Análisis Del Tubular Proximal Y Glomérulo Del Riñón
Mar 15, 2022
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Perfiles proteómicos casi unicelulares del túbulo proximal y el glomérulo del riñón humano normal--Parte II
Tara K Sigdel1, Paul D. Piehowski2, Sudeshna Roy1, Juliana Liberto1, Joshua R. Hansen2, Adam C. Swensen2, Rui Zhao3, Ying Zhu3, Priyanka Rashmi1, Andrew Schroeder1, Isabella Damm1, Esvástica Sur1, Jinghui Luo4, Yingbao Yang4, Wei Jun Qian2* y Minnie M. Sarwal1* para el Consorcio del Proyecto de Medicina de Precisión del Riñón (KPMP)
Resultados
La recolección de riñón congelado OCT es el método preferido para la proteómica del tejido renal
Para la misma cantidad de tejido de entrada, OCT congeladoriñónprodujo más proteína que las secciones FFPE del mismo riñón (OCT congelada: 1871 ± 92 vs. FFPE: 296 ± 10 ng de proteína; p < 0,0017), lo que sugiere una posible degradación de la proteína en FFPE, a pesar de que el tejido está incrustado en parafina bloques para<2 months.="" bulk="" proteomics="" data="" from="" the="" two="" human="">riñones(n.º 1, n.º 2) demostraron una superposición significativa de proteínas identificadas con un 84 % de superposición entre los 2 riñones OCT (límite de reproducibilidad=13.52, 97,96 % de valores dentro del límite de reproducibilidad) y un 83 % de superposición del mismo riñón proteínas entre los 2 riñones FFPE (límite de reproducibilidad=24.43, valores del 98,5 por ciento dentro del límite de reproducibilidad) (Tabla 1 y Figura 2B complementarias). Dentro de cada riñón, independientemente del método de almacenamiento de tejido, se conservó ~ 70 por ciento de las proteínas estructurales del riñón (principalmente matriz extracelular), lo que sugiere que algunas proteínas se detectaron de manera más preferencial por cada método. Para evaluar qué enriquecimiento de proteínas se observa entre los diferentes métodos de recolección, encontramos que la proteómica de tejido OCT produjo más proteínas con recuentos espectrales altos Mayores o iguales a 5 (odds ratio=1.460601; intervalo de confianza del 95 por ciento {{21} }.238969, 1.722593; p=4.472e-06), lo que puede reflejar una mejor conservación del tejido renal en OCT (Figura 2C). El análisis proteómico del tejido OCT también muestreó más proteínas únicas en comparación con el tejido FFPE (odds ratio=3.207089; intervalo de confianza del 95 por ciento=2.371221, 4.370600; p=4.985e{{ 38}}) (Figura 2D). Además, se encontró que muchas de estas proteínas únicas eran de baja abundancia y es más probable que se pasen por alto, incluso con tiempos de conservación muy cortos del tejido renal en FFPE. Independientemente del método de conservación del tejido, notamos que había una fuerte superposición en las vías biológicas comunes. Las rutas incluyeron procesos metabólicos de moléculas pequeñas (p=2.59E-121 para OCT y p=2.15E-109 para FFPE), procesos metabólicos de ácido carboxílico (p {{47 }}.62E-80 para OCT y p=1.93 E-76 para FFPE), procesos metabólicos de ácidos orgánicos (p=1.26E-76 para OCT y p=3.62E-80 para FFPE) y procesos de metabolismo de fármacos (p=7.90E-83 para OCT y p=4.01E{{64} } para FFPE). Estos datos destacan cómo la proteómica del tejido renal es altamente reproducible, independientemente del método de conservación del tejido para los dos métodos probados.
La proteómica del tejido renal es altamente reproducible en tejido renal congelado OCT transportado
Analizamos los datos generados en los dos sitios (UCSF y la Universidad Estatal de Ohio) que siguieron el mismo protocolo para realizar proteómica a granel, como se describe en la sección de métodos. Sorprendentemente, ~ 70 por ciento de proteínas se identificaron comúnmente en el mismoriñónprocesado en dos sitios diferentes con recuento espectral mayor o igual a 5 (r=0.95, P < 0.0001)="" (datos="" sin="" procesar="" proporcionados="" en="" la="" tabla="" complementaria="" 2).="" más="" importante="" aún,="" los="">riñonesenviado desde un sitio central produjo datos altamente correlacionados (r=0.89, P=0.0001) (Tabla complementaria 2), lo que respalda que los protocolos analíticos de procesamiento de tejidos en el lugar eran bastante sólidos.
