¿Cómo reduce el extracto de cistanche la hiperplasia inflamatoria?

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Reducción de la hiperplasia inflamatoria en el intestino en ratones propensos al cáncer de colon mediante extracto acuoso de Cistanche deserticola

Yamin Jia,1,2 et al.

Cistanchedeserticola se ha utilizado comúnmente en la medicina tradicional china para tratar muchos problemas de salud, incluido el síndrome del intestino irritable o el estreñimiento. Este estudio fue diseñado para probar la eficacia de un extracto acuoso de C. deserticola en la prevención del cáncer colorrectal en un modelo de ratón. El extracto acuoso rico en polisacáridos de C. deserticola se preparó hirviendo su polvo de tallo en agua destilada. Se usaron ratones nulos Tgfb1Rag2 como modelo experimental. Aquí mostramos que la alimentación con extracto acuoso de C. deserticola redujo significativamente el número de mucosashiperplasiae infección intestinal por Helicobacter en ratones. Este efecto beneficioso se correlacionó con una estimulación significativa del sistema inmunitario, evidenciada por el agrandamiento de los bazos con un mayor número de macrófagos esplénicos y células asesinas naturales, y con una citotoxicidad más potente de los esplenocitos. El extracto acuoso in vitro de C. deserticola mejoró la citotoxicidad de los esplenocitos vírgenes contra una línea celular de cáncer de colon humano, y en cultivos de macrófagos aumentó la expresión de óxido nítrico sintasa II y estimuló la fagocitosis. En conclusión, nuestros datos indican que la administración oral de extracto de C. deserticola reduceinflamatoriohiperplásicopólipos e infección por helicobacter en ratones por su actividad inmunoestimuladora, lo que sugiere que el extracto de C. deserticola puede tener el potencial para prevenir trastornos de inflamación intestinal, incluido el cáncer colorrectal. Copyright © 2011 John Wiley & Sons, Ltd.

Palabras clave: inmunomodulación a base de hierbas;Cistancheextracto; polisacáridos; helicobacter;inflamatoriohiperplasia; cáncer colonrectal.

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INTRODUCCIÓN

El cáncer colorrectal es el tercer cáncer más común en hombres y el segundo en mujeres en todo el mundo y ocupa la cuarta causa más común de muerte por cáncer (8 por ciento de todas las muertes por cáncer; Ferlay et al., 2010). Los estudios epidemiológicos sugieren que muchos factores de riesgo asociados con esta enfermedad, incluidos los genéticos (p. ej., antecedentes familiares de cáncer de colon) (Strate y Syngal, 2005) y los factores dietéticos (p. ej., carne roja y bajo contenido de fibra; Chao et al., 2005; Park et al. al., 2005), yinflamatorioenfermedades intestinales (EII; Eaden et al., 2001; von Roon et al., 2007; Lukas, 2010). Hasta la fecha, a pesar de los numerosos fármacos citotóxicos nuevos y las técnicas quirúrgicas y radioterapéuticas mejoradas que se utilizan para el tratamiento de esta enfermedad (Cunningham et al., 2010), una gran proporción de pacientes con cáncer colorrectal siguen siendo incurables; Se estiman alrededor de 608000 muertes por esta enfermedad en todo el mundo en 2008 (Ferlay et al., 2010). Por lo tanto, se necesitan nuevas terapias y un candidato es la inmunoterapia. Se han evaluado varios enfoques inmunoterapéuticos para el tratamiento del cáncer colorrectal y, hasta el momento, los resultados son alentadores (Burgdorf et al., 2009). Se ha demostrado que los polisacáridos herbales tienen actividades inmunorreguladoras específicas (Jiang et al., 2010), lo que sugiere que estos productos herbales podrían usarse como un adyuvante inmunoestimulador específico contra el cáncer colorrectal.

Cistanchedeserticola Ma, conocida como Rou Cong Rong en la medicina herbaria china, se ha incluido en fórmulas a base de hierbas para muchos problemas de salud, como impotencia, leucorrea mórbida y síndrome del intestino irritable/estreñimiento (Jiang y Tu, 2009). Estudios experimentales han revelado diferentes actividades biológicas por diferentes extractos de C. deserticola; el extracto de glucósidos feniletanoides de esta hierba tiene actividad antifatiga en ratones (Cai et al., 2010), y analgésico y anti-inflamatorioen roedores (Lin et al., 2002), mientras que sus polisacáridos estimulan la proliferación de linfocitos T y B en cultivos de linfocitos (Wu et al., 2005; Dong et al., 2007). Sin embargo, aún no se ha examinado la eficacia del extracto de polisacáridos de C. deserticola en la estimulación de la respuesta inmune in vivo.

Trapo2^-/-los ratones carecen de linfocitos T y B maduros, y en el fondo mixto (~97 por ciento 129 S6 y ~3 por ciento CF-1) desarrollan espontáneamente inflamación asociadahiperplasiaen el intestino (Engle et al., 1999). La introducción genética del alelo nulo Tgfb1 (gen del factor de crecimiento transformante b1 (TGF-b1)) en esta cepa de ratones da como resultado una mayor progresión dehiperplasiaa adenoma y carcinoma (Engle et al., 2002), y la colitis patógena dependiente de la microflora es necesaria para el desarrollo del cáncer de colon (Engle et al., 2002), lo que sugiere que esta cepa de ratones proporciona un modelo ideal para el examen de una terapia potencial en el tratamiento del cáncer colorrectal inducido por inflamación/EII. En este estudio, demostramos por primera vez la eficacia del extracto acuoso rico en polisacáridos de C. deserticola en la reducción deinflamatoriohiperplasiaen este modelo

MATERIALES Y MÉTODOS

Preparación de extracto acuoso rico en polisacáridos de C. deserticola.

