¿Por qué se puede usar Herba Cistanches para tratar el síndrome de insuficiencia renal?
Mar 10, 2022
El perfil metabólico revela los efectos terapéuticos de Herba Cistanches en un modelo animal de 'síndrome de insuficiencia renal' inducido por hidrocortisona
Contacto: emily.li@wecistanche.com
Yunping Qiu, Minjun Chen, Mingming Su, Guoxiang Xie, Xin Li, Mingmei Zhou, Aihua Zhao, Jian Jiang y Wei Jia
Resumen
Fondo
Herba Cistanches(Roucongrong) es eficaz en el tratamiento de Shenxu Zheng ('síndrome de insuficiencia renal'). Sin embargo, los mecanismos y las respuestas metabólicas sistémicas a la intervención a base de hierbas no están claros.
Métodos
Utilizando perfiles metabólicos basados en GC-MS, investigamos las respuestas metabólicas aHerba Cistanchesintervención en un modelo de rata del 'inducido por hidrocortisona'síndrome de insuficiencia renal'.
Resultados
Los perfiles metabólicos de las ratas después de la inyección de hidrocortisona se desviaron del estado metabólico anterior a la dosis en diferentes momentos, desde el día 1 hasta el día 10, mientras que los perfiles metabólicos de las ratas tratadas con hidrocortisona y extracto acuoso deHerba Cistanchesvolvió al estado anterior a la dosis el día 10.
Conclusión
la intervención deHerba Cistanchesprovocó una recuperación sistémica de la perturbación metabólica inducida por hidrocortisona en ratas. Este estudio también demuestra que el perfil metabólico es útil para estudiar los mecanismos terapéuticos de las hierbas medicinales.
Fondo
A través de la modulación de reacciones bioquímicas, mecanismos de control y actividades enzimáticas, muchos fármacos o productos químicos provocan la fluctuación de los metabolitos presentes en células individuales, tejidos o fluidos corporales [1]. El perfil metabólico, es decir, el sondeo de metabolitos de bajo peso molecular (MW < 1000="" da)="" por="" medio="" de="" un="" instrumento="" analítico="" avanzado="" junto="" con="" estadísticas="" multivariadas,="" puede="" mostrar="" las="" respuestas="" sistémicas="" de="" los="" sistemas="" vivos="" a="" los="" xenobióticos.="" también="" es="" técnicamente="" factible="" catalogar="" todos="" los="" perfiles="" metabólicos="" multifactoriales="" hereditarios="" e="" influenciados="" por="" el="" medio="" ambiente="" de="" un="" organismo,="" incluidas="" las="" consecuencias="" fisiopatológicas="" de="" las="" alteraciones="" o="" desequilibrios="" inducidos="" por="" toxinas="" y/o="" enfermedades="" en="" la="" red="" de="" regulación="" metabólica="" a="" nivel="" sistémico.="" hasta="" la="" fecha,="" se="" han="" establecido="" perfiles="" metabólicos="" en="" la="" detección,="" el="" diagnóstico,="" el="" pronóstico="" de="" enfermedades="" [2–4]="" y="" la="" evaluación="" de="" la="" seguridad="" de="" ciertos="" fármacos="" y="" productos="" químicos="">
La resonancia magnética nuclear (NMR) [12] y la espectrometría de masas (MS) [13], aplicadas solas o en combinación, se han utilizado para perfilar y caracterizar las consecuencias metabólicas de las toxinas y/o las alteraciones inducidas por enfermedades. La RMN, que no requiere un tedioso preprocesamiento de muestras, es un método rápido y sencillo para obtener información intrínseca de muestras biológicas complejas e intactas. Por otro lado, la amplia aplicación de MS con guión en el perfil metabólico se debe a su alta sensibilidad y disponibilidad [14, 15]. En particular, el perfil metabólico basado en GC-MS se ha utilizado para descubrir mecanismos de fármacos y herbicidas in vivo, biomarcadores de enfermedades [16] y efectos de la expresión génica alterada en el metabolismo, y monitorear el desempeño de organismos en aplicaciones biotecnológicas [17–20] .