Optimización de la captura de células renales mediante microdisección de captura láser (LCM)
Espesores variables de secciones de OCT montadas en portaobjetos de PET del mismoriñón(n=2) se probaron a 5, 10 y 20 μm de espesor, por triplicado, para determinar la repetibilidad de LCM. Se encontró que la sección de 10 μm era la más óptima en las pruebas de LCM en serie, utilizando el sistema de microdisección láser Zeiss PALM MicroBeam (Cut Energy, 64; Cut Focus, 75). Las células cortadas se capturaron en tapas adhesivas. Además de la repetibilidad del proceso LCM, también encontramos la máxima eficiencia de captura de las células catapultadas con un grosor de sección OCT de 10 μm.
La proteómica de células subcompartimentales en riñón humano normal identifica proteínas glomerulares y tubulares proximales únicas y enriquecidas
A través de los 9 humanos normalesriñonesprocessed by nscProteomics, with input of an average of 10–40 cells input each/Glom and PT fraction, we identified an average of ~2,560 proteins/sample. Interestingly, ~20% of the total proteins assessed by nscProteomics, from either sub-compartment overlapped across compartments/cells and bulk tissue, representing likely housekeeping or more structural kidney proteins that are not compartment specific. In a direct comparison of the two sub-compartments, 208 proteins were enriched (>2 fold) in Glom, and 67 were completely unique to Glom (absent in PT); and conversely, 247 proteins were enriched (>2 veces) en PT, y 25 eran exclusivos de PT (ausentes en Glom) (Tabla complementaria 3). A pesar del conjunto de muestras relativamente pequeño, también realizamos una validación entre lotes, tratando cada lote de ejecuciones como un conjunto independiente. Incluso con un pequeño conjunto único deriñones(2 en el lote 1, 4 en el lote 2), las proteínas enriquecidas con 210 Glom estaban altamente correlacionadas entre los dos conjuntos independientes, a pesar de que estos datos provienen de diferentes cohortes de normalesriñones(r=0.83; Figura 3A) y analizados en diferentes momentos. Las proteínas enriquecidas con 246 PT también podrían correlacionarse entre las dos cohortes diferentes de riñones normales (r=0.77; Figura 3B). Los resultados destacan que nscProteomics es capaz de identificar proteínas específicas de subcompartimentos conservadas en diferentes unidades funcionales del riñón de forma reproducible.
Figura 3. (A) Correlación de un conjunto de 210 proteínas significativamente enriquecidas engloméruloentre dos lotes diferentes de muestras de riñón independientes. El Lote 1 (ensayo 1) fue de 2 riñones y el Lote 2 (ensayo 2) fue de 4 riñones. La escala de colores se seleccionó para la representación visual de la abundancia. Una fuerte correlación positiva de 0.83 entre las abundancias medias del mismo conjunto de proteínas de dos lotes diferentes Las líneas discontinuas rojas dan una medida de la dispersión al representar el intervalo de predicción del 95 por ciento para los valores de abundancia media de estas proteínas en futuros experimentos repetidos. (B) Correlación de 246 proteínas significativamente enriquecidas entúbulos proximalescontragloméruloentre los dos lotes. Una correlación positiva de 0.77 entre las abundancias medias de estas mismas proteínas entre los dos lotes.
