Microscopía de conductancia iónica de escaneo de glomérulo humano vivo

Para más information:ali.ma@wecistanche.com

Ruslan Bohovyk1,2 | Mykhailo Fedoriuk1,2 | Elena Isaeva1,2 | Andrew Shevchuk3 | | de Oleg Palygin1 Aleksandr Staruschenko1,4

1 Departamento de Fisiología, Facultad de Medicina de Wisconsin, Milwaukee, WI, Estados Unidos 2 Departamento de Membranología Celular, Instituto Bogomoletz de Fisiología, Kiev, Ucrania 3 Departamento de Medicina, Imperial College Londres, Londres, Reino Unido 4 Centro Médico Clement J. Zablocki VA, Milwaukee, WI, Estados Unidos

Correspondencia Alexander Staruschenko y Ruslan Bohovyk, Departamento de Fisiología, Colegio Médico de Wisconsin, 8701 Watertown Plank Road, Milwaukee, WI 53226, Estados Unidos. Correos electrónicos: staruschenko@mcw.edu; rbogovik@ gmail.com

Información sobre la financiación Departamento de Asuntos de Veteranos, Grant/ Número de premio: I01 BX004024; Nacional Instituto del Corazón, los Pulmones y la Sangre, Grant/ Número de premio: P01 HL116264 y R35 HL135749; Sociedad Americana de Fisiología, Número de beca/premio: Carrera investigadora Premio a la Mejora; Instituto Nacional de Diabetes y Digestivo yRiñónEnfermedades, Número de subvención/adjudicación: DK126720

Abstracto

El daño a los podocitos es un sello distintivo de las