Herbal C. deserticola fue cosechado por el Dr. Y. Guo (Universidad Agrícola de China) en la región autónoma de Mongolia Interior, China. El polvo de tallos enteros secos (300 g) se hirvió en agua bidestilada dos veces: primero durante 1 h en 500 mL de agua, seguido de una recolección del sobrenadante, luego durante 45 min en 400 mL de agua. Los sobrenadantes se filtraron a través de un papel de filtro Whatman (medio rápido) después de cada tiempo de ebullición y se juntaron. La solución del extracto se secó mediante liofilización y se mantuvo a 80 °C. El producto final fue de aproximadamente 10 g (rendimiento: ~3 por ciento).

Ratones y cultivos celulares. Ratones deficientes en TGF-b1 (Tgfb1 más/- Rag2^-/-) en el fondo mixto (~97 % 129 S6 y ~3 % CF-1) de una colonia de reproducción mantenida en condiciones libres de patógenos en las instalaciones para animales del Centro de Investigación Jack Bell (Vancouver, BC). Estos ratones se originaron en el Repositorio del Consorcio de Modelos de Ratón de Cánceres Humanos (MMHCC) (Instituto Nacional del Cáncer en Frederick, MD, EE. UU.). Los ratones C57BL/6 J (B6) (macho, de 8 a 10 semanas de edad) se compraron en Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, EE. UU.). Todos los animales para los experimentos se mantuvieron en alojamiento y dieta convencionales (5001 Rodent Diet, LabDiet) después del destete a las 4 semanas de edad, y el tratamiento a base de hierbas y la recolección de muestras se realizaron de acuerdo con las pautas del Consejo Canadiense de Cuidado Animal bajo
protocolos aprobados por el Subcomité de Uso Animal de la Universidad de Columbia Británica.

Tanto la línea celular de adenocarcinoma de colon humano SW480 como la línea celular de macrófagos leucémicos de ratón RAW 246.7 se cultivaron en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.) que contenía 10 por ciento de feto bovino. suero (FBS) (medio DMEM completo) a 37-C en una incubadora humidificada con 5 % de CO2/95 % de aire. Los esplenocitos se aislaron triturando suavemente fragmentos de bazo en solución salina tamponada con fosfato (PBS), seguido de la eliminación de eritrocitos usando tampón de lisis (0NH4Cl 0,15 M, KHCO3 1,0 mM, EDTA 0,1 mM, pH 6,8). Después de lavar de nuevo con PBS, los esplenocitos se suspendieron en medio RPMI 1640 complementado con FBS al 10 por ciento (medio RPMI completo).

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Tratamiento de extractos.

El extracto de hierbas, denominadoCistancheextractoen este estudio, finalmente se preparó mediante la reconstitución de polvo seco con agua bidestilada esterilizada y contenía 2–3 por ciento (p/p) de feniletanoides, 65–70 por ciento (p/p) de polisacáridos y 0.6–1 por ciento (p/p) de proteína según los siguientes ensayos: el número de feniletanoides se determinó por absorbancia a 332 nm utilizando una espectrofotometría descrita anteriormente (Ouyang et al., 2005); el contenido de polisacáridos se midió utilizando un método estándar de ácido sulfúrico con fenol (Dubois et al., 1956) después de la precipitación con etanol; y la proteína se determinó mediante el ensayo de proteínas Bio-Rad siguiendo el protocolo del fabricante (Bio-Rad Lab, Hercules, CA, EE. UU.). La dosis de extracto de Cistanche fue de 0,4 g/kg/día según nuestro estudio piloto. La ingesta promedio de agua por ratón adulto por día fue de aproximadamente 4 mL, y si 1 mL de agua potable contenía 3 mg deCistancheextracto, cada ratón recibió la administración oral de 12 mg del extracto por día. Basado en el hecho de que el peso corporal promedio de un ratón adulto era de 30 g, el agua potable que contenía 3 mg/mL deCistancheextractodio una dosis de 0.4 g/kg/día a los ratones. Los ratones fueron tratados dándoles de beber agua ad labium que contenía 3 mg/mL deCistancheextractoque se reponía al menos una vez cada dos días, a partir de los dos meses durante tres meses en una sala convencional del centro de cuidado de animales.

Clasificación histológica del cáncer colorrectal.

Al final del tratamiento de tres meses, se recogieron y abrieron longitudinalmente los tejidos del intestino delgado y grueso, y luego se enjuagó suavemente el contenido con PBS. Se recolectó un total de seis piezas (cada una de 2 cm de largo) de tejido intestinal de cada ratón: tres del intestino delgado en las ubicaciones proximal, media y distal; dos del intestino grueso en ubicaciones proximales y distales, y uno del ciego. Todos los tejidos se fijaron en formalina al 10 por ciento y se incluyeron en parafina. Cada sección se tiñó con hematoxilina y eosina (HE) para la clasificación histológica del cáncer colorrectal. La clasificación de la enfermedad se realizó de acuerdo con los caracteres patológicos dehiperplasia, adenoma o carcinoma dentro de cada muestra, como se describió previamente (Engle et al., 1999) en forma de prueba ciega. El número total de cada cambio patológico (hiperplasia, adenoma y carcinoma) se contó en dos secciones del tejido intestinal para cada ratón.

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Detección de Helicobacter hepaticus (H. hepaticus) en heces de ratón.