Determinar la especificidad del enfoque nscProtoemics parariñónanálisis de subcompartimento, comparamos los datos Glom y PT del subcompartimento renal de nscProteomics con la proteómica a granel del mismo conjunto de tejido renal. Descubrimos que ~25 por ciento (n=656) de las proteínas identificadas en ambos subcompartimentos ni siquiera fueron detectadas por la proteómica de tejido a granel, ya que probablemente tenían una abundancia muy baja en la muestra a granel; Las proteínas enriquecidas con 118 Glom y 74 PT no se pudieron detectar en el riñón a granel, lo que destaca la limitación de realizar únicamente proteómica de tejido a granel. Solo el 9 por ciento de las proteínas específicas de Glom, pero una cantidad mayor del 48 por ciento de las proteínas específicas de PT, se identificaron mediante proteómica del volumen renal, lo que refleja la abundancia mucho mayor de células PT sobre las células Glom en el organismo normal.riñón. De hecho, algunos marcadores conocidos para las células glomerulares, como podocina (NPHS2), eva-1 homólogo B (EVA1B), MARCKS like 1 (MARCKSL1), factor de crecimiento de fibroblastos 1 (FGF1) y claudina 5 (CLDN5) podrían no ser identificado por la proteómica del riñón a granel a profundidades de ejecución estándar de ~2,000.
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Validación de marcadores Glom y PT evaluados por nscProteomics
La mayoría de las proteínas del subcompartimento se informaron como detectadas enriñónpor IHC en datos publicados previamente (Human Protein Atlas) (25). Las proteínas que no fueron detectadas por IHC (marcadas con *) o datos no disponibles (marcadas con **) se indican en las Figuras 4A, B. Tomamos las 26 proteínas enriquecidas con glom y las 26 proteínas específicas de PT e interrogamos a células individuales. datos transcriptómicos (datos scRNA Seq) para la integración y validación "cross-omics" (Figura 4B). El resultado del análisis integrador de los mejores marcadores de Glom y PT mediante proteómica y transcriptómica demostró una fuerte correlación de algunas de las proteínas conocidas de los marcadores de Glom y PT. Los marcadores de podocitos como PODXL y CLIC5 y los marcadores PT como PDZK1 y ANPEP estaban muy enriquecidos en ambos conjuntos de datos. Además de validar marcadores conocidos, nscProteomics también ha identificado proteínas que se identifican en baja abundancia en los conjuntos de datos transcriptómicos o en los conjuntos de datos IHC. Por ejemplo, PITPNB es un marcador glomerular altamente enriquecido por datos de nscProteomics; sin embargo, la detección de este gen fue baja en los datos transcriptómicos y no fue detectable por IHC (25). Se observó un caso similar con SLC5A1, cuya señal se mejoró en los datos de nscProteomics pero no en los conjuntos de datos transcriptómicos o IHC (Figura 4C).
Figura 4. (A) Mapa de calor que muestra la distribución diferencial de la abundancia de proteínas en 5riñones(lote 2), de 26 proteínas (de 372) más significativamente enriquecidas en G (frente a T) y 26 proteínas (de 411) más significativamente enriquecidas en T (frente a G), con los valores correspondientes en 2 muestras a granel que se muestran para comparación . Las abundancias de proteínas se miden como intensidades relativas transformadas log 2. La agrupación no supervisada de proteínas significativas destaca conjuntos de proteínas relacionadas por la medida de similitud de distancia euclidiana dentro de los conjuntos enriquecidos diferenciados más grandes. Se observa que las muestras a granel se agrupan junto con las muestras PT; esto se espera desdetúbulos proximalesestán abundantemente dispersos dentro de lariñón. (B) Correlación de la gráfica de expresión génica de datos scRNA-seq de humanosriñón. Se seleccionaron genes que codifican proteínas específicas de Glom y específicas de PT presentadas en el mapa de calor. El aumento del tamaño del punto corresponde a un mayor porcentaje de células en la población celular que expresa el gen, mientras que un color más oscuro corresponde a una mayor expresión del gen. pt,túbulo proximal; Podo, podocitos; mes, células mesangiales; LOH, Asa de Henle, Células inmunitarias; Endo, células endoteliales; DT, túbulos distales; CD, conducto colector. *El signo junto al símbolo del gen indica que la proteína no se detectó en los glomérulos según lo informado por Human Protein Atlas (https://www.proteinatlas.org), **Datos no disponibles en Human Protein Atlas (https://www. proteinatlas.org). (C) Proteínas representativas que demuestran cómo nscProteomics no solo identifica marcadores positivos como PODXL y PDZK1, sino que también identifica marcadores de proteínas como los que, de otro modo, la transcriptómica o la inmunohistoquímica pasan por alto.
