PARTE Ⅱ: La infección por SARS-CoV-2 en el modelo de hámster sirio causa inflamación y desregulación del interferón tipo I en los tejidos respiratorios y no respiratorios, incluidos el corazón y el riñón

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Magen Ellen Francis, Una Goncin & et al.

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Resumen

COVID-19(enfermedad por coronavirus 2019) causada porSARS-CoV-2(síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2) La infección es una enfermedad que afecta a varios sistemas de órganos. Un modelo que captura todos los síntomas clínicos deCOVID-19, así como la enfermedad de largo recorrido, es necesaria. Investigamos las respuestas del huésped asociadas con la infección en varios sistemas de órganos importantes, incluidos el tracto respiratorio, el corazón y el sistema nervioso central.riñonesdespuésSARS-CoV-2infección en hámsters sirios. Encontramos aumentos significativos en las citocinas inflamatorias (IL-6, IL-1beta y TNF) y los interferones de tipo II, mientras que los interferones de tipo I estaban inhibidos. El examen del tejido extrapulmonar indicó inflamación en elriñón, hígado y corazón que también carecían de regulación positiva de interferón tipo I. Histológicamente, el corazón tenía evidencia de miocarditis y microtrombos mientras que elriñóntenía inflamación tubular. Estos resultados dan una idea de la enfermedad multiorgánica que experimentan las personas conCOVID-19y posiblemente la enfermedad prolongada en personas con secuelas post-agudas deSARS-CoV-2(PASC). La infección por coronavirus 2) puede afectar varios sistemas de órganos, incluidos el tracto respiratorio, el tracto urinario, el sistema neurológico y el sistema cardiovascular. Para estudiar adecuadamente esta enfermedad y evaluar la terapéutica, un modelo que captura todos los síntomas clínicos deCOVID-19es requerido. Se sabe que el daño que ocurre después de la infección viral a menudo se debe a las propias respuestas inmunitarias del huésped. Por lo tanto, aquí investigamos cómo se regulan las respuestas inmunitarias del huésped en varios sistemas de órganos importantes, incluidos el tracto respiratorio, el corazón y el sistema nervioso central.riñonesdespuésSARS-CoV-2infección en hámsters sirios. Encontramos aumentos significativos en las citoquinas inflamatorias (IL-6, IL-1beta y TNF), así como en las citoquinas antivirales, llamadas interferones tipo I. Curiosamente, los interferones de tipo I de la respuesta antiviral se inhibieron en el tracto respiratorio. El examen del tejido extrapulmonar indicó inflamación en elriñón, hígado y corazón que también carecían de regulación positiva de interferón tipo I. Histológicamente, el corazón tenía evidencia de miocarditis y microtrombos mientras que elriñóntenía inflamación tubular. Estos resultados dan una idea de la enfermedad multiorgánica que experimentan las personas conCOVID-19y posiblemente la enfermedad prolongada en personas con secuelas post-agudas deSARS-CoV-2(PASC).

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La infección por SARS-CoV-2 da como resultado una inflamación significativa o una regulación inmunitaria en el corazón, los ganglios linfáticos y el bazo, así como firmas de eosinófilos en el intestino grueso