Para examinar el efecto deCistancheextractosobre el crecimiento de la microflora patológica en el intestino, se determinó H. hepaticus en las heces mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con cebadores de ADNr 16S específicos de especie, como se describió anteriormente (Shames et al., 1995). Aproximadamente 200 mg de heces frescas se disolvieron en 1 μL de PBS y se incubaron a 50 grados durante 30 min, seguido de centrifugación a 8000 rpm durante 10 min. El sobrenadante (200 ml) se recogió y se mezcló con una cantidad igual de solución de proteinasa K que contenía 5 por ciento (v/v) de 18,7 mg/ml de solución de proteinasa K (Fermentas Canada, Burlington, ON, Canadá) en un tampón de digestión (50 Tris-HCl μM, pH 8,0, EDTA 0,1 M, dodecilsulfato de sodio al 0,5 por ciento) e incubado a 70 °C durante 30 min. El ADN de la solución resultante se extrajo con el kit QIAprep Miniprep siguiendo el protocolo del fabricante (QIAGEN, Mississauga, ON, Canadá).
La amplificación por reacción en cadena de la polimerasa del ADN bacteriano se realizó en una mezcla que contenía {{0}}.75 μL de 10 tampón de PCR, 0.5μL de 50 mM MgCl2, 0,5 μL de cada cebador (sentido: 5'-GCA TTT GAA ACT GTT ACT CTG; antisentido: 5'-GGG GAGCUUGAAAACAG, 100 mM cada uno), 0,5 μL de Taq polimerasa, 18,75 μL de H2O libre de nucleasas y 1 μL de solución de ADN de heces sin cuantificar. La mezcla de PCR se calentó a 94 grados durante 5 minutos, seguida de 40 ciclos de desnaturalización a 94 grados durante 1 minuto, hibridación a 55 grados durante 1,25 minutos y extensión a 72 grados durante 1,5 minutos. La PCR finalizó con un paso de elongación de 10 min a 72 grados. El producto de PCR resultante (25 μL) se sometió a electroforesis en un gel de agarosa al 1 % en tampón Tris-acetato-EDTA (TAE) que contenía 0,5 mg/mL de bromuro de etidio y se visualizó bajo luz ultravioleta.

Determinación de macrófagos y células natural killer (NK).

Los porcentajes de macrófagos y células NK en suspensión de esplenocitos se determinaron mediante análisis de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). Se incubaron un millón de esplenocitos en tampón FACS con la combinación de anticuerpos adecuada para diferentes fenotipos de células en hielo: anti-CD3-isotiocianato de fluoresceína (FITC) y anti-CD49b-ficoeritrina (PE) (BD Biosciences, Mississauga, ON, Canadá) para CD3 CD49b más células NK, y rata anti-ratón F4/80 plus como anticuerpo primario y anti-rata IgG-FITC como anticuerpo secundario (eBioscience, San Diego, CA, EE. UU.) para F4/80 más macrófagos. La intensidad de la fluorescencia para cada tipo de célula se midió usando citometría de flujo y se analizó por comparación con controles de fondo usando el software CELLQUEST (BD Biosciences).

Ensayo de citotoxicidad de calceína-acetoximetil (calceína-AM).

La actividad lítica de los esplenocitos efectores contra las células SW480 diana se evaluó mediante un ensayo de citotoxicidad de calceína-AM usando un sistema de cocultivo como se describió anteriormente (Neri et al., 2001). En resumen, las células SW480 se marcaron con colorante fluorescente calceína-AM de la siguiente manera: 1 x10⁶células/ml de células SW480 en medio DMEM completo se incubaron con calceína-AM 15 μM a 37 grados con agitación ocasional. Después de 30 min de incubación, las células se lavaron extensamente con medio DMEM completo para eliminar el colorante extracelular. Las células SW480 marcadas con colorante fluorescente en medio DMEM completo (0,2 x 10⁶células/{{0}}.25 ml/pocillo) se sembraron en 24-placas de pocillos. Basado en las diferentes proporciones (12:1, 6:1, 3:1 y 1,5:1) de E (efector): T (objetivo), esplenocitos en 0, 25 ml de medio RPMI completo por pocillo se añadieron a los pocillos con células diana por triplicado. Los cocultivos se incubaron a 37 grados en CO2 al 5 por ciento durante 24 horas. Los sobrenadantes se recogieron después de girar la placa a 2000 rpm durante 5 min. La liberación de calceína-AM al sobrenadante se determinó usando un espectrofluorímetro de microplaca (Fluoroskan Ascent FL, Thermo Labsystems) a una emisión de 527 nm bajo excitación a 485 nm. Las células diana, incubadas con una mezcla de 0,25 ml de medio DMEM completo y 0,25 ml de medio RPMI completo, se usaron como control de fondo o de liberación espontánea y, en presencia de 2 por ciento, se usó Triton X-100 como controles de liberación máxima. La citotoxicidad de los esplenocitos se calculó de la siguiente manera:

Medición de óxido nítrico (NO). El óxido nítrico secretado por las células se oxidó rápidamente a nitrito en el medio de cultivo. Por lo tanto, las concentraciones de nitrato en el medio se determinaron utilizando el método de Griess como medida de la producción de NO. RAW264.7 celdas (0.25 x 10⁶

células/pocillo en 0.5 ml de medio DMEM completo) en 24-placas de pocillos se estimularon conCistancheextracto(50–200 mg/ml) y lipopolisacárido (LPS) (10 ng/ml) como control positivo. Después de 24 horas de tratamiento, primero se mezclaron 50 ml de sobrenadante de cultivo con 50 ml de solución al 1 por ciento
sulfanilamida en ácido fosfórico al 5 % en 96-placas de pocillos por triplicado, y se incubaron durante 10 min, luego se añadieron por pocillo 50 ml de diclorhidrato de naftil etilendiamina al 0,1 % en agua destilada. La absorbancia se leyó a 550 nm después de la incubación durante 10 min y el nivel de NO/nitrito se calculó utilizando una curva estándar con concentraciones conocidas de nitrito de sodio.