Importancia biológica de las proteínas enriquecidas con Glom y PT
Usamos los datos generados a través del protocolo desarrollado para nscProteomics para observar las proteínas que estaban significativamente enriquecidas en las células glomerulares o en lastúbulo proximalcélulas. Las proteínas enriquecidas con 208 Glom se enriquecieron en transporte mediado por vesículas (FDR 3.6E-15) y regulación de la organización de componentes celulares (FDR 9.75E-14) como sus principales procesos biológicos y unión a proteínas del citoesqueleto (FDR 2.63 E-19) y de unión a actina (FDR 2.40E-17) entre las funciones moleculares mejor clasificadas. Además, el citoesqueleto de actina (FDR 3,73 E-25) y la adhesión focal (FDR 4,07E-20) fueron los principales componentes celulares enriquecidos. Las proteínas enriquecidas con 247 PT se enriquecieron en procesos metabólicos de moléculas pequeñas (FDR 7.55E-50) y procesos metabólicos de fármacos (FDR 5.00E-41) como procesos biológicos superiores. Las proteínas se enriquecieron en actividad oxidorreductasa (FDR 9.07E-34) y actividad catalítica (FDR 1.05E-27) entre las funciones moleculares mejor clasificadas.
nscProteomics identifica un conjunto único de proteínas Glom y PT
Aparte de las proteínas enriquecidas en las secciones Glom o PT, 92 proteínas eran exclusivas de Glom (n=67) o exclusivas de PT (n=25), ya que solo se identificaron en las células glomerulares o eltúbulo proximalcélulas (Tabla 1). Las proteínas identificadas solo en las células glomerulares estaban enriquecidas en funciones moleculares como unión a actina (FDR 4.92E-06), unión a proteínas del citoesqueleto (FDR 3.47E-05), unión a integrina (3.9E{ {11}}), etc. Utilizamos esta lista para interrogar los datos disponibles públicamente que habían informado previamente de su presencia en elglomérulo. Entre las 67 proteínas identificadas solo en las secciones Glom, se ha informado que 41 están presentes en elriñón(25). De estas 41 proteínas, un subconjunto de 18 (43,9 por ciento) está de acuerdo con nscProteomics y se informa que 23 (56,1 por ciento) no aumentan en Glom en comparación con los túbulos. Entre las 25 proteínas identificadas solo en las secciones PT, se ha informado que 20 están presentes en elriñón(25). Estas proteínas están enriquecidas en funciones moleculares como la actividad del transportador transmembrana de aniones orgánicos (FDR 6.34E-05), la actividad del transportador transmembrana de ácido carboxílico (FDR 1.4E-04), la actividad del simportador de soluto: sodio (FDR 1.8 E -04), etc. De las 25 proteínas específicas de PT, un subconjunto de 19 proteínas (95.0 por ciento) están de acuerdo con nscProteomics y solo 1 (5.0 por ciento) es se informó que no aumentó en los túbulos en comparación con Glom.
Tabla 1. Proteínas enriquecidas en glomerular ytúbulo proximalcélulas identificadas por nscProteomics.
Discusión
Con el rápido avance de la genómica unicelular y los ensayos transcriptómicos, todavía existe una necesidad insatisfecha de realizar estudios unicelulares paralelos en valiosas muestras humanas en el campo de la proteómica (27). El perfil de proteínas de una sola célula se enfrenta al obstáculo de la virtud de que no tenemos la capacidad de amplificación de proteínas de la misma manera que podemos amplificar los nucleótidos. En esta primera aplicación de la proteómica de células casi unicelulares en el ser humanoriñón, demostramos que la cuantificación proteómica sin etiqueta robusta es factible para tan solo 40riñóncélulas, específicas para diferentes subcompartimentos LCM. Los protocolos desarrollados para la proteómica renal de células casi unicelulares beneficiarán a otros investigadores que trabajan en el campo de las enfermedades renales.