Los marcadores inmunológicos de inflamación, inmunidad adaptativa y respuestas antivirales también se evaluaron en tejidos no respiratorios junto con la histopatología de los tejidos. Investigamos el ganglio linfático mediastínico, el corazón,riñón, bazo, hígado e intestino grueso para la regulación de objetivos inmunes categorizados como arriba por IFN tipo I, respuesta de IFN general/tipo II y mediadores innatos/adaptativos (Fig. 6), así como para inmunopatología (Figs. 7 y S4). Si la evaluación inicial de la histopatología sugería la participación de mecanismos inmunitarios específicos (Fig. S4), se realizaba un escaneo de alta resolución para adquirir una mayor profundidad de información (Fig. 7). Los ganglios linfáticos mediastínicos no pudieron recuperarse el día 15. Los significados correspondientes para la expresión génica se pueden encontrar en la Tabla S2. Las respuestas de IFN tipo I y tipo II en todos los órganos extrapulmonares excepto el hígado tenían perfiles de regulación similares a los de los pulmones y los cornetes nasales (Fig. 6). La regulación génica se caracterizó por una disminución de las respuestas de tipo I y un aumento de las respuestas de tipo II. STAT2 se redujo significativamente en el ganglio linfático mediastínico,riñón, bazo e intestino grueso. El corazón tuvo disminuciones significativas y sostenidas en IRF1 mientras que el intestino grueso tuvo disminuciones en IFN-beta (Fig. 6). Por el contrario, se observaron aumentos marcados en IFN-gamma en el ganglio linfático mediastínico yriñóny en menor medida en el corazón y el bazo. CXCL10, el quimioatrayente de células T, se incrementó a niveles altos en el bazo, el hígado y el ganglio linfático mediastínico donde la regulación era bifásica en el ganglio linfático (Fig. 6). Se observó la regulación de los genes mediadores innatos/adaptativos en el bazo y los ganglios linfáticos para todos los objetivos inmunitarios examinados, con la excepción de TGF-beta, IL-5R y CCR3, que no se regularon de manera eficaz. Específicamente, regulación significativa de CD3, CD4, CD8A, IL-2, IL-21, IL-10, IL-4, IL-5, IL{{13 }}, y se observó IL-12 en estos órganos inmunitarios secundarios. La regulación de los mediadores inmunitarios innatos/adaptativos fue particularmente interesante en el corazón, donde IL-2, IL-10, IL-4 e IL-5 aumentaron 100 veces con respecto al valor inicial. . La regulación positiva más alta de citocinas inflamatorias se detectó en el corazón, seguido del riñón, el hígado y los ganglios linfáticos mediastínicos. En el corazón, la IL-12 aumentó significativamente de forma temprana y, junto con el TNF, permaneció elevada en el día 15 pi. IL-6 e IL-1beta también se indujeron transitoriamente en el tejido cardíaco los días 5 y 8 (Fig. 6). Se observaron cambios significativos en el corazón mediante análisis histológico (Fig. S4). Las imágenes de alta resolución encontraron evidencia de microtrombos (Fig. 7A, flechas blancas) así como de miocarditis (Fig. 7B, flechas blancas) en el corazón. CD14, IL-1beta y TNF aumentaron al principio en el riñón, pero disminuyeron entre los días 8 y 12 pi (Fig. 6), lo que coincidió con la infiltración de células inflamatorias en el riñón y posiblemente lesión renal aguda o lesión tubular (indicado por las flechas blancas, Fig 7C). La expresión de IL-6 se mantuvo en el hígado, donde la IL-1beta también aumentó en puntos de tiempo tardíos. El ganglio linfático mediastínico tuvo un aumento bifásico de IL-12 con aumentos transitorios de IL-6 y TNF hasta niveles de 12, 8 y 11, respectivamente. El intestino grueso tenía una regulación significativa de IL-5, IL-5R y CCR3 con infiltración de eosinófilos (Fig. 7D), pero una regulación mínima de cualquier otro mediador innato/adaptativo. Para acompañar el análisis de los órganos extrapulmonares, analizamos la química sanguínea de los animales a lo largo del tiempo para evaluar la disfunción del órgano (Fig. S5). Analizamos glucosa, albúmina, fosfatasa alcalina, alanina transferasa, nitrógeno ureico en sangre, bilirrubina total y proteína total como un signo de función hepática [27]. Se analizaron calcio, potasio, albúmina, amilasa, nitrógeno ureico en sangre y proteína total para evaluar el riñón [27]. La salud gastrointestinal se evaluó a través de la fosfatasa de sodio, potasio y alcalina[27]. La función cardíaca se midió utilizando sodio, potasio y alanina transferasa [27]. La regulación positiva de globulina se evaluó como un signo de estimulación antigénica [27]. De las 14 moléculas investigadas, solo la amilasa y la glucosa aumentaron significativamente en los animales infectados en comparación con los controles, alcanzando un máximo de 1700 U/L y 280 mg/dL, respectivamente, en el día 8 pi. Además, los cambios en la concentración de potasio ([K plus]) fueron los más notables y parecían estar relacionados principalmente con el tiempo durante el período del estudio, ya que la mayoría de las personas tuvieron un aumento de [K plus] y el mayor cambio se observó en el día 15. El aumento en la albúmina también fue notable pero leve en muchos de los animales. La concentración de proteína total aumentó ligeramente en la mayoría de los sujetos, pero el cambio es relativamente leve y probablemente clínicamente insignificante. Otros marcadores hepáticos alcanzaron su punto máximo más adelante en el transcurso del tiempo, incluida la glucosa (280 mg/dL) el día 8, la fosfatasa alcalina (ALP) el día 12 (3 U/L) y el nitrógeno ureico en sangre (BUN) (22 mg/dl) el día 15. La alanina transferasa (ALT), aunque alcanzó su punto máximo el día 2, fue alta el día 12 con poco menos de 100 U/L, lo que sugiere un posible daño hepático. Los marcadores renales también alcanzaron su punto máximo más tarde, el día 8 para la amilasa (1700 U/L) y el día 15 para el potasio y el BUN (12 y 22 mg/dl, respectivamente). BUN, con pocas excepciones, tuvo un posible aumento en la concentración dependiente del tiempo. El calcio, por el contrario, alcanzó su punto máximo el día 2 con 2,6 mg/dl, pero cayó dentro de los rangos de referencia. Los marcadores de salud gastrointestinal y cardíaca, como el sodio, mostraron una regulación mínima, mientras que [K plus] aumentó de forma relativamente lineal a lo largo del curso de tiempo infeccioso, alcanzando un máximo en el día 15 (12 mg/dl). La ALP (marcador gastrointestinal) fue alta los días 5 y 8 a 3 u/L y la ALT (marcador cardíaco) aumentó en los hámsteres infectados en relación con los hámsteres no infectados los días 2, 8 y 12 a 75–100 U/L, pero la las diferencias no fueron significativas. Por último, la globulina alcanzó su punto máximo el día 2 a 0,6 g/dl y disminuyó de forma relativamente lineal a lo largo del tiempo. En conjunto, el análisis de sangre indica cierta desregulación en los órganos extrapulmonares, así como estimulación antigénica en respuesta aSARS-CoV-2.