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mancha occidental.

Los niveles celulares de óxido nítrico sintasa II (NOS 2 o iNOS) se examinaron mediante transferencia Western como se describió anteriormente (Du et al., 2006). Brevemente, las muestras de proteínas (aproximadamente 100 mg/muestra) se fraccionaron mediante SDS-PAGE al 7 por ciento y se transfirieron a la membrana de nitrocelulosa. Las bandas de proteína NOS II se identificaron con anticuerpo policlonal de conejo primario anti-NOS II (N-20) (dilución 1:500; Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA, EE. UU.) y anticuerpo IgG anti-conejo de cabra secundario ( dilución 1:10000; Vector Laboratory, Burlingame, CA, EE. UU.). El complejo proteína-anticuerpo NOS II se visualizó mediante un ensayo de quimioluminiscencia mejorado (ECL, Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, Inglaterra). Las transferencias se volvieron a probar usando anti-b-actina IgG (Sigma-Aldrich Canada, Oakville, ON, Canadá) para confirmar la proteína cargada en cada muestra.

Ensayo de fagocitosis. La fagocitosis se midió por la cantidad de perlas de látex marcadas con fluorescencia (SigmaAldrich Canada, L-3030, modificadas con carboxilato, tamaño promedio de 2 mm) engullidas por células RAW264.7 como se describió anteriormente (Wu et al., 2{{ 9}}07). En resumen, se sembraron células RAW264.7 (0,1 106 células/0,5 ml/pocillo) en medio DMEM completo en 24-placas de pocillos y se estimularon con 100 mg/ml deCistancheextractoo medio DMEM completo solo como control. Después de la estimulación durante la noche, se añadieron 2,5 ml de perlas de látex fluorescentes por pocillo a los cultivos de macrófagos y se incubaron durante 2 horas. Para el análisis de citometría de flujo, las células se separaron mediante pipeteo después del lavado en PBS, y la intensidad de la fluorescencia de las células fagocíticas se midió con un citómetro de flujo y se analizó en comparación con los controles de fondo (sin perlas) utilizando el software CELLQUEST (BD Biosciences).

Análisis estadístico.

Los datos se presentaron como media más desviación estándar (DE). Se realizó el análisis de varianza (ANOVA) o la prueba t de Student según fuera apropiado para comparar los datos entre grupos. Un valor de p de <0.05 se="" consideró="">

RESULTADOS

Tratamiento conCistancheextractoreduce la frecuencia dehiperplasiae infección del intestino por H. hepaticus Durante el período de tratamiento (3 meses), se controló el peso corporal y la ingesta de agua potable una vez cada 2 días en los ratones del grupo tratado con extracto frente al grupo tratado con vehículo, no se observaron diferencias significativas. anotado (datos no mostrados). Sin embargo, el análisis histológico mostró que la administración oral deCistancheextractosredujo significativamente el número deinflamatoriohiperplasiaen el intestino (Fig. 1), evidenciado por el hecho de que los ratones que recibieron agua con extracto tenían menoshiperplasia(5.00 más -2.83/ratón, n=15) que aquellos que beben agua corriente o vehículo (7.53 más -3.09/ratón, n {{9 }}) (extracto frente a vehículo: p=0.0133, prueba t). La diferencia en el número de adenoma y carcinoma entre los ratones tratados con extracto y vehículo no fue estadísticamente significativa porque solo unos pocos ratones tenían estas etapas de cambios patológicos (datos no mostrados).

Figura 1. Reducción de la incidencia de hiperplasia por tratamiento con extracto acuoso de C. deserticola (Cistancheextracto). Los ratones Tgfb1 plus /-Rag2-/- fueron alimentados conCistancheextractoen agua potable (grupo de extracto) en comparación con los que solo tienen agua potable (grupo de vehículos). Las lesiones cancerosas en el intestino se examinaron por histología con una tinción H&E. (A) Una imagen típica de la sección de tejido sano. (B) Una imagen típica de hiperplasia en la sección, indicada por una flecha. (C) El número de hiperplasia en el intestino de cada animal se contó por histología (p=0.0133, extracto versus vehículo, n=15). Esta figura está disponible en color en línea en wileyonlinelibrary.com/journal/ptr

Se ha demostrado que el contenido microbiano intestinal, en particular la infección por H. hepaticus, es necesario para el desarrollo de todas las etapas del cáncer de colon, incluida la hiperplasia en Rag2^-/- ratones (Engle et al., 2002; Erdman et al., 2003). Examinar si el tratamiento conCistancheextractosmicroflora patológica reducida en el intestino, la presencia de H. hepaticus en las heces de los ratones tratados conCistancheextractose determinó por PCR en comparación con los controles del vehículo. En cada experimento, tres ratones por jaula fueron tratados con extracto de Cistanche o vehículo. Las muestras de heces se recogieron al final de un período de una noche 14-h después de limpiar la jaula. Como se muestra en la Fig. 2, la técnica de PCR detectó eficientemente el ADNr 16S de H. hepaticus en las heces. En tres experimentos separados (Tabla 1), solo del 20 al 40 por ciento de las muestras deCistanche-extractoLos ratones tratados con PCR se detectaron como positivos para PCR, mientras que entre el 60 y el 80 % de los controles con vehículo fueron positivos (extracto frente a vehículo: p=0.0189, prueba t, n=3), lo que sugiere que el tratamiento con El extracto de Cistanche redujo la infección intestinal por H. hepaticus en ratones.

