La causa de la enfermedad renal crónica (ERC)- Anemia

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PARTE Ⅰ: La enfermedad renal crónica proteinúrica está asociada con la alteración de la vida útil, la deformabilidad y el metabolismo de los glóbulos rojos

Rosi Bissinger, Travis Nemkov y otros.

El desarrollo deanemiaes una complicación típica de la enfermedad avanzadaenfermedad renal cronica(ERC) y se asocia con deterioro de la calidad de vida¹y mayor riesgo de eventos cardiovasculares²y hospitalización,³así como el deterioro cognitivo.⁴La severidad deanemiaha sido visto como un predictor independiente de mortalidad tanto en la ERC dependiente de diálisis como en la no diálisis.enfermedad renal cronica) pacientes.⁵La fisiopatología de la enfermedad renal asociadaanemiaes complejo e involucra deficiencia de hierro y eritropoyetina (EPO) en el contexto de inflamación de bajo grado, que, a su vez, compromete la eritropoyesis normal en la ERC.enfermedad renal cronica) pacientes.⁶En ERC avanzada (enfermedad renal cronica), la respuesta de EPO es inadecuadamente baja en relación con el grado deanemia.^7,8 La alta prevalencia de la deficiencia de hierro concomitante en la ERC (enfermedad renal cronica) es una consecuencia de la alteración de la homeostasis del hierro.⁹ Un mecanismo descuidado de pérdida de hierro en la ERC (enfermedad renal cronica) es la proteinuria, que puede conducir a pérdidas urinarias de hierro unido a la transferrina (hasta 0.3 mg/d) cuando la proteinuria alcanza el rango nefrótico.¹⁰Otro factor que se cree que contribuye aanemiaen ERC (enfermedad renal cronica) patients is the shortened lifespan of red blood cells (RBCs), first described >hace 60 años^6,11,12

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Un estudio reciente que utilizó una prueba de aliento con monóxido de carbono demostró que la vida útil de los glóbulos rojos disminuyó progresivamente de 120 días en pacientes con ERC en etapa 1 (enfermedad renal cronica) a 60 días en pacientes con ERC en estadio 5 (enfermedad renal cronica).¹³ En particular, la transfusión de glóbulos rojos alogénicos de donantes sanos a la ERC (enfermedad renal cronica) los pacientes fueron seguidos por una eliminación rápida de los glóbulos rojos transfundidos sin evidencia de hemólisis.¹²Un mecanismo plausible para esta observación puede ser la estimulación de la muerte celular similar a la apoptosis en los glóbulos rojos anucleados, lo que denota un patrón de lesión en el que la integridad de la membrana celular no se ve comprometida y el contenido citoplasmático permanece intacto.¹⁴Los glóbulos rojos que experimentan muerte celular exhiben diversas alteraciones morfológicas que resultan del daño del citoesqueleto, como la formación de ampollas en la superficie, pérdida de elasticidad de la membrana y/o deshidratación celular.¹⁵A nivel molecular, la muerte de glóbulos rojos se asocia con la acumulación de Ca2+ intracelular, el estado energético celular alterado y la ruptura de la asimetría de fosfolípidos, lo que en última instancia conduce a la externalización de fosfatidilserina (PS) en la membrana plasmática externa.^15,16Como consecuencia, los macrófagos y las células dendríticas especializadas reconocen rápidamente los glóbulos rojos externalizados con PS, lo que lleva a la fagocitosis por eritrosis y su catabolismo en el bazo y el hígado.¹⁷Debido a la fisiopatología confusa deenfermedad del riñon-asociadoanemiaen humanos, los estudios en animales están garantizados para identificar los mecanismos contribuyentes. Nefropatía inducida por doxorrubicina (DIN) en ratones 129S1/SvImJ¹⁸y ratones con deficiencia de podocina inducible (Nphs2Dipod)¹⁹son 2 modelos que se caracterizan por la inducción de proteinuria en rango nefrótico en días, progresión a insuficiencia renal a las 3 semanas y muerte en 6 a 7 semanas.^19–21Ambos modelos de ratón recapitulan efectivamente todas las etapas de la ERC humana (enfermedad renal cronica). En el presente estudio, probamos si la insuficiencia renal progresiva en estos ratones con proteinuriaenfermedad del riñonafecta la vida útil de los glóbulos rojos y contribuye aanemia. Paralelamente, examinamos el fenotipo de RBC en sangre extraída de CKD (enfermedad renal cronica) pacientes con proteinuria en rango nefrótico.

ERC (enfermedad renal cronica) yanemia: CISTANCHE

MÉTODOS

Se proporciona información detallada sobre los materiales y métodos en Materiales y métodos complementarios.