Fig. 6. La infección por SARS-Cov-2 en hámsters provoca aumentos en los genes relacionados con los mediadores inflamatorios e inmunitarios en órganos extrapulmonares seleccionados, lo que posiblemente indique miocarditis, evolución inmunitaria adaptativa e infiltración de eosinófilos en el intestino grueso.qRT-PCR se realizó en ARN extraído de ganglios linfáticos mediastínicos (M), corazón, riñón, bazo, hígado e intestino grueso deSARS-CoV-2hamsters inoculados. Las muestras se evaluaron para determinar la respuesta relacionada con el interferón tipo I (IFN-beta, STAT2, IRF1, IRF3, TLR3), la respuesta relacionada con el interferón tipo II (IFN-gamma, IRF2, STAT1, CXCL10) e innata/ mediador adaptativo (CD3, CD4, CD8, CD19, IL-2, TGF-beta, IL-21, IL-10, IL-4, IL-5, Genes IL-5R, IL-13, IL-12, CD14, CCR3, PKR, CCL20, CCL22, IL-1beta, IL-6, TNF) aprovechando cebadores de PCR específicos para secuencias de hámster (Tabla 1). El cambio de pliegue se calculó a través de ΔΔCt frente a la línea de base (Día 0) con BACT como gen de mantenimiento. N es 3 para todos los puntos de tiempo.

Discusión

OriginalmenteSARS-CoV-2Se pensaba que la infección causaba principalmente enfermedades respiratorias, pero ahora está claro queCOVID-19es una enfermedad de muchas caras que afecta a varios sistemas de órganos[25,26]. Para obtener una mejor comprensión del origen de la enfermedad y la gran cantidad de síntomas clínicos experimentados en humanos, investigamos la inmunopatología en el tracto respiratorio, así como en los órganos no respiratorios duranteSARS-CoV-2infección en hámsters sirios. Infección con 105 TCID50 deSARS-CoV-2resultó en una enfermedad clínica leve a moderada. El virus infeccioso estaba contenido principalmente en el tracto respiratorio, aunque el ARN viral estaba presente en todos los tejidos evaluados. El perfil de respuesta del huésped en el tracto respiratorio identificó la inhibición de la respuesta de IFN tipo I con un aumento concomitante de IFN tipo II, citoquinas inflamatorias, citoquinas innatas y adaptativas. La investigación de los órganos extrapulmonares también encontró un perfil similar para la señalización de IFN tipo I y II; sin embargo, también se identificó la regulación inmunitaria específica de tejido. Específicamente, se identificó una expresión significativa de mediadores innatos y adaptativos en el corazón y el bazo. Dado que el tratamiento antiviral duranteSARS-CoV-2la infección solo es efectiva durante una ventana corta [28], severaCOVID-19se cree que es consecuencia de una respuesta inmunitaria desregulada[29]. Comprender la inmunopatogénesis es esencial para identificar dianas terapéuticas y tratar los síntomas agudos no respiratorios asociados conCOVID-19incluyendo palpitaciones del corazón o migrañas y condiciones más duraderas en la fase de recuperación tales como secuelas post-agudas deSARS-CoV-2(PASC), también conocida como COVID-19 prolongado[30].

Fig. 7. Los órganos extrapulmonares seleccionados tienen una patología distinta después de la infección por SARS-CoV-2 con evidencia de microtrombos y miocarditis en el corazón, daño tubular en el riñón e infiltración de eosinófilos en el intestino grueso.Se recogieron el corazón, el riñón y el intestino grueso de cada animal en la necropsia y se fijaron en formalina al 10 por ciento antes de la inclusión del bloque de parafina. Los tejidos se tiñeron con H&E. Los tejidos del corazón exhibieron microtrombos (flechas blancas) durante varios días (A), así como miocarditis en el día 8 (flecha blanca) (B). El riñón tenía lesión aguda/lesión tubular (flechas blancas) (C). El intestino grueso tenía infiltración de eosinófilos (flechas blancas) (D). Los tejidos teñidos se visualizaron y tomaron imágenes usando el escáner de diapositivas Aperio ScanScope XT. Las imágenes que se muestran son representativas de 3 animales por grupo, por punto de tiempo.