El tratamiento con extracto de Cistanche aumenta el número de macrófagos esplénicos y células NK

La respuesta inmune juega un papel clave en la eliminación de la infección por helicobacter. Para examinar siCistanche extractotratamiento afectó el sistema inmunológico en estos ratones propensos al cáncer de colon, el tamaño de los bazos (12 ratones en cada grupo) y la cantidad de esplenocitos (seis ratones seleccionados al azar de cada grupo) se determinó al final del tratamiento. Se pesaron los bazos de 12 ratones de cada grupo, no se incluyeron los otros tres ratones del experimento inicial. Como se ilustra en la Tabla 2,Cistanche-extracto-los ratones tratados (0.055 más -0.022 g/bazo) eran más pesados ​​que en el grupo del vehículo (0.038 más -0.01 g/bazo; extracto vs. vehículo: p=0.04, prueba t). Estos datos fueron respaldados por un aumento en el número de esplenocitos en ratones tratados conCistancheextracto, indicado por 7,095 más -1,353 (x10⁶ células/bazo) en comparación con 2,941 más -1,492 (x10⁶células/bazo) ratones de control en vehículo (extracto frente a vehículo: p=00,002, prueba t).

Para evaluar más a fondo siCistancheextractotratamiento afectó a un subtipo particular de esplenocitos en ratones, el número de células NK esplénicas (CD3^-CD49b^máscélulas) y macrófagos (FT/80^máscélulas) se contó mediante análisis FACS. El porcentaje de CD3^-CD49b^máscélulas en los esplenocitos deCistanche-extracto(32,06 más -2,13 por ciento) no fue significativamente diferente de los ratones tratados con vehículo (28,47 más -2,74 por ciento; extracto frente a vehículo: p=0. 3741, prueba t, n=6), pero el número total de células NK en el bazo deCistanche-extracto-ratones tratados (2,22 más - 0,44x10⁶/bazo) fue mayor que el grupo de control en el vehículo (0.83 más -0.17x10⁶/bazo; extracto frente a vehículo: p=0.01, prueba t, n=6; Figura 3B). Se observaron resultados similares en el examen de células esplénicas FT/80 plus; como en la población de células NK esplénicas, la diferencia en el porcentaje de células FT/80 plus esplénicas entre los ratones tratados con extracto (35,25 más -7,28 por ciento) y los ratones de control con vehículo (31,74 más -5). 07 por ciento) no fue significativo (extracto vs. vehículo: p=0.407, n=6), pero el número total de macrófagos esplénicos en el grupo tratado con extracto (2.439 más -0 .452x10⁶células/bazo) fue mayor que en los grupos de control (1.114 más -0.685x10⁶células/bazo; extracto vs. vehículo: p=0.001, prueba t, n=6; figura 3D). En conjunto, estos datos sugieren que el tratamiento conCistancheextractopuede aumentar el número total, pero no el porcentaje o la proporción, de subtipos de esplenocitos efectores, células NK y macrófagos en el bazo.

Figura 3. Aumento del número de células NK esplénicas y macrófagos por el tratamiento conCistancheextracto. Las células NK o macrófagos en suspensión de esplenocitos se determinaron mediante análisis FACS con una combinación de tinción de FITC-anticuerpo anti-CD3e y marcador de células APC-anti-CD49b/Pan-NK (para células NK) o con una sola tinción de FITC-anti-CD3e. FT/80 (para macrófagos). (A) Un gráfico representativo del porcentaje de células NK esplénicas (CD3^-CD49b^más) en los esplenocitos de ratones tratados conCistancheextractocontra vehículo. (B) El número total de células NK por bazo. Los datos se presentan como media más -SD en cada grupo (p= 0.01, n= 6). (C) Un gráfico representativo del porcentaje de macrófagos esplénicos (FT/80 plus) en los esplenocitos de ratones tratados conCistancheextractocontra vehículo. (D) El número total de macrófagos por bazo. Los datos se presentan como media más -SD en cada grupo (p= 0.001, n=6).

El tratamiento con extracto de Cistanche estimula la citotoxicidad de los esplenocitos in vivo e in vitro