Herba Cistanches(Roucongrong), una hierba tónica china común que crece en el desierto, exhibe actividades marcadas para mejorar la memoria [21] y/o la potencia sexual [22], la eliminación de radicales libres, el antienvejecimiento [23–26] y la neuroprotección [27 , 28]. Por siglos,Herba Cistanchesse ha utilizado con eficacia en el tratamiento de Shenxu Zheng ('síndrome de insuficiencia renal') [29]. RecientementeHerba Cistanchesse demostró que había mejorado los trastornos renales inducidos por hidrocortisona [30]; sin embargo, sus consecuencias metabólicas no están claras. Nuestro estudio anterior [31] encontró que los perfiles metabólicos de ratas expuestas a hidrocortisona en dosis altas (es decir, un modelo animal para el 'síndrome de insuficiencia renal') [32], mostró un patrón bioquímico único de metabolitos endógenos en la orina. Estos resultados nos inspiraron a estudiar los mecanismos de los cambios bioquímicos consistentes después de la modificación con hidrocortisona, utilizando perfiles metabólicos basados en GC-MS para investigar si Herba Cistanches podría revertir o contrarrestar los efectos metabólicos aberrantes de la hidrocortisona.
Cistanche puede mejorar la función renal
Métodos
Materiales e instrumento
Herba Cistanchesfue adquirido de Shanghai Leiyunshang Pharmaceutical Co Ltd (China) e identificado como Cistanche deserticola YC Ma por el Dr. Mengyue Wang (Laboratorio de Farmacognostics, Facultad de Farmacia, Universidad Jiao Tong de Shanghai) de acuerdo con un protocolo estándar [33]. La solución inyectable de hidrocortisona (0,5 por ciento) se adquirió de Shanghai Xinyi Pharmaceutical Co (China). Los reactivos de derivación fueron N-metil-N-trimetilsilil trifluoroacetamida (MSTFA) (Sigma-Aldrich Inc, EE. UU.) y Trimetilyodosilano (TMSI) (Sigma-Aldrich Inc, EE. UU.) mezclados en una proporción de 1000:1. Todos los reactivos utilizados en el experimento fueron de grado analítico. El agua ultrapura se preparó con un sistema de purificación Millipore (18,2 MΩ, EE. UU.). Las jaulas metabólicas se adquirieron de Suzhou Fengshi Laboratory Animal Experiment Co Ltd (China).
Preparación del extracto de Herba Cistanches
Quinientos gramos de material vegetal pulverizado grueso se sometieron a reflujo con 2 L de agua ultrapura durante 2 horas. Después de la filtración, el extracto se evaporó hasta aproximadamente una décima parte del volumen original en un evaporador rotatorio Buchi y se diluyó hasta 250 ml en un matraz volumétrico con agua ultrapura. La concentración final de crudoHerba Cistanchesextracto fue de 2 g/mL.
Dosificación y muestreo
El manejo de todos los animales en este estudio cumplió con las pautas nacionales y se realizó en el Centro de Animales de Laboratorio de la Universidad de Medicina Tradicional China de Shanghái, Shanghái, China. Se compraron un total de 19 ratas Wistar macho de nueve semanas de Shanghai Laboratory Animal Co Ltd (China). Todos los animales se mantuvieron en un sistema de barrera con temperatura regulada (20-22 grados) y humedad (60 ± 10 por ciento), y en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas con luces encendidas a las 8:00 am. Las ratas recibieron alimento y agua ad libitum. Después de dos semanas de aclimatación, los animales se transfirieron a jaulas metabólicas individuales y se dividieron al azar en tres grupos: (1) grupo de tratamiento (n=7) en el que se inyectó hidrocortisona (5 por ciento) ip a 1,5 mg/100 g del peso corporal seguido de la administración oral deHerba Cistanchesextracto por 10 días; (2) grupo modelo (n=7) en el que se inyectó hidrocortisona (5 por ciento) ip a 1,5 mg/100 g una vez al día durante 10 días; y (3) grupo de control (n=5) en el que se inyectó el vehículo por vía ip a aproximadamente 0,6 ml durante 10 días [31].Herba Cistanchesse administró al grupo de tratamiento a una dosis de 20 g/kg siguiendo la recomendación de Shen et al. [30]. Se recogieron muestras de orina de veinticuatro horas a intervalos de tiempo específicos: antes de la dosis (-24 – 0 h), día 1 (0 – 24 h), día 3, día 7 y día 10. Toda la orina las muestras se centrifugaron (6383 × g, LG 16-W, Beijing Jingli Centrifuge Co Ltd, China) durante 10 minutos para eliminar los desechos suspendidos y se almacenaron inmediatamente a -80 grados para su posterior análisis GC-MS.