El sitio primario de infección que influye en la transmisión deSARS-CoV-2en las personas es el tracto respiratorio. Por lo tanto, el enfoque inicial de nuestra investigación fue el tracto respiratorio, incluidas las respuestas inmunitarias asociadas y la inmunopatología. Aquí hemos demostrado la infección de las vías respiratorias superiores e inferiores y la enfermedad asociada después de la infección por SARS-CoV-2 en hámsters sirios. La infección viral en el pulmón condujo a una patología grave caracterizada por la infiltración de células inflamatorias que provocó bronconeumonía el día 5 pi y hemorragia el día 8. Estos hallazgos fueron consistentes con la infección por SARS-CoV-2 en estudios previos con hámsteres sirios[19, 20,31,32] y modelos animales más grandes, incluidos macacos rhesus[33], así como neumonía grave identificada en algunos humanosCOVID-19pacientes[34-36]. La consistencia de los datos apoya el uso del hámster para modelarSARS-CoV-2infección enfermedad respiratoria humana y la inmunopatología asociada. También notamos que algunos hámsters experimentaron una mayor pérdida de peso, lo que se correlacionó con una mayor carga viral. El peso diferencial puede deberse al instinto natural de los hámsteres de esconder la comida dentro de sus mejillas, una inoculación ineficiente o que existen propiedades inherentes del huésped que pueden conducir a la pérdida de peso diferencial y la replicación viral en este stock animal. Dado que todos los animales fueron examinados para el almacenamiento de alimentos en la boca y todos los animales fueron positivos para laSARS-CoV-2virus, no creemos que este resultado sea un reflejo de errores de pesaje o mala inoculación. Se requiere más trabajo para determinar si existen diferencias genéticas entre los hámsteres sirios de Charles River. Comprender la pureza del stock de animales proporcionará información importante para el uso de estos animales en estudios terapéuticos de SARS-CoV-2 y si es posible aprovechar este conocimiento para el desarrollo de un hámster más severo.SARS-CoV-2modelo. En nuestro estudio, también identificamos la regulación al alza de genes inflamatorios clave, como IL-6 y TNF en los pulmones y los cornetes nasales, lo que confirma el modelo inmunitario previo en hámsters[32,37]. Estos hallazgos son importantes, ya que se ha demostrado que estos marcadores inflamatorios predicen enfermedades graves a través de la evaluación de la sangre en humanos[38-42]. Se ha realizado un análisis más profundo de la respuesta del huésped al SARS-CoV-2 en los tejidos respiratorios de los hámsters mediante el análisis de secuenciación del transcriptoma[43,44]. Hoagland y sus colegas evaluaron los pulmones deSARS-CoV-2hámsteres infectados para la regulación del gen inmunitario del huésped y encontró una regulación ascendente prominente de IL-6, TNF e IL-1beta[43] consistente con nuestros resultados de PCR. En otro estudio, el análisis de secuenciación de una sola célula reveló una respuesta prominente de las células T, incluida la regulación al alza de IFN-gamma e IL-2[44], dos marcadores que también observamos que se expresan mucho en los pulmones. Además, nuestros análisis de los pulmones revelaron una regulación positiva de los marcadores de células T CD3, CD4 y CD8A. Es importante destacar que el análisis qRT-PCR que informamos en nuestro presente estudio está de acuerdo con estos otros estudios, lo que valida el uso de qRT-PCR como un método para evaluar rápidamente la efectividad de las vacunas y las terapias que se están evaluando en el hámster SARS-CoV{{ 13}} modelo. Nuestros perfiles de qRT-PCR proporcionan biomarcadores específicos que pueden emplearse fácilmente. Nuestro estudio e interpretación estuvieron limitados por contar únicamente con la presencia de análisis de patogenia. Los estudios futuros deberían utilizar nuestro panel de objetivos inmunitarios para su uso en vacunas y estudios terapéuticos.

La respuesta antiviral es esencial para el control inicial de un virus mediante la destrucción activa de la replicación viral y la estimulación inmunitaria para limitar la propagación a otras células. Después de identificar la presencia de un virus o antígenos virales, la inducción de interferones es fundamental para el establecimiento de un estado antimicrobiano dentro de las células, donde el equilibrio entre los interferones y otras citocinas innatas es fundamental para una acción eficaz[45]. Recientemente, la inhibición de los interferones tipo I (IFN-alfa e IFN-beta) se ha asociado con enfermedad grave enCOVID-19lo que sugiere que el virus puede bloquear la inmunidad antiviral, lo que conduce a un aumento de la patogénesis [14,46,47]. En nuestro estudio, encontramos que los hámsters infectados conSARS-CoV-2tienen una respuesta prototípica de IFN tipo II. Por el contrario, la respuesta de tipo IIFN está regulada a la baja, como lo demuestra la disminución de la expresión del gen IFN-beta y el aumento de la expresión del gen IRF2, un antagonista de tipo I. Numerosos estudios han demostrado respuestas alteradas de IFN tipo I después de la infección por SARS-CoV-2 in vitro[14,48-51]. La desregulación de IFN que informamos aquí aún no se ha analizado en el tejido respiratorio de humanos con enfermedad grave.COVID-19, pero los análisis inmunológicos sistémicos de sangre han indicado resultados similares [14,46,47,52]. Aunque los mecanismos que inhiben las respuestas del interferón tipo I no se han dilucidado por completo, se han implicado factores virales y del huésped en esta desregulación [53,54].