Un estudio reciente de Hoehne et al. demostró el uso de la tecnología de preparación de muestras mejorada en fase sólida de un solo recipiente (SP3) para el análisis proteómico de segmentos renales (4). Usando glomérulos microdiseccionados individuales con ~200 células, los autores ilustraron la heterogeneidad de los proteomas de glomérulos individuales de modelos de ratón y pacientes humanos. Otro estudio reciente de Song et al. (28) utilizaron tejido FFPE de receptores de trasplantes renales para crear una plataforma de diagnóstico molecular utilizando proteómica masiva. En este manuscrito, hemos optimizado y analizado con gran detalle el proceso de recolección de tejido para MS para establecer un protocolo estándar para el análisis proteómico de pequeñas muestras de tejido. En primer lugar, comparamos el método de almacenamiento de tejido FFPE frente a OCT para mostrar que, si bien existe una alta correlación entre los dos conjuntos de datos, el tejido OCT produce un mayor contenido de proteínas y, lo que es más importante, la capacidad de identificar proteínas de baja abundancia. En segundo lugar, los protocolos de MS para la proteómica a granel se han optimizado de manera que se pueden obtener resultados altamente reproducibles (r=0.95) en sitios dispares en cortes en serie, adyacentes.riñónsecciones de tejido. Tercero, donde describimos un enfoque para acoplar la microdisección de captura láser para reducir la cantidad de muestra de entrada a 10-40 células con una tecnología nano POTS que consiste en una plataforma robótica para manejar con precisión volúmenes de picolitros. Nuestro enfoque nos permite controlar el número de entrada de células, mejorando así la reproducibilidad de diferentes muestras de glóbulos y túbulos. Debido a la simplicidad de LCM y la precisión de la tecnología nano POTS, creemos que nuestro estudio permitirá la adopción de la proteómica en muestras clínicas preciosas de manera reproducible.
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Las limitaciones de este estudio incluyen el pequeño tamaño de la muestra y la limitación del tejido que no nos permitió hacer la validación espacial del tejido por inmunohistoquímica. Para paliar parcialmente esta limitación, proporcionamos análisis de datos integrados con datos de scRNA Seq de los mismos tejidos para confirmar que las proteínas identificadas enriñónlos subcompartimentos también se identifican en la misma célula tisular de origen mediante transcripción. Una limitación adicional es que identificamos un número restringido de proteínas por nscProteomics, probablemente debido al pequeño material de entrada, lo que corre el riesgo de que MS no identifique algunas proteínas, ya que podrían estar por debajo del límite de detección del instrumento. La mejora en la sensibilidad del instrumento y la extracción de proteínas a partir de una entrada de muestra pequeña puede ayudar a mejorar esta limitación actual.
Reconocemos que hay muchas variables que pueden contribuir a la calidad de los datos. El tiempo de almacenamiento, los fijadores FFPE (es decir, PFA frente a glutaraldehído), la duración del fijador, el tiempo en el congelador/en hielo seco/en nitrógeno líquido, los enfoques para la solubilización de proteínas son algunos de los factores que podrían contribuir a los resultados proteómicos. Es importante darse cuenta de que incluso la biología de dosriñonesno siempre es el mismo y eso es cierto incluso dentro de los mismos riñones como glomérulos del mismoriñónlas biopsias pueden estar en un estado funcional diferente. Histológicamente,riñónLos compartimentos son extremadamente heterogéneos incluso dentro de la misma enfermedad. Al capturar las mismas regiones del riñón de diferentes muestras de entrada, nscProteomics permite interrogar la heterogeneidad dentro de compartimentos subcelulares específicos, lo cual es una fortaleza de esta tecnología.
Observamos que algunas proteínas subcompartimentales identificadas por nscProtoemics son potencialmente novedosas glomerulares ytúbulo proximalproteinas Innovaciones en análisis integrativo de datos con RNA unicelular Seq de los mismosriñónlas muestras, aunque preliminares, proporcionarían la confirmación de que estas proteínas están realmente localizadas en sus subregiones muestreadas/predichas.
Este estudio proporciona información sobre la complejidad no descubierta de los patrones moleculares enriñónsubcompartimentos en salud y respalda la aplicación de esta tecnología a muestras de enfermedad renal para comprender la perturbación de las proteínas en diferentes subcompartimentos renales que pueden verse afectados preferentemente en diferentes trastornos renales. La regulación diferencial de estas proteínas en diferentes enfermedades renales podría descubrir heterogeneidad clínica y pronóstica en fenotipos de enfermedades glomerulares y tubulares complejas y descubrir nuevos desencadenantes de daño y recuperación renal. Además, dada la escasez de medicamentos protectores renales, descubrir estas nuevas vías en regiones específicas del riñón puede proporcionar nuevos objetivos importantes para el diseño racional de medicamentos para tratar lesiones específicas en diferentes subcompartimentos en una variedad de trastornos renales.