La respuesta inmune dependía no solo del número de esplenocitos sino también de su función, como la citotoxicidad. El efecto deCistancheextractoel tratamiento de la función de los esplenocitos (es decir, la citotoxicidad) se examinó en cocultivos con células SW480. Como se muestra en la Fig. 4A, la citotoxicidad de los esplenocitos de ratones tratados conCistancheextractofue más alto que el de las células de ratones tratados con vehículo, indicado por 39.38 más -2.64 por ciento de liberación de calceína-AM en los cocultivos de esplenocitos tratados con extracto con células SW480 a 6 :1, 51,11 más -2,6 por ciento en una proporción de 3:1 y 57,33 más -2,53 por ciento en una proporción de 1,5:1, en comparación con 27,75- 0,18 por ciento en los cocultivos de esplenocitos tratados con vehículo con células SW480 en una proporción de 6:1, 40,97 =-2,85 por ciento en una proporción de 3:1 y 45,16 más -0,18 por ciento en una proporción de Relación 1,5:1 (extracto frente a vehículo: p < 0,0001,="" anova="" de="" dos="" vías).="" para="" confirmar="" aún="" más="" el="" efecto="" estimulante="">Cistancheextractosobre la citotoxicidad de esplenocitos, la citotoxicidad deCistanche-extractoLos esplenocitos vírgenes tratados de ratones B6, que contenían células T y B funcionales, se examinaron en cocultivos con células SW480. Como se muestra en la Fig. 4B, la adición deCistancheextracto(100 mg/mL) aumentó significativamente la liberación de calceína-AM en los cocultivos de una manera dependiente de los esplenocitos: 57,64 más -3,41 por ciento en una proporción de 12:1, 52,25 más { {11}}.77 por ciento en una proporción de 6:1 y 45.72 más -2.43 por ciento en una proporción de 3:1, en comparación con 14.36 más -0.05 por ciento en una proporción de 12:1 , 20,67 más -2,03 por ciento en una proporción de 6:1 y 23,1 más -3,73 por ciento en una proporción de 3:1 en cocultivos no estimulados (extracto frente a vehículo: p < 0,0001,="" dos="" -vía="" anova).="" estos="" resultados="" indican="">Cistancheextractoestimula la actividad lítica de los esplenocitos. Se desconoce la razón por la cual se observó menos citotoxicidad cuando se agregaron más esplenocitos efectores. Una posibilidad era que el nivel de liberación de calceína-AM en este sistema de cocultivo podría no reflejar exactamente la muerte de la célula objetivo porque los esplenocitos efectores podrían reabsorber la calceína-AM después de un largo período de incubación.

El extracto de Cistanche activa los macrófagos

La activación de los macrófagos es una de las respuestas inmunes críticas contra la infección y el desarrollo de tumores (Mantovani et al., 2002, 2008). Para revelar más información sobre los mecanismos por los cualesCistancheextractoel tratamiento redujo la hiperplasia intestinal y el contenido microbiano, el efecto deCistancheextractosobre la producción de NO y la fagocitosis de macrófagos, se examinaron las células RAW264.7. Como se muestra en la Fig. 5A, la expresión de proteínas de NOS II se reguló en cultivos después de la incubación conCistancheextracto. Estos resultados fueron apoyados además por el aumento en la producción de NO enExtracto de Cistanche estimulado(Fig. 5B), evidenciado por 3.88 más -0.13 mM de nitrito en 50 mg/mL deCistancheextractocultivos celulares RAW264.7 estimulados en comparación con 0.11 más -0.12 mM de nitrito en cultivos de control no estimulados (ANOVA unidireccional, p<>

La fagocitosis es un proceso celular de engullir partículas sólidas, como las bacterias. Como se muestra en la Fig. 5C y D, la adición deCistancheextractosFagocitosis de macrófagos estimulada, como lo indican más células fagocíticas (9.8 más -0.1 por ciento) que se encuentran enCistanche-extracto-cultivos de macrófagos estimulados en comparación con aquellos (5,2 más -0,4 por ciento) en cultivos estimulados con vehículo (extracto frente a vehículo: p=0,0007, prueba t, n=3) después de una incubación de 2 h. Estos datos sugieren queCistancheextractopuede activar directamente los macrófagos mediante la regulación positiva de la producción local de NO y la estimulación de la fagocitosis de los macrófagos en el intestino de los ratones.

DISCUSIÓN

El presente estudio demuestra por primera vez que la administración oral deCistancheextractoreduce significativamente la frecuencia de hiperplasia e infección por H. hepaticus en el intestino de ratones propensos al cáncer de colon. El efecto beneficioso deCistancheextractoel tratamiento se asocia con un aumento en el número y la citotoxicidad de las células NK esplénicas y los macrófagos. Adición in vitro deCistancheextractoestimula la producción de NO y la fagocitosis en los macrófagos. Rag2 deficiente en TGF-b1^-/-Se ha demostrado que los ratones desarrollan cáncer de colon (hiperplasia, adenoma o adenocarcinoma) entre los 3 y los 6 meses de edad, y se ha demostrado queinflamatoriolos focos siempre están asociados con estas lesiones tumorigénicas (Engle et al., 1999). Otros estudios han demostrado que en estos ratones se requiere el desarrollo de cáncer de colon para la presencia de la infección de la flora microbiana patógena porque el cáncer de colon se elimina por completo al alojar a los ratones en condiciones libres de gérmenes (Engle et al., 2002), y H. hepaticus la infección también induce colitis y carcinoma de intestino grueso en Rag2-/-ratones (Erdman et al., 2003). De manera similar, en humanos, el estado microbiano y la inmunidad del huésped son los factores clave para la progresión de la EII (Fiocchi, 1998), y se ha informado que el carcinoma gástrico está asociado con la infección o inflamación crónica inducida por H. pylori (Parsonnet et al., 1991; El-Omar y Malfertheiner, 2001). Los hallazgos de estos estudios sugieren que la infección gastrointestinal puede desempeñar un papel fundamental en el desarrollo del cáncer de colon. Por lo tanto, atacar la infección gastrointestinal puede convertirse en una estrategia terapéutica para la prevención o el tratamiento del cáncer de colon y de la EII. Nuestro estudio demuestra por primera vez que la administración oral deCistancheextractoreduce la frecuencia deinflamatoriohiperplasiaen el intestino, y el número de H. hepaticus en las heces en ratones deficientes en TGF-b1. El efecto beneficioso deCistanche extractopuede deberse a su activación de los macrófagos, como se ve por un aumento tanto en la producción de NO como en la fagocitosis después del tratamiento conCistancheextracto(Fig. 5), lo que puede limitar la microflora patógena intestinal, incluida la helicobacter (Mantovani et al., 2002, 2008). En consecuencia, la lesión deinflamatoriohiperplasiafue reducido.