La desregulación de la respuesta del interferón es una estrategia empleada por los virus para evadir la inmunidad del huésped. Investigaciones anteriores de la respuesta del huésped a la infección por SARS-CoV (síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 1) y MERS-CoV (síndrome respiratorio de Oriente Medio coronavirus) sugieren que múltiples coronavirus emplean esta estrategia[55-59]. El estudio de 2020 de Xia et al. determinó que esta desregulación utilizada por los coronavirus altamente patógenos se extiende aSARS-CoV-2al demostrar que estos tres beta-coronavirus regulan a la baja la vía del interferón tipo I. Específicamente, NSP1, NSP6 y NSP13[50] interfieren con la traducción de IFN-beta, ya sea bloqueando el ribosoma del huésped en el caso de NSP1[60] o apuntando a las proteínas aguas arriba necesarias para la inducción de IFN-beta en el caso de NSP13[61]. OtroSARS-CoV-2las proteínas del virus también se han implicado en la regulación a la baja del interferón[62]. Tanto ORF3b como ORF9b se dirigen específicamente a un complejo de proteína de señalización antiviral mitocondrial para inhibir la señalización de IFN tipo I [63,64]. Factores del huésped que afectanSARS-CoV-2los resultados de la infección incluyen la edad y el sexo; además, las comorbilidades también se han implicado en la desregulación del interferón[65]. Un estudio de 2020 de Trouillet-Assent et al. examinóCOVID-19los resultados de los pacientes en una cohorte que incluía individuos que expresaban sistémicamente IFN tipo I e individuos que tenían niveles significativamente más bajos de IFN-alfa y beta. Descubrieron que los pacientes que carecían de expresión de interferón tipo I eran mayores y tenían más probabilidades de ser hombres en comparación con los que sí expresaban IFN tipo I[66]. En un estudio similar, se identificaron niveles sistémicos significativamente más altos de IFN-alfa2 en mujeres en comparación con los niveles en hombres|67]. En nuestro estudio reciente, encontramos que los hurones machos adultos mayores tenían una respuesta retardada de interferón tipo I en comparación con las hembras adultas, y los machos carecían de inducción de genes antivirales esenciales, incluidos OASL, MIX1 e IDG15, lo que coincidió con una mayor carga viral[68] En nuestro presente estudio utilizando el modelo de hámster, todos nuestros animales eran machos, lo que sugiere que se necesita una investigación sobre los sesgos sexuales para obtener una comprensión completa de nuestra desregulación del interferón tipo I observada. En este momento, no se sabe por qué o cómo los factores del huésped influyen en las respuestas de interferón aSARS-CoV-2. Un estudio de Bastard et al. identificó la presencia de autoanticuerpos contra interferones tipo I en hombres conCOVID-19[69]. Esto ofrece una posible explicación de los mecanismos inmunitarios implicados en la disminución de las respuestas de interferón tipo I en un subconjunto de pacientes humanos. El mecanismo para la reducción de las respuestas de interferón en nuestro presente estudio, en el que todos los hámsteres eran animales machos adultos, espera más investigación. Además, en conjunto, el perfil inmunológico que hemos identificado junto con la patología del tracto respiratorio sugiere que los hámsters pueden ser un modelo ideal para explorar estos mecanismos y probar terapias como los interferones tipo I [48,49,70] o el interferón lambda [Z1, Z2], ambos han demostrado eficacia en el tratamientoCOVID-19pacientes [Z3-75] pero se necesita más investigación.

COVID-19es una enfermedad que involucra la patogenia de los órganos respiratorios y no respiratorios[25,26; sin embargo, se sabe poco acerca de la respuesta del huésped fuera del tracto respiratorio. En nuestro estudio, identificamos ARNv en varios tejidos fuera del tracto respiratorio, incluidos los ganglios linfáticos mediastínicos, el corazón, los riñones, el hígado, el bazo y el intestino grueso. La presencia de ARN viral puede ser un indicador de la replicación del virus vivo y de la infección tisular, pero también puede estar presente sin un virus vivo. No encontramos virus vivos significativos fuera de las vías respiratorias, lo que sugiere que se está produciendo una infección mínima o nula de los órganos extrapulmonares. Sin embargo, la presencia de ARN viral puede ser importante para la enfermedad clínica y los mecanismos asociados. La presencia de ARN viral podría ser el resultado de un virus en la sangre que se transporta sistémicamente o de un antígeno viral que fue transportado por células presentadoras de antígeno a tejidos inmunológicamente importantes, como el bazo y el ganglio linfático mediastínico. La presencia de ARN viral puede desempeñar un papel en las respuestas inmunitarias y la patogénesis asociada dentro de estos tejidos. Por lo tanto, continuamos investigando las respuestas del huésped relacionadas con el sistema inmunitario en los tejidos que eran positivos para el ARN viral. Aunque encontramos una regulación positiva de los genes de interferón inflamatorio y de tipo II en todos los tejidos no pulmonares, la respuesta más llamativa fue el aumento de las citocinas inmunomoduladoras en el corazón. Dentro del corazón, nuestro análisis identificó el aumento de citocinas, incluidas IL-10, IL-2, IL-4, IL-5, IL-5R, IL{ {12}}, CD14 y CCR3, donde algunas transcripciones de ARNm de citoquinas aumentaron 100- veces. Aunque las citoquinas seleccionadas aquí pueden ser producidas por diferentes subconjuntos de células T, la ausencia de TGF-beta sugiere que la presencia de células T reguladoras es menos probable. Además, la ausencia de IL-13 disminuye la probabilidad de una respuesta TH2. Además de los linfocitos T, el aumento de la expresión génica de IL-10, TNF e IL-6 podría atribuirse a monocitos o macrófagos[76]. Esto se ve respaldado además por el aumento de CD14[76]. La expresión de IL-5, IL-5R, IL-4 y CCR3 también sugiere la presencia de eosinófilos[77]. Una gran cantidad de estudios clínicos ahora han detectado compromiso cardíaco enCOVID-19[78-84]. De hecho, se estima que aproximadamente el 30 por ciento de las personas que se han recuperado deCOVID-19tener algún tipo de lesión cardiaca85]. Un estudio alemán de 100COVID-19los pacientes encontraron que la inflamación del miocardio era común incluso meses después de la recuperación deSARS-CoV-2infección[84]. Dentro de la cohorte evaluada, el 78 por ciento de los pacientes experimentaron síntomas relacionados con el corazón, independientemente de su grado deCOVID-19gravedad[84]. Los monocitos se encuentran entre los tipos de células que se sabe que se infiltran en el corazón en la inflamación del miocardio, produciendo IL-10, IL-1beta, IL-6 y TNF [86], así como IL-12[87,88], todos los cuales estaban regulados positivamente en el corazón después de laSARS-CoV-2inoculación en nuestro presente estudio. Además, otro subconjunto de problemas cardíacos relacionados conCOVID-19se ha atribuido a los eosinófilos que dan lugar a la miocarditis eosinofílica[89]. Se sabe que otros virus causan miocarditis eosinofílica después de la infección[90-93]. Esta patología generalmente resulta de la infección por el virus de los tejidos del corazón, por ejemplo, con la infección por Coxsackievirus B3 [94]. La miocarditis eosinofílica ha sido diagnosticada enCOVID-19pacientes, después de lo cual la autopsia del tejido cardíaco mostró infiltración de células inflamatorias, incluidos linfocitos, macrófagos y, de manera prominente, eosinófilos [89]. En este caso, el aumento de eosinófilos y la inflamación general en el corazón se encontraron a pesar de la falta de virus vivos en el corazón en el momento de la muerte[95]. Encontramos evidencia en nuestro estudio de miocarditis eosinofílica en la histopatología y también en la firma de citoquinas encontrada en el corazón. En nuestro estudio, es posible que los eosinófilos conduzcan a una miocardiopatía mediada por inflamación a través de la regulación positiva de IL-4, que aumentó en términos de expresión génica en los corazones de los hámsteres el día 8 posterior a la inoculación con el SARS-CoV-2. Un aumento de potasio y ligeros aumentos en la alanina transferasa en el plasma de los hámsteres infectados también pueden haber apoyado la desregulación cardíaca. Con esto en mente, los mecanismos que regulan la lesión cardíaca relacionada con COVID-19 aún no se conocen. Teniendo en cuenta la prevalencia de afectación cardíaca enCOVID-19pacientes, se necesita más investigación para comprender los mecanismos de la enfermedad. Aquí proporcionamos evidencia de que los hámsters pueden ser útiles para comprender los mecanismos que definen la lesión cardíaca duranteSARS-CoV-2infección y evaluando la terapéutica para esta patología.