Por lo tanto, en conclusión, presentamos un flujo de trabajo de nscproteomics para el manejo de 10-40riñóncélulas; la mejora en esta tecnología conlleva la promesa de reducir el material de entrada en el futuro al nivel de una sola celda. Se están realizando desarrollos futuros, como volúmenes de procesamiento optimizados y mejoras adicionales a la plataforma LC-MS.
Declaración de disponibilidad de datos
Los conjuntos de datos generados para este estudio se pueden encontrar en PRIDE PXD015058 y 10.6019/PXD015058.
Contribuciones de autor
TS y MS conceptualizaron el estudio. TS, JLi, JH, ACS, RZ, YZ, PR, ID, SS, JLu e YY ayudaron en el procesamiento de muestras y la generación de datos experimentales, TS, PP, SR, AS, W-JQ y MS contribuyeron en el análisis de datos y preparación del manuscrito. Todos los autores contribuyeron al artículo y aprobaron la versión enviada.
Fondos
El financiamiento de este trabajo provino de laRiñónProyecto de medicina de precisión, NIDDK NIHUG3 -DK114937 (MS) y R01 DK109720-02 (MS), DP3 DK110844 (W-JQ), R01 DK122160 (W-JQ) y apoyo de la División de Multi -Trasplante de Órganos (MS).
Conflicto de intereses
Los autores declaran que la investigación se realizó en ausencia de cualquier relación comercial o financiera que pudiera interpretarse como un potencial conflicto de interés.
Expresiones de gratitud
Agradecemos la ayuda de Zoltan Laszik y Gyula Szabo de UCSF para ayudar con el procesamiento de tejidos. Samir Parekh y Brad Rovin de la Universidad Estatal de Ohio (OSU), por sus colaboraciones de especificaciones de masas en proteómica a granel y el control de calidad para el tejido proteómico a granel compartido entre UCSF y OSU, y Jeff Hodgin y Matthias Kretzler de la Universidad de Michigan por proporcionar amablemente acceso a la referenciariñónmuestras Parte del trabajo experimental descrito en este documento se realizó en el Laboratorio de Ciencias Moleculares Ambientales, Laboratorio Nacional del Noroeste del Pacífico, una instalación científica nacional patrocinada por el Departamento de Energía bajo el Contrato DEAC05-76RL0 1830.
Material suplementario
El material complementario de este artículo se puede encontrar en línea en: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmed.2020.00499/full#supplementary-material
abreviaturas
nscProteomics, proteómica casi unicelular; KPMP,RiñónProyecto de Medicina de Precisión; pt,túbulo proximal; Glom, glomerular; LCM, microdisección por captura láser; μPOTS, procesamiento de microlitros en un recipiente para muestras de trazas; OCT, temperatura óptima de corte; FFPE, embebido en parafina fijado en formalina; UM, Universidad de Michigan; OSU, Universidad Estatal de Ohio; DDM, n-dodecil-D-maltósido; scRNA Seq, secuenciación de ARN de una sola célula; IHC, inmunohistoquímica.
From: 'Near-Single-Cell Proteomics Profiling of the Proximal Tubular and Glomerulus of the Normal Human Kidney' by Tara K Sigdel1, Paul D. Piehowski2, Sudeshna Roy1, Juliana Liberto1, Joshua R. Hansen2, Adam C. Swensen2, Rui Zhao3, Ying Zhu3, Priyanka Rashmi1, Andrew Schroeder1, Isabella Damm1, Esvástica Sur1, Jinghui Luo4, Yingbao Yang4, Wei Jun Qian2* y Minnie M. Sarwal1* para el Consorcio del Proyecto de Medicina de Precisión del Riñón (KPMP)
---Artículo de INVESTIGACIÓN ORIGINAL Portada. Med., 17 de septiembre de 2020|https://doi.org/10.3389/fmed.2020.00499
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