Estudios con ratones

Los experimentos se realizaron en ratones 129S1/SvImJ de tipo salvaje de 8-semanas de edad de ambos sexos (Charles River). La DIN se indujo mediante una única inyección de doxorrubicina (14,5 mg/g de peso corporal), como se describió anteriormente.^18,22Para controlar el efecto mielotóxico de la doxorrubicina no relacionado con el desarrollo de nefropatía, los ratones C57BL/6 resistentes a la doxorrubicina también se sometieron al mismo protocolo de tratamiento.²³ Además, se realizaron experimentos similares en ratones de 8-semanas de edad con deleción inducible de podocina (B6-Nphs2tm3.1Antc*Tg [Nphs1-rtTA*3G] 8Jhm*Tg[tetO -cre]1Jaw) o ratones Nphs2Dipod, que fueron tratados con doxiciclina durante 14 días.¹⁹Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud y la Ley Alemana para el Bienestar de los Animales, con la aprobación de las autoridades locales (Regierungspräsidium Tübingen, números de aprobación M12/17 y M17/19G ). El diseño experimental de los estudios con ratones se describe en la Figura complementaria S1.

Pacientes

El estudio de pacientes se realizó de conformidad con la Declaración de Helsinki y fue aprobado por el comité de ética local del Hospital Universitario de Tübingen (556/2018BO2). Se obtuvieron muestras de sangre y orina con heparina de litio de pacientes con proteinuria en rango nefrótico y tasa de filtración glomerular conservada (TFG; estadios 1-2; n=10) y pacientes con TFG reducida (ERC (enfermedad renal cronica) estadio 3–5; n ¼ 15) en el Hospital Universitario de Tübingen. Como grupo de control, el banco de sangre del Hospital Universitario de Tübingen proporcionó sangre de voluntarios sanos de la misma edad y sexo (n=25). Todas las muestras humanas se recolectaron después del consentimiento informado. Las características clínicas de los pacientes se indican enTabla 1.

Tabla 1|Características de los pacientes con ERC (enfermedad renal crónica) y donantes de sangre sanos

Análisis de citometría de flujo

Se determinaron diferentes parámetros de muerte de células RBC mediante citometría compañera.¹⁴ Para determinar la vida útil de los glóbulos rojos in vivo, se inyectaron 25 ml de colorante 5,6-carboxifluoresceína diacetato succinimidiléster [5(6)-CFDA, SE] a una concentración de 9,96 mM (solubilizado en dimetilsulfóxido) en el retroorbital. plexo de 129S1/SvImJ de tipo salvaje y ratones a los que se les inyectó doxorrubicina, como se describió anteriormente. células fue detectada por análisis de citometría compañeros. Finalmente, los datos se analizaron utilizando el software FlowJo (FlowJo LLC).

Deformabilidad de glóbulos rojos y ektacitometría de gradiente osmótico

La deformabilidad de los glóbulos rojos se midió utilizando el analizador de células de rotación óptica asistido por láser (LORCA Max Sis; RR Mechatronics), que se ha descrito en detalle en otra parte.²⁵Los análisis de ektacitometría de gradiente osmótico (cosmos can) también se realizaron utilizando LORCA Max Sis y miden la deformabilidad en diversas condiciones osmóticas.²⁶

Examen histológico

Para la tinción con hematoxilina y eosina, los bazos y los fémures se tiñeron con hematoxilina y eosina. Todos los portaobjetos se tiñeron con el anticuerpo primario Ter119 (BD Pharmingen; dilución 1:500). Para la tinción con ácido peryódico de Schiff, cortes de 2.5-mm de espesor de lariñonesse tiñeron con ácido peryódico-reactivo de Schiff (Carl Roth) y hematoxilina (Abcam). Se realizó la tinción de May-Grünwald-Giemsa (método de Pappenheim) para determinar los cambios de forma de los glóbulos rojos, como se describió anteriormente.²⁷ El aislamiento de los glomérulos se realizó utilizando un enfoque de biotinilación y clasificación celular.¹⁹Para la detección de proteínas de podocina, se aplicó un anticuerpo de Sigma (P0372).¹⁹Roti-Mount Fluor Care 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; Carl Roth) se usó para teñir los núcleos.

Cromatografía líquida de ultra alta resolución-espectrometría de masas metabolómica de glóbulos rojos de ratón

Los análisis se realizaron como se publicó previamente.²⁸En resumen, la plataforma analítica emplea un sistema de cromatografía líquida de rendimiento ultraalto Vanquish (Thermo Fisher Scientific) acoplado en línea a un espectrómetro de masas Q Exactive (Thermo Fisher Scientific).