Desde el punto de vista inmunológico, nuestros análisis en el bazo y los ganglios linfáticos mediastínicos sugieren la inducción de inmunidad adaptativa. El ganglio linfático mediastínico identificó una regulación bifásica notable en los genes relacionados con las células T, con regulación positiva en la expresión génica de CD3, CD4, IL-2, IL-21, I-10, IL{ {6}}, IL-5 e IL-13 en los días 2 y 15. Este perfil sugiere la presentación temprana de antígenos dentro del ganglio linfático que drena poco después de la infección pulmonar por células dendríticas, lo que sería compatible con el día 2 regulación positiva de la producción de IL-12 en el ganglio linfático [96,97]. La migración de células dendríticas que conduce a la activación de células T finalmente culmina en IL-2 que estimula el crecimiento y la proliferación de células T[98]. Los niveles de globulina en la sangre el día 2 después de la infección en hámsters infectados también respaldan la estimulación antigénica temprana. La regulación al alza de IL-4, IL-5 e IL-13 sugiere una respuesta sesgada de TH2[99]. Los primeros estudios han demostrado que los síntomas asintomáticos o levesCOVID-19casos con un sesgo inmunológico hacia un TH2 sistémico caracterizado por aumentos en IL-4 e IL-10[100].IL-10, una citocina reguladora, también se reguló positivamente el día 2 en nuestro estudio. Nuestros datos sugieren que las células T activadas se reclutan en tejidos con una infección viral viva, como los cornetes nasales, donde observamos un aumento en los genes relacionados con las células T el día 5 después de la inoculación. La regulación al alza secundaria de genes en el ganglio linfático el día 15 también sugiere una expansión de los subconjuntos de células T. En ausencia de virus infecciosos en este momento, esto podría ser un aumento en los subconjuntos de células T que contribuyen directamente al desarrollo de una respuesta de memoria. Dado que las células T de memoria central también producen IL-2[101], nuestros datos que muestran un aumento de IL-2 en el día 15 posterior a la inoculación pueden ser indicativos de la memoria de las células T. IL-21 fue el gen relacionado con las células T más regulado al alza el día 15. IL-21 es producido principalmente por las células auxiliares foliculares T, un subconjunto que ayuda a las células B del centro germinal[102], en particular al sesgar B células hacia la maduración de la afinidad y el desarrollo de la memoria. El marcador de células B CD19 también aumentó en el ganglio linfático, y la expresión génica máxima se produjo el día 15. Un estudio de 2021 realizado por Lakshmanappa et al. evaluóSARS-CoV-2infección en macacos rhesus, revelando una respuesta robusta de células T en el ganglio linfático mediastínico con aumentos específicos en CD4, así como marcadores de células auxiliares foliculares T CD28 y CXCR5[103]. Es posible que el aumento de la expresión del gen de las células T observado en nuestro estudio también sea indicativo de una respuesta del centro germinal. También se ha observado una respuesta sistémica elevada de células T en pacientes con SARS-CoV-2 que se recuperan y desarrollan memoria a largo plazo [97,104]. Un análisis más profundo con marcadores aumentados de reacciones del centro germinal para la evaluación de los ganglios linfáticos sería beneficioso para los estudios de vacunas.