Preparación de muestras y GC-MS
GC-MS se realizó de acuerdo con nuestro estudio anterior con modificaciones menores [31]. Brevemente, cada alícuota de 0.5 μL de analito derivatizado con trimetilsililo (TMS) se inyectó en una columna capilar de sílice fundida (17 m × 220 μm de diámetro interior, 0,11 μm de espesor de película; HP Ultra{ {9}}, Agilent J&W Scientific, EE. UU.). La GC-MS se llevó a cabo en una cromatografía de gases PerkinElmer con guión y un espectrómetro de masas TurboMass-Auto system XL (PerkinElmer Inc, EE. UU.).
Procesamiento de datos y análisis multivariado
Los datos de GC-MS se convirtieron al formato NetCDF a través de DataBridge (PerkinElmer Inc, EE. UU.). Se ejecutaron secuencias de comandos personalizadas en MATLAB 7.0 (The MathWorks Inc, EE. UU.) para realizar la corrección de la línea de base, la desconvolución y alineación de picos, la exclusión del estándar interno y la normalización a la suma total del cromatograma. La 3-matriz dimensional resultante que abarca el índice de pico arbitrario (tiempo de retención emparejado-m/z), las muestras (observaciones) y las áreas de pico normalizadas (variables) se importaron al software SIMCA-P 11.0 (Umetrics, Suecia) para análisis multivariado.
El centrado medio se realizó por columnas para eliminar las compensaciones. Todos los metabolitos medidos se trataron en el mismo nivel con escalado automático (escalado a la varianza unitaria) antes del análisis multivariado. El análisis de componentes principales (PCA) se realizó utilizando el software SIMCA-P 11.0 para revelar el agrupamiento general, la agrupación y las tendencias entre los sujetos sin conocimiento previo. El primer componente principal (PC1) representa la mayor variación en los datos. El segundo componente principal (PC2) es ortogonal a PC1 y representa la cantidad máxima de varianza no explicada por PC1. Los componentes principales restantes se construyeron de la misma manera. Mientras tanto, las trayectorias medias de las puntuaciones PCA se utilizaron para proporcionar una indicación dinámica del inicio, la progresión y/o la recuperación del síndrome a lo largo del tiempo. Los coeficientes de correlación de los mínimos cuadrados parciales: el análisis discriminante (PLS-DA) se utilizaron para clasificar la importancia de cada variable para capturar aún más los metabolitos expresados diferencialmente responsables de la separación entre grupos. PLS-DA se deriva del método de mínimos cuadrados parciales (PLS), que es un método de regresión múltiple generalizado que trata con múltiples predictores colineales y variables de respuesta [34]. El PLS-DA se realizó utilizando el software SIMCA-P 11.0 [35]. Se realizó una validación cruzada típica de 7-ronda. Una séptima parte de las muestras fueron excluidas del modelo en cada ronda para validar el modelo. Este procedimiento se repitió de manera iterativa para la validación cruzada hasta que cada muestra se excluyó una vez.
Herba Cistanches se puede utilizar para tratar el síndrome de insuficiencia renal
Análisis univariado
Los metabolitos expresados diferencialmente identificados a partir del análisis multivariado también se verificaron en el software MATLAB 7.0 (The MathWorks Inc, EE. UU.) mediante la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis con un nivel de significancia en P < 0.05 .