Cistanche tratar la enfermedad renal causada por anemia

Análisis estadístico

Los datos se proporcionan como medias aritméticas SEM o como mediana con rango intercuartílico (percentil 25-75) donde n representa el número de animales utilizados o pacientes incluidos, respectivamente. Se probó la normalidad de los datos con la prueba de Kolmogorov-Smirnov, la prueba de D'Agostino y la prueba de Shapiro-Wilk. Las varianzas se analizaron mediante la prueba de Bartlett para varianzas iguales. GraphPad Prism 8 (GraphPad Software) realizó la prueba posterior de comparación múltiple de Tukey o Dunn, la prueba t de Student no pareada o la prueba U de Mann-Whitney. P < 0.05="" con="" 2-="" prueba="" de="" cola="" se="" consideró="" estadísticamente="" significativa.="" se="" trazaron="" gráficos="" adicionales="" a="" través="" de="" graphpad="" prism="">

RESULTADOS

La enfermedad renal proteinúrica experimental induceanemiaen ratones Después de la inducción, los ratones 129S1/SvImJ con ratones DIN y Nphs2Dipod desarrollaron proteinuria de rango nefrótico (Figura 1a y Figura complementaria S2C) e insuficiencia renal progresiva caracterizada por niveles elevados de urea en plasma desde el día 20 en adelante (Figura 1b y Figura complementaria S2D). Durante los primeros 10 días, los ratones experimentaron aumento de peso corporal con ascitis (Figura 1c y Figura complementaria S2E), lo que refleja la retención de sodio causada por la excreción de serina proteasas o proteinuria.¹⁸Después de la reversión espontánea de la retención de sodio, estos ratones perdieron peso de manera constante. En ratones con DIN y en ratones Nphs2Dipod, las imágenes de microscopía óptica, capturadas después de 10 días, revelaron cambios histomorfológicos típicos consistentes con esclerosis glomerular segmentaria focal (Figura 1d y Figura complementaria S2B). Estos estaban ausentes en ratones C57BL / 6 inyectados con doxorrubicina (Figura 1d). El tratamiento con doxorrubicina indujo una fuerte disminución de la hemoglobina, el recuento de glóbulos rojos y el hematocrito (Figura 1e-g) a partir del día 10 en ratones 129S1/SvImJ y C57BL/6, que en este último se normalizaron en los días 20 y 30. Por el contrario, en los días 20 y 30, los ratones 129S1/SvImJ inyectados con doxorrubicina y los ratones deficientes en podocina desarrollaronanemia, caracterizado por un volumen corpuscular medio reducido (Figura 1h) y hemoglobina reducida (Figura complementaria S2F), lo que sugiere queanemiase asocia con insuficiencia renal progresiva y no con el tratamiento con doxorrubicina per se.

Figura 1|Función renal y anemia manifiesta en ratones 129S1/SvImJ inyectados con doxorrubicina.( a – d ) Los ratones 129S1 / SvImJ inyectados con doxorrubicina desarrollaron ( a ) proteinuria alta, ( b ) aumento progresivo de la concentración de urea en plasma, ( c ) aumento transitorio del peso corporal y ( d ) cambios histomorfológicos típicos indicativos de esclerosis glomerular segmentaria focal el día 10 (tinción con ácido peryódico de Schiff; barra ¼ 10 mm). (e-h) Además, estos ratones desarrollaronanemiareflejada por (e) una disminución del nivel de hemoglobina, (f) un menor número de glóbulos rojos (RBC), (g) disminución de los niveles de hematocrito y (h) disminución del volumen corpuscular medio. ( a - d ) Los ratones C57BL / 6 inyectados con doxorrubicina no mostraron ningún signo de lesión renal, y ( e - g )anemiaen el día 10 se normalizó en los días 20 y 30. Se muestran las medias aritméticas SEM. *P < 0,05,="" **p="">< 0,01,="">< 0.001,and="" ****p="" <="" 0.0001="" indicate="" signifificant="" difference="" between="" healthy="" 129s1/svimj="" and="" doxorubicin-injected="" 129s1/svimj="" mice;="" #p=""><0.05, ##p="" <="" 0.01,="" ###p="" <="" 0.001,="" and="" ####p="" <="" 0.0001="" indicate="" signifificant="" difference="" to="" the="" baseline="" of="" doxorubicin-injected="" 129s1/svimj="" mice;="" and="" §p="" <="" 0.05,="" §§p="" <="" 0.01,="" §§§p="" <="" 0.001,="" and="" §§§§p="" <="" 0.0001="" indicate="" signifificant="" difference="" between="" doxorubicin-injected="" 129s1/svimj="" and="" doxorubicin-injected="" c57bl/6="" mice.="" crea,="">