La actividad elevada de los ganglios linfáticos también podría ser indicativa de patogénesis. El ganglio linfático fue el único órgano no respiratorio donde se detectó el virus vivo. Se ha observado infección viral viva de los ganglios linfáticos, así como del bazo, en humanos que sucumbieron aSARS-CoV-2[105].En un estudio realizado por Kaneko et al., muestras de bazo y ganglios linfáticos humanos de cadáveresCOVID-19los pacientes carecían de BCL6 más células B, así como de centros germinales completos en general. Los autores plantearon la hipótesis de que esta era la causa de la pobre respuesta humoral aSARS-CoV-2[106]. Dado que identificamos una respuesta robusta de anticuerpos neutralizantes que se detectó el día 8 después de la infección y que coincidió con una disminución en la excreción viral, es más probable que el virus vivo encontrado en los ganglios linfáticos de nuestro estudio sea indicativo de respuestas de células B funcionales y reacciones del centro germinal.

El bazo también mostró respuestas inmunitarias prominentes caracterizadas por aumentos en la expresión génica linealmente desde el día 8 hasta el día 15. Esta regulación positiva tardía se correlaciona con la participación típica del bazo con la respuesta inmunitaria a los patógenos que ocurriría después de la activación en los nódulos de drenaje locales [107]. El bazo, un órgano linfoide, también activa las células T y B en respuesta al antígeno viral. La alta expresión génica de CD3, CD4, IL-2 e I-21 sugiere células foliculares T como así como la actividad de las células B dependientes del centro germinal, como vimos en el ganglio linfático [108]. Además, la respuesta en el bazo puede ser una consecuencia de la viremia, donde las células dendríticas plasmocitoides (pDC) están involucradas en el reconocimiento del antígeno viral a través de TLR7 y TLR9 para la activación de células T CD8 más y células T asesinas naturales (NKT). Ambos tipos de células funcionan en la eliminación de células infectadas por virus después de la activación en el bazo por IFN-beta e IL-12 [109], que aumentaron en nuestro modelo, junto con CD8.IL-12 , IL-10 y CD14 se regularon positivamente en el bazo de los hámsters infectados, lo que podría apuntar a la actividad fagocítica de los macrófagos [110,111]. Además, las células linfoides innatas (ILC) en el bazo apoyan la reparación del tejido en respuesta a una lesión y producen IL-5 e IL-13[112]. En conjunto, esta última respuesta en el bazo apunta a la función de reciclaje del bazo, así como a la posible activación de los linfocitos para las respuestas de memoria a largo plazo.

El intestino grueso mostró una regulación mínima de las citocinas evaluadas, con la notable excepción de I-5, IL-5R y CCR3. La expresión de estos tres genes aumentó significativamente en los días 2 a 15 con un cambio máximo de 74 para IL-5, en relación con la línea de base en el día 8. IL-5 es secretada predominantemente por T tipo 2 -células auxiliares y eosinófilos[113]. Dados los niveles más bajos de expresión génica de otros genes relacionados con Th2, como IL-4 e IL-13, y el aumento de los marcadores de eosinófilos conocidos IL-5R y CCR3, es probable que IL{ {18}} está siendo producido principalmente por eosinófilos que se pueden ver en nuestro análisis histológico del intestino grueso. Los eosinófilos juegan un papel directo en la defensa antiviral, como lo demuestran las RNasas en sus gránulos y se han asociado con la eliminación de otros virus respiratorios[114,115]. También se encuentran grandes cantidades de eosinófilos en el tracto gastrointestinal [116]. En nuestro estudio, el intestino grueso de los hámsters infectados no mostró virus vivos. El intestino grueso fue, sin embargo, positivo paraSARS-CoV-2ARN viral en los días 2 y 5 después de la inoculación, un hallazgo consistente con Sia et al., quienes también observaron ARNv en el colon en ausencia de una respuesta inflamatoria [20]. Hasta el 20 por ciento deCOVID-19los pacientes reportan síntomas gastrointestinales como diarrea[39,117]con virus que se eliminan en las heces[118]. Esto podría explicarse por la disminución de eosinófilos que se ha informado en casos deCOVID-19[119-121]. El aumento de la expresión del gen IL-5 por parte de los eosinófilos podría contribuir al estado antiviral del intestino grueso, previniendo así la infección. Se necesita más investigación para confirmar el tipo de célula exacto que conduce a esta respuesta IL-5 aumentada.