Se ha identificado una variedad de compuestos bioactivos en los extractos de C. deserticola, incluidos los glicósidos y polisacáridos feniletanoides (Jiang y Tu, 2009). Los glucósidos feniletanoides son citoprotectores, lo que indica el hecho de que estos compuestos previenen la muerte celular en hepatocitos cultivados y neuronas granulares del cerebelo (Xiong et al., 1998; Pu et al., 2003). Mientras que los polisacáridos estimulan la proliferación de linfocitos T y B inducida por mitógenos (Wu y Tu, 2005; Wu et al., 2005; Dong et al., 2007). Ha sido bien documentado que los polisacáridos herbales modulan la respuesta inmune (Jiang et al., 2010).Cistancheextractocontiene del 2 al 3 por ciento de feniletanoides y del 65 al 70 por ciento de polisacáridos, lo que sugiere que el efecto inmunomodulador deCistancheextractoel tratamiento podría deberse a la actividad inmunorreguladora de los polisacáridos, la mayoría de las sustancias bioactivas en el extracto de Cistanche. Sin embargo, sus células inmunitarias diana (p. ej., macrófagos o células NK, o ambas) y las vías moleculares requieren más investigación. Además, un estudio reciente demuestra que la administración de acetónido de feniletanoide a base de hierbas, uno de los feniletanoides bioactivos en el extracto de C. deserticola (Xiong et al., 1996; Jiang y Tu, 2009), tiene un efecto beneficioso sobre la reducción de dextrano. colitis inducida por sulfato de sodio en ratones (Hausmann et al., 2007), lo que demuestra que los feniletanoides (2-3 por ciento) en elCistancheextractopuede contribuir, al menos en parte, a su eficacia en la disminución deinflamatoriohiperplasia, que también requiere evaluación en el futuro.
En conclusión, el cáncer colorrectal es uno de los cánceres más prevalentes a nivel mundial y es prevenible en la mayoría de los casos. El uso de extractos de hierbas no tóxicos puede ofrecer una estrategia eficaz para la prevención del desarrollo del cáncer colorrectal y también puede aplicarse como quimioadyuvante, lo que puede beneficiar la mejora de la eficacia quimioterapéutica contra el cáncer y/o la reducción de la quimioterapia. efectos secundarios. Los datos presentados en este estudio demuestran claramente que el tratamiento con extracto acuoso de C. deserticola reduce la hiperplasia y la infección por H. hepaticus en el intestino de ratones propensos al cáncer de colon. Infección por Helicobacter o intestinoinflamaciónhiperplasiaes un factor de riesgo para el desarrollo de cáncer colorrectal. Nuestro estudio actual indica que el uso de esta hierba puede tener el potencial para la prevención y el tratamiento del cáncer colorrectal, particularmente para aquellas personas que tienen EII.

Reconocimiento

YM fue apoyado por una beca de estudiante de posgrado del Consejo de Becas de China.

Conflicto de intereses

Los autores no tienen ningún conflicto de intereses.

Cistancheextractopuede reducirInflamatoriohiperplasia

De: 'Reducción deInflamatorioHiperplasiaen el intestino en ratones propensos al cáncer de colon por extracto de agua deCistanchedeserticola' por Yamin Jia,1,2 et al

---Copyright © 2011 John Wiley & Sons, Ltd. Phytother. Res. 26: 812–819 (2012) DOI: 10.1002/ptr.3637

REFERENCIAS

Burgdorf SK, Nielsen HJ, Rosenberg J. 2009. Inmunoterapia en el cáncer colorrectal. Scand J Gastroenterol 44: 261–268.
Cai RL, Yang MH, Shi Y, Chen J, Li YC, Qi Y. 2010. La actividad antifatiga del extracto rico en feniletanoide deCistanchedeserticola Phythother Res 24: 313–315.
Chao A, Thun MJ, Connell CJ, et al. 2005. Consumo de carne y riesgo de cáncer colorrectal. JAMA 293: 172–182.
Cunningham D, Atkin W, Lenz HJ, et al. 2010. Cáncer colorrectal. Lanceta 375: 1030–1047.
Dong Q, Yao J, Fang JN, Ding K. 2007. Caracterización estructural y actividad inmunológica de dos polisacáridos extraíbles en agua fría deCistanchedeserticola YC. Mamá. Carbohydr Res 342: 1343–1349.
Du C, Guan Q, Diao H, Yin Z, Jevnikar AM. 2006. El óxido nítrico induce la apoptosis en las células epiteliales tubulares renales mediante la activación de la caspasa-8. Am J Physiol Renal Physiol 290: F1044–1054.
Dubois M, Gilles KAJK, Hamilton JK, Rebers PA, Smith F. 1956. Métodos colorimétricos para la determinación de azúcares de sustancias relacionadas. Anal Chem 28: 350–356.

