Fisetina redujo uPA y uPAR en macrófagos estimulados con LPS.

La activación de los macrófagos está estrechamente relacionada con la invasividad de las células. Además, uPA y uPAR en macrófagos contribuyen a la infiltración de células. Por tanto, se investigó el efecto de la fisetina sobre la expresión de uPA y uPAR. LPS indujo la abundancia de proteínas de uPA (Figura 3 (a)) y uPAR (Figura 3 (b)). El cotratamiento de fisetina redujo el incremento de uPA (Figura 3 (a)) y uPAR por LPS (Figura 3 (b)).

3.4. Fisetin redujo MMP-2 y MMP-9 en macrófagos estimulados con LPS.

Además, para dilucidar el efecto del fise-tin en las MMP, examinamos las expresiones MMP-2 y MMP-9, los mediadores aguas abajo de uPA/uPAR. Con respecto al nivel de ARNm, LPS aumentó significativamente la expresión de ARNm de MMP-2 y MMP-9, en comparación con el tratamiento con vehículo (Figura 4(a)). Fisetin redujo la mejora de estas expresiones génicas de MMP-2 o MMP9 inducidas por LPS de una manera dependiente de la dosis (Figura 4 (a)). Además, las actividades proteicas de MMP-9 se evaluaron mediante zimografía (Figura 4(b)). Las actividades proteicas de MMP-9(92kDa) aumentaron con la estimulación con LPS, que se redujo con fisetina (Figura 4(b)).

4. Discusión

Encontramos un efecto importante de la fisetina contra la inflamación en los macrófagos. El presente estudio demostró que la fisetina atenuó la inducción de componentes inflamatorios como MCP-1, IL-1, iNOS y NO, inducidos por LPS en macrófagos. Además, la fisetina suprimió la activación de MAPK y atenuó el incremento inducido por LPS de la expresión de uPA y uPAR. Además, la fisetina atenuó el aumento de la abundancia de ARNm de MMP-2 y MMP-9 y la actividad de MMP-9.

En la sepsis causada por una infección por gramnegativos, el LPS se reconoce comúnmente como el agente causante de la sepsis. En muchos estudios, el LPS se ha utilizado como modelo de sepsis y de inflamación. Además, la inflamación crónica induce cáncer temprano mediante la activación de células inflamatorias y la producción inadecuada de un mediador proinflamatorio como iNOS y factores de transcripción como el factor de transcripción nuclear kappa B (NF-xB) [33]. Además, también se ha informado que el estrés oxidativo se reduce al atenuar la expresión de iNOS [34]. Nuestro estudio demostró que la fisetina puede ser eficaz en la prevención y el tratamiento de la sepsis y el shock séptico, debido al efecto supresor sobre la abundancia de ARNm de genes proinflamatorios y la producción de NO. En este estudio, la fisetina suprimió la producción de NO al reducir la expresión del ARNm del gen proinflamatorio (iNOS); por lo tanto, era probable que la fisetina atenuara el estrés oxidativo. En consecuencia, estos resultados respaldaron los efectos antiinflamatorios, antitumorales y antioxidantes de la fisetina.

Varios estudios informaron que LPS indujo la fosforilación de MAPK, incluidas ERK y JNK [35]. Además, se informó que la fisetina inhibe la migración y la invasión de células cervicales humanas al regular a la baja la expresión de uPA mediante la supresión de MAPK [36]. En macro -fagos, hay pocos informes disponibles sobre el efecto de la fisetina en la expresión y actividad de uPA y uPAR. Nuestro estudio demostró por primera vez que la fisetina suprimía la expresión de uPA y uPAR inducida por LPS mediante la supresión de la señalización de MAPK en los macrófagos, como se informó anteriormente en las células cancerosas.

Las MMP son una familia de proteasas cuya expresión está relacionada con ciertos procesos, como el desarrollo, la fisiología y la patología. En común, MMP-9 ha sido reconocido como un marcador de diversas enfermedades inflamatorias, como la aterosclerosis, la artritis y el lupus eritematoso sistémico [37]. Además, MMP-9 estuvo estrechamente asociado con la migración celular [38,39]. Varios estudios han informado particularmente que MMP-2 y MMP-9 están involucradas en la aterogénesis y juegan un papel importante en la estabilización de las placas ateroscleróticas 40-42]. En este punto, nuestros resultados sugieren que los inhibidores de MMP-9 puede ofrecer una promesa como enfoque terapéutico para la estabilización de placas vulnerables. Además, investigaciones recientes han demostrado que la cicatrización de heridas en la piel se ve afectada por la activación excesiva de MMP-9 [43]. Por lo tanto, se sugirió que la fisetina también tiene potencial como enfoque terapéutico para la curación de la piel. Se requerirán estudios futuros para dilucidar su detalle sobre los mecanismos moleculares.

Una tendencia reciente en la industria farmacéutica es descubrir estrategias para desarrollar la planta natural como nuevo fármaco. De hecho, dos estudios recientes en animales han demostrado que la inflamación pulmonar aguda inducida por LPS y la artritis inducida por colágeno mejoraron con el tratamiento con fisetina |32,44. Otro estudio ex vivo también demostró que la fisetina podía atenuar la liberación de citoquinas inducida por LPS de los leucocitos de pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva crónica o diabetes tipo 2 [45]. Se han desarrollado muchos fármacos inmunosupresores para atenuar enfermedades inflamatorias y autoinmunes[46-50]; sin embargo, la mayoría de los compuestos exhiben efectos secundarios significativos. Dado que los polifenoles están comúnmente presentes en las frutas y verduras de la dieta, presumiblemente pueden ser agentes inmunosupresores más seguros [51, 52]. Las frutas y verduras contienen una amplia gama de fitoquímicos que incluyen lactonas sesquiterpénicas, terpenoides, polisacáridos y compuestos fenólicos. Nuestros resultados, que demuestran los efectos antiinflamatorios, antitumorales y antioxidantes de la fisetina, indican claramente que se puede desarrollar como un nuevo fármaco. Aunque la fisetina es un candidato prometedor para la inmunoterapia, el potencial de los productos naturales que contienen fisetina como agente terapéutico para una determinada enfermedad debe verificarse más en el entorno clínico.

5. Conclusiones

El presente estudio demostró que la fisetina atenuó los incrementos deinflamatorio(MCP-1, IL-1b e iNOS), la producción de NO y la fosforilación de MAPK, uPA, uPAR y MMP, inducida por LPS en macrófagos. Estos resultados sugirieron que la fisetina puede ser un agente terapéutico para varias enfermedades relacionadas con los macrófagos.