En nuestro estudio también investigamos la química sanguínea deSARS-CoV-2hámsters sirios infectados. Determinamos un rango de referencia utilizando hámsteres no infectados de nuestra fuente animal y comparamos las lecturas con los rangos de referencia publicados para hámsteres, específicamente hámsters sirios[122]. Algunos factores preanalíticos que pueden afectar la química sanguínea de nuestros animales antes de la infección y que deben tenerse en cuenta para el análisis incluyen el nivel de estrés que los animales pueden estar experimentando, así como el anestésico isoflurano utilizado cuando se extrae sangre, lo que puede alterar la química sanguínea. Se ha demostrado que los niveles de glucosa, ALT, ALP y fósforo inorgánico fueron significativamente más altos en ratas bajo isoflurano y otros anestésicos no indicados aquí[123]. En nuestro estudio de hámsters infectados con SARS-CoV-2, uno de los los cambios más notables después de la infección incluyeron las concentraciones de potasio que aumentaron con el tiempo. El potasio, que es una base, actúa como un amortiguador para el intercambio de hidrógeno (H') (ácido) cuando un paciente se encuentra en un estado ácido. Dado que la acidosis sanguínea puede ser causada por cambios en la función respiratoria, no sorprende que los hámsteres que mostraron signos de neumonía/dificultades respiratorias (lo que sugiere un aumento en el dióxido de carbono (CO2) retenido (o expulsado menos) y menos oxígeno ( El O2 (que se toma debido a la disminución de la función alveolar) estaría entrando en un estado ácido que conduciría a aumentos de potasio en la sangre. Con respecto a los niveles más bajos de albúmina en comparación con nuestro rango de referencia, se hubiera esperado que la albúmina aumentara en respuesta a la expresión de citoquinas inflamatorias. Es posible que los niveles más bajos de albúmina se deban al uso de isoflurano que se ha demostrado anteriormente[122-124]. Con respecto a la glucosa a lo largo del tiempo, la mayoría de los animales infectados tuvieron un aumento en la concentración de glucosa que sugiere estrés inducido por cortisol, excitación inducida por epinefrina o desregulación en la producción de insulina o interacción secreción/receptor. En resumen, el hallazgo más interesante de este análisis fue la sugerencia de niveles reducidos de oxígeno asociados con niveles elevados de potasio. Estos resultados sugieren que el control del potasio puede usarse para identificar neumonía durante la etapa de vida deCOVID-19estudios de animales En el futuro, este trabajo también se puede usar para crear valores de referencia para el modelo de infección por SARS-CoV en hámster sirio-2 y se puede usar para la detección de terapias en la vida.

Nuestro estudio ofrece información importante sobreSARS-CoV-2infección yCOVID-19regulación de enfermedades. Los modelos preclínicos son la piedra angular de la investigación biomédica que ofrece la capacidad de aislar experimentalmente los mecanismos de la enfermedad y también evaluar las posibles contramedidas médicas, incluidos los medicamentos inmunomoduladores, los antivirales y las vacunas. ComoSARS-CoV-2surgió por primera vez, teníamos una comprensión limitada de los mecanismos de patogénesis, no había terapias o profilácticos identificados, y no había un modelo preclínico para aprovechar el descubrimiento de contramedidas médicas. Desde el momento de la aparición del virus, se han realizado grandes avances, especialmente en el desarrollo de modelos preclínicos, pero nuestra comprensión deCOVID-19y sus muchas manifestaciones son todavía limitadas. Nuestro estudio confirmó el tropismo viral y la patología respiratoria identificada previamente en nuestroSARS-COV-2estudios de hámster, pero también pudo ampliar nuestra comprensión de la regulación inmune y la patogénesis dentro del tracto respiratorio y más allá.

Referencias

1. Zhuang Pinghui JW. Neumonía de Wuhan: cómo se desarrolló la búsqueda de la fuente de la enfermedad misteriosa South China Morning Post 2020. Disponible en: https://www.scmp.com/news/china/society/article/ 3046233/Wuhan-pneumonia-how-search -fuente-misterio-enfermedad-desvelada.

2. Cucinotta D, Vanelli M. La OMS declaraCOVID-19una pandemia. Acta Biomed. 2020; 91(1):157–60. Edición electrónica 2020/03/20. https://doi.org/10.23750/abm.v91i1.9397 ID de usuario: 32191675.

3. Petrosillo N, Viceconte G, Ergonul O, Ippolito G, Petersen E.COVID-19, SARS y MERS: ¿están estrechamente relacionados? Clin Microbiol Infect. 2020; 26(6):729–34. Epub 2020/04/03. https://doi.org/10.1016/j. cmi.2020.03.026 PMID: 32234451; PMCID central de PubMed: PMC7176926.

4. Medicina JHU. Centro de recursos de coronavirus 2021. Disponible en: https://coronavirus.jhu.edu/.

5. Marshall M. La miseria duradera de los transportistas de larga distancia del coronavirus. Naturaleza. 2020; 585 (7825): 339–41. Epub 2020/09/16. https://doi.org/10.1038/d41586-020-02598-6 PMID: 32929257.

6. Gupta A, Madhavan MV, Sehgal K, Nair N, Mahajan S, Sehrawat TS, et al. Manifestaciones extrapulmonares deCOVID-19. Nat Med. 2020; 26(7):1017–32. Epub 2020/07/12. https://doi.org/10.1038/s41591- 020-0968-3PMID: 32651579.

7. Nikolich-Zugich J, Knox KS, Rios CT, Natt B, Bhattacharya D, Fain MJ.SARS-CoV-2yCOVID-19en adultos mayores: lo que podemos esperar con respecto a la patogenia, las respuestas inmunitarias y los resultados. Gerociencia. 2020; 42(2):505–14. Epub 2020/04/11. https://doi.org/10.1007/s11357-020-00186-0PMID: 32274617; PMCID central de PubMed: PMC7145538.

8. OMS. Información para proveedores de atención médica pediátrica 2021. Disponible en: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/hcp/pediatric-hcp.html.

9. Fu Y, Cheng Y, Wu Y. ComprensiónSARS-CoV-2-Respuestas inflamatorias mediadas: de mecanismos a potenciales herramientas terapéuticas. Virol Sin. 2020; 35(3):266–71. Epub 2020/03/04. https://doi.org/ 10.1007/s12250-020-00207-4 PMID: 32125642; PMCID central de PubMed: PMC7090474.

Nota:lo anterior no es una lista completa de referencias