Resultados y discusión
Interpretación de espectros GC-MS
Los cromatogramas típicos de corriente de iones totales (TIC) de GC-MS de orina de rata en el día 10 del grupo de tratamiento, el grupo modelo y el grupo de control se muestran en la Figura 1. Usando nuestro protocolo de análisis optimizado de GC-MS en asociación con un pico basado en software procedimiento de deconvolución, se detectó consistentemente un total de 117 metabolitos individuales en al menos el 90 por ciento de las muestras de orina. La identificación de compuestos de los picos de interés se realizó comparando el fragmento espectral de masas con las bibliotecas de referencia del NIST (Instituto Nacional de Estándares y Tecnología), las bibliotecas de Wiley y los estándares de referencia. Pudimos verificar 23 de los 117 metabolitos (20 por ciento), la mayoría de los cuales eran aminoácidos, poliaminas, ácidos grasos, purinas y hormonas suprarrenales que están principalmente involucradas en el metabolismo energético, el metabolismo de los lípidos y el metabolismo de los aminoácidos.
Figura 1 Cromatogramas típicos de corriente de iones totales (TIC) de GC-MS de orina en el día 10 del grupo de tratamiento (A), grupo modelo (B) y grupo de control (C).
Cambios dependientes del tiempo en las muestras de orina
Las trayectorias medias de las puntuaciones de PCA derivadas del grupo modelo y el grupo de tratamiento se ilustraron en la Figura 2. El cambio transitorio en el gráfico de trayectoria reveló el progreso dinámico del 'síndrome de insuficiencia renalinducida por hidrocortisona sola o en combinación conHerba Cistanchestratamiento. En el grupo modelo, los patrones metabólicos en el día 1 y el día 3 fueron diferentes a los del día 7 y el día 10, lo que sugiere que la red de regulación metabólica en el día 1 y el día 3 podría haber sufrido un período transitorio con grandes fluctuaciones y que la red perturbada podría haberse restaurado el día 7 y el día 10, lo que finalmente condujo a un patrón estable cercano al estado previo a la dosis. De manera análoga, el hecho de que el patrón metabólico del día 1 y el día 3 se desviara obviamente del de antes de la dosis en el grupo de tratamiento indicaba la tendencia dominante.síndrome de insuficiencia renal' estado. En este período, los efectos de la hidrocortisona fueron probablemente dominantes sobre los de laHerba Cistanchesextracto. Estos hallazgos fueron consistentes con la observación general de que las ratas de ambos grupos mostraron menos actividad en el día 1 y el día 3. Curiosamente, los patrones metabólicos en el día 7 y el día 10 se acercaron de forma gradual y significativa al estado anterior a la dosis, lo que sugiere queHerba Cistanchestuvo algunos efectos contrarrestadores o terapéuticos en las ratas expuestas a la hidrocortisona. Estos resultados apoyan los hallazgos clínicos de queHerba Cistancheses eficaz en el tratamiento de la 'síndrome de insuficiencia renal'. En general, ambas trayectorias brindan una imagen visual, general y dinámica del inicio, la progresión y la recuperación de la 'síndrome de insuficiencia renal'.
Figura 2 Trayectoria media de las puntuaciones de PC1 frente a PC2 para las muestras de orina del grupo modelo (-●-) y el grupo de tratamiento (--●--). Cada punto indica una puntuación media en diferentes momentos, es decir, antes de la dosis, los días 1, 3, 7 y 10. La barra de error representa la desviación estándar para cada momento obtenido por el primer componente principal.
Análisis metabólico comparativo de muestras de orina
Para comprender mejor los efectos metabólicos de la hidrocortisona, comparamos los perfiles metabólicos obtenidos de los grupos de control, modelo y tratamiento. La agrupación general de los tres grupos se puede observar fácilmente en varios momentos, es decir, antes de la dosis, el día 3 y el día 10 (Figura 3). Si bien no existe una tendencia de separación en los perfiles de orina previos a la dosis, los perfiles metabólicos se desviaron de los del grupo de control el día 3 después de la exposición a la hidrocortisona. La perturbación metabólica por hidrocortisona apareció tanto en el grupo de modelo como en el de tratamiento. Sin embargo, después de un tratamiento de 7-días consecutivos conHerba Cistanches, los perfiles metabólicos del grupo de tratamiento volvieron a ser comparables con los del grupo de control, lo que indica queHerba Cistanchesefectivamente restauró el metabolismo perturbado.
Figura 3 Comparación de perfiles metabólicos del grupo de control (diamante negro), grupo modelo (diamante rojo) y grupo de tratamiento (diamante azul) en diferentes momentos: antes de la dosis (A), día 3 (B) y día 10 (C). Cada punto en el gráfico de puntuaciones de PCA representa los datos obtenidos de una rata.