Eaden JA, Abrams KR, Mayberry JF. 2001. El riesgo de cáncer colorrectal en la colitis ulcerosa: un metanálisis. Tripa 48: 526–535.
El-Omar EM, Malfertheiner P. 2001. Helicobacter pylori y cáncer gástrico. Curr Opin Gastroenterol 17 (suplemento 1): S24-S27.
Engle SJ, Hoying JB, Boivin GP, ​​Ormsby I, Gartside PS, Doetschman T. 1999. El factor de crecimiento transformante beta1 suprime el cáncer de colon no metastásico en una etapa temprana de la tumorigénesis. Cáncer Res 59: 3379–3386.
Engle SJ, Ormsby I, Pawlowski S, et al. 2002. Eliminación del cáncer de colon en ratones deficientes en factor de crecimiento transformante beta libre de gérmenes 1-. Cáncer Res 62: 6362–6366.
Erdman SE, Poutahidis T, Tomczak M, et al. 2003. CD4 más CD25 más linfocitos T reguladores inhiben el cáncer de colon inducido por microbios en ratones deficientes en Rag2-. Soy J Pathol 162: 691–702.
Ferlay J, Shin HR, Bray F, Forman D, Mathers C, Parkin DM. 2010. Estimaciones de la carga mundial de cáncer en 2008: GLOBOCAN 2008. Int J Cancer 127: 2893–2917.
Fiocchi C. 1998.Inflamatorioenfermedad intestinal: etiología y patogenia. Gastroenterología 115: 182–205.
Hausmann M, Obermeier F, Paper DH, et al. 2007. El tratamiento in vivo con el acteósido feniletanoide a base de hierbas mejora la inflamación intestinal en la colitis inducida por sulfato de dextrano sódico. Clin Exp Immunol 148: 373–381.
Jiang MH, Zhu L, Jiang JG. 2010. Acciones inmunorreguladoras de los polisacáridos de la medicina herbaria china. Expert Opin Ther Targets 14: 1367–1402.
Jiang Y, Tu PF. 2009. Análisis de constituyentes químicos enCistancheespecies. J Chromatogr A 1216: 1970–1979.
Lin LW, Hsieh MT, Tsai FH, Wang WH, Wu CR. 2002. Anti-nociceptivo y anti-inflamatorioactividad causada porCistanchedeserticola en roedores. J Etnofarmacol 83: 177–182.
Lucas M. 2010.Inflamatorioenfermedad intestinal como factor de riesgo de cáncer colorrectal. Dig Dis 28: 619–624.
Mantovani A, Allavena P, Sica A, Balkwill F. 2008. Inflamación relacionada con el cáncer. Naturaleza 454: 436–444.
Mantovani A, Sozzani S, Locati M, Allavena P, Sica A. 2002. Polarización de macrófagos: macrófagos asociados a tumores como paradigma de fagocitos mononucleares M2 polarizados. Tendencias Immunol 23: 549–555.
Neri S, Mariani E, Meneghetti A, Cattini L, Facchini A. 2001. Ensayo de citotoxicidad de calceína-acetoximetilo: estandarización de un método que permite análisis adicionales sobre células efectoras recuperadas y sobrenadantes. Clin Diagn Lab Immunol 8: 1131–1135.
Ouyang J, Wang XD, Zhao B, Wang YC. 2005. Producción mejorada de glucósidos de feniletanoide porCistancheCélulas de deserticola cultivadas en un biorreactor de circulación de aire de bucle interno con un elevador de tamiz. Enzyme Microb Technol 36: 982–988.
Park Y, Hunter DJ, Spiegelman D, et al. 2005. Ingesta de fibra dietética y riesgo de cáncer colorrectal: un análisis combinado de estudios prospectivos de cohortes. JAMA 294: 2849–2857.
Parsonnet J, Friedman GD, Vandersteen DP, et al. 1991. Infección por Helicobacter pylori y el riesgo de carcinoma gástrico. N Engl J Med 325: 1127–1131.
Pu X, Song Z, Li Y, Tu P, Li H. 2003. Acteoside deCistanchesalsa inhibe la apoptosis por el ion 1-metil-4-fenilpiridinio en las neuronas granulares del cerebelo. Planta Med 69: 65–66.
Shames B, Fox JG, Dewhirst F, Yan L, Shen Z, Taylor NS. 1995. Identificación de infección generalizada por Helicobacter hepaticus en heces en colonias comerciales de ratones mediante cultivo y ensayo PCR. J Clin Microbiol 33: 2968–2972.
Strate LL, Syngal S. 2005. Síndromes hereditarios de cáncer colorrectal. Control de causas de cáncer 16: 201–213.
Von Roon AC, Reese G, Teare J, Constantinides V, Darzi AW, Tekkis PP. 2007. El riesgo de cáncer en pacientes con enfermedad de Crohn. Dis Colon Rectum 50: 839–855.
Wu TF, Hsu CY, Huang HS, Chou SP, Wu H. 2007. El análisis proteómico de los efectos del pycnogenol en el macrófago RAW 264.7 revela la inducción de la expresión de catepsina D y la mejora de la fagocitosis. J Agric Food Chem 55: 9784–9791.
Wu XM, Gao XM, Tsim KW, Tu PF. 2005. Un arabinogalactano aislado de los tallos deCistanchedeserticola induce la proliferación de linfocitos cultivados. Int J Biol Macromol 37: 278–282.
Wu XM, Tu PF. 2005. Isolation and characterization of alpha-(1-->6)-glucanos deCistanchedeserticola J Asian Nat Prod Res 7: 823–828.
Xiong Q, Hase K, Tezuka Y, Tani T, Namba T, Kadota S. 1998. Actividad hepatoprotectora de los feniletanoides deCistanchedeserticola Planta Med 64: 120–125.
Xiong Q, Kadota S, Tani T, Namba T. 1996. Efectos antioxidantes de los feniletanoides deCistanchedeserticola Biol Pharm Bull 19: 1580–1585.