La anemia en la enfermedad renal proteinúrica experimental no está causada por una eritropoyesis comprometida

Ambos modelos de ratones anémicos mostraron un aumento significativo en el porcentaje de reticulocitos circulantes (Figura 2a y Figura complementaria S3C). Las concentraciones de EPO en plasma aumentaron drásticamente el día 10 en ratones 129S1/SvImJ con DIN y C57BL/6 sanos, pero se normalizaron nuevamente los días 20 y 30 (Figura 2b). En ratones con deficiencia de podocina, las concentraciones de EPO en plasma aumentaron en el día 10 y permanecieron aumentadas en los días 20 y 30 (Figura complementaria S2H). En los análisis histológicos de la médula ósea y el bazo, el número de células precursoras eritroides en comparación con los precursores mieloides aumentó en el día 30 (Figura 2d-g), lo que indica una eritropoyesis estimulada en ratones anémicos 129S1/SvImJ con DIN.

Figura 2|La eritropoyesis se estimula en ratones 129S1/SvImJ inyectados con doxorrubicina con anemia. (a) Anemiaen ratones 129S1/SvImJ a los que se les inyectó doxorrubicina a pesar del aumento en el número de reticulocitos en los días 2{{30}} y 30. (b) La concentración de eritropoyetina en plasma aumentó mucho el día 10 en ratones 129S1/SvImJ y C57BL/6 inyectados con doxorrubicina, pero se normalizó de nuevo en los días 20 y 30. ( c – e ) Cuantificación de los números absolutos de ( c ) mieloides y ( d ) células eritroides en la médula ósea. La proporción (e) de células mieloides a células eritroides en ratones 129S1/SvImJ sanos y a los que se les inyectó doxorrubicina en la médula ósea mostró una mayor cantidad de células precursoras eritroides en ratones 129S1/SvImJ a los que se les inyectó doxorrubicina el día 3{{5{{52 }}}}. ( f, g ) La histología ( f ) del bazo y ( g ) de la médula ósea mostró un aumento en las células precursoras eritroides, observadas incluso con aumentos más bajos, en ratones 129S1 / SvImJ inyectados con doxorrubicina (paneles de la derecha) en comparación con ratones sanos (paneles de la izquierda ) el día 30. ( f, g ) La inmunohistoquímica Ter119 (paneles inferiores) apoyó los hallazgos de hematoxilina y eosina (H&E). Ter119 es positivo en los precursores eritroides (células nucleadas) y en los glóbulos rojos (células no nucleadas). barra ¼ 100 mm; insertos ¼ 25 mm. Se muestran las medias aritméticas SEM. *P < 0,05,="" **p="">< 0,01="" y="" ***p="">< 0,001="" indican="" una="" diferencia="" significativa="" entre="" los="" ratones="" 129s1/svimj="" sanos="" y="" los="" ratones="" 129s1/svimj="" inyectados="" con="" doxorrubicina;="" ##p="">< 0,01="" y="" ####p="">< 0,0001="" indican="" una="" diferencia="" significativa="" con="" respecto="" al="" valor="" inicial="" de="" los="" ratones="" 129s1/svimj="" inyectados="" con="" doxorrubicina;="" y="" §p="">< 0,05,="" §§p="">< 0,01="" y="" §§§§p="">< 0,0001="" indican="" una="" diferencia="" significativa="" entre="" los="" ratones="" 129s1/svimj="" inyectados="" con="" doxorrubicina="" y="" c57bl/6="" inyectados="" con="">

Beneficio deCistanche: tratamiento de la enfermedad renal y mejora de la función renal

La vida útil reducida de los glóbulos rojos es la principal causa de anemia en la enfermedad renal proteinúrica experimental

La externalización de PS en la hoja externa de la membrana plasmática de los glóbulos rojos es un indicador de muerte celular y un promotor de la fagocitosis eritro.¹⁴La muerte de células RBC se cuantificó utilizando análisis de clasificación de células activadas por fluorescencia de PS de superficie unida a anexina V fluorescente.¹⁴ In freshly drawn blood, the percentage of PS-exposing cells was >{{0}}veces más el día 20 en ratones con DIN (4,16 % y 0,86 %) en comparación con ratones sanos (1,{{7 }} por ciento y 0.11 por ciento) (Figura 3a). Del mismo modo, los ratones Nphs2Dipod mostraron un aumento aproximado de 2-veces en la exposición a PS (1,27 % y 0,20 %) en comparación con los ratones sanos (0,58 % y 0,05 %) en el día 30 (Figura complementaria S3A). Se sabe que los glóbulos rojos son eliminados de la circulación por los macrófagos que residen en el bazo. 17 Esta observación puede, por lo tanto, explicar la mayor proporción de bazo/peso corporal de los ratones Nphs2Dipod (Figura complementaria S2G), donde se degrada el doble de glóbulos rojos en comparación con los sanos. ratones C57BL/6. Dado que la proteinuria de rango nefrótico conduce a la disproteinemia,29 investigamos más a fondo si un componente en el plasma de ratones con DIN puede estimular la muerte celular de glóbulos rojos. Como se muestra en la Figura 3b, la exposición a PS en los días 10 y 20 fue el doble después de la incubación (30 minutos a 37^OC) de glóbulos rojos sanos en plasma de ratones 129S1/SvImJ inyectados con doxorrubicina en comparación con la incubación en plasma de ratones sanos. Entrada de Ca2+ en los glóbulos rojos, mediada por canales de cationes no selectivos controlados por voltaje e independientes del voltaje,^30,31es uno de los reguladores clave de la muerte celular de los glóbulos rojos. En los glóbulos rojos recolectados en los días 20 y 30 de ratones 129S1/SvImJ con DIN, las concentraciones de Ca2+ intracelular aumentaron (Figura 3c); este fenómeno se recapituló en ratones Nphs2Dipod el día 20 (Figura complementaria S3B). En ambos modelos de ratón, hubo una correlación negativa significativa del porcentaje de glóbulos rojos positivos para PS, con la gravedad deanemiareflejado por los niveles de hemoglobina (Figura 3d y Figura complementaria S3D). Además, hubo una correlación significativa con el daño renal reflejado por la concentración de urea en plasma (Figura 3e y Figura complementaria S3E) y, en menor grado, con proteinuria (Figura 3f y Figura complementaria S3F). Para compensar la pérdida de glóbulos rojos enanemia, la formación de nuevos glóbulos rojos se estimuló en ambos ratones, como lo indica el aumento del porcentaje de reticulocitos circulantes, y se correlacionó significativamente con la magnitud de los glóbulos rojos expuestos a PS (Figura 3g y Figura complementaria S3G).

Figura 3|Los ratones con nefropatía inducida por doxorrubicina desarrollan una mayor muerte de glóbulos rojos (RBC) mediada por un aumento de los niveles de calcio intracelular.(a) La externalización de la fosfatidilserina (PS), que refleja la muerte de los glóbulos rojos, aumentó los días 20 y 30 después de la inducción de la nefropatía inducida por doxorrubicina. (b) La incubación de glóbulos rojos sanos en plasma tomado los días 10 y 20 de estos ratones condujo a la externalización de PS. (c) La externalización de PS estuvo acompañada de niveles de calcio intracelular mejorados de los glóbulos rojos tomados los días 20 y 3{{30}} después de la inducción. ( d - g ) El ( d ) porcentaje de glóbulos rojos expuestos a PS se correlacionó con los niveles de hemoglobina, el daño renal indicado por ( e ) la concentración de urea en plasma y ( f ) la proteinuria, así como con ( g ) la formación de reticulocitos. (d–g) Los datos incluyen cada punto de tiempo (0, 10, 20 y 30 días) de cada ratón sano 129S1/SvImJ y 129S1/SvImJ con nefropatía inducida por doxorrubicina. Se muestran las medias aritméticas SEM. **P < 0,01,="" ***p="">< 0,001="" y="" ****p="">< 0,0001="" indican="" una="" diferencia="" significativa="" entre="" los="" ratones="" 129s1/svimj="" sanos="" y="" los="" ratones="" 129s1/svimj="" inyectados="" con="" doxorrubicina="" (pulgadas);="" #p="">< 0,05,="" ##p="">< 0,01="" y="" ####p="">< 0,0001="" indican="" una="" diferencia="" significativa="" con="" respecto="" al="" valor="" inicial="" de="" los="" ratones="" 129s1/svimj="" inyectados="" con="" doxorrubicina;="" y="" §§§§p="">< 0,0001="" indican="" una="" diferencia="" significativa="" entre="" los="" ratones="" 129s1/svimj="" inyectados="" con="" doxorrubicina="" y="" c57bl/6="" inyectados="" con="" doxorrubicina.="" crea,="" creatinina;="" mfi,="" intensidad="" de="" fluorescencia="">

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