Identificación diferencial de perfiles metabólicos
Se utilizó un modelo PLS-DA con validación cruzada para identificar los metabolitos clave en diferentes perfiles metabólicos para diferenciar más fácilmente entre las ratas del grupo de control y las ratas del grupo modelo (es decir, inducidas con hidrocortisona) con o sinHerba Cistanchestratamiento en el día 3 (Tabla 1). Se determinaron los cambios en la concentración relativa de cada metabolito clave entre los grupos y se produjo la visualización correspondiente de los cambios entre los grupos antes de la dosis, el día 3 y el día 10 (Figura 4). Como se muestra en la Figura 4 y la Tabla 1, mientras que la mayoría de los metabolitos endógenos aumentaron o disminuyeron significativamente en el grupo modelo, los del grupo de tratamiento pasaron por un período transitorio, como se observó el día 1 y el día 3, y se acercaron gradualmente al nivel de control (normal). . Por ejemplo, en comparación con la ligera variación (1,1 a 1,5 veces) de los metabolitos en el grupo de tratamiento el día 10, se observaron niveles muy elevados (1,7 a 3,0 veces) de tirosina, tiramina, dopamina y noradrenalina en la orina. grupo modelo durante todo el experimento. Nuestro estudio anterior mostró que el aumento del metabolismo de las catecolaminas inducido por los glucocorticoides resultó en un consumo excesivo de funciones inmunitarias, lo que condujo a la 'síndrome de insuficiencia renal' [31]. Herba Cistanches, una hierba tónica que mejora el sistema inmunológico [36], puede contrarrestar algunos efectos de la hidrocortisona.Herba Cistanchestambién puede restaurar una red reguladora metabólica normal. Se requieren más experimentos con diferentes enfoques como biología molecular, biología celular y química vegetal para delinear las acciones deHerba Cistanches(y sus constituyentes) en el 'síndrome de insuficiencia renal'.
Tabla 1 Una lista de metabolitos incluidos en el perfil metabólico del presente estudio
De: El perfil metabólico revela los efectos terapéuticos deHerba Cistanchesen un modelo animal de hidrocortisona inducida 'síndrome de insuficiencia renal'
Nota: Los coeficientes de correlación (coeficientes de corrección) de todos los compuestos se calcularon a partir de un modelo PLS-DA con validación cruzada (Q2Ycum=0.899, un modelo satisfactorio que usa dos componentes) el día 3 entre el grupo de control y el grupo modelo. con o sinHerba Cistanchestratamiento. Además, los cambios de pliegue se probaron mediante la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis. Kw (P) denota los valores P de la prueba. H=grupo de control, M=grupo modelo, D=grupo de tratamiento. Por ejemplo, H/M/0 representa los cambios de pliegue relativos (del modelo al control) en el estado anterior a la dosis.
Figura 4 Cambios en el pliegue de los metabolitos clave. El color rojo indica concentraciones relativamente elevadas (cambios en veces > 1,5), mientras que el color verde indica concentraciones relativamente reducidas (cambios en veces < -1,5).="" los="" cambios="" de="" pliegue="" que="" van="" desde="" -1.5="" a="" 1.5="" se="" consideran="" variaciones="" fisiológicas.="" un="" cambio="" de="" pliegue="" (m/h,="" d/h)="" es="" la="" proporción="" de="" concentración="" del="" grupo="" modelo="" o="" grupo="" de="" tratamiento="" con="" respecto="" al="" grupo="" de="">
Conclusión
El presente estudio de perfiles metabólicos usando GC-MS mostró queHerba Cistanchesprovocó una recuperación sistémica de la perturbación metabólica inducida por hidrocortisona en ratas, un modelo animal para el 'síndrome de insuficiencia renal'. Este estudio también demuestra que el perfil metabólico es un método útil para estudiar los efectos terapéuticos de las hierbas medicinales.
abreviaturas
EM: espectrometría de masas
GC-MS: cromatografía de gases-espectrometría de masas
RMN: resonancia magnética nuclear
PCA: análisis de componentes principales
PLS-DA: mínimos cuadrados parciales – análisis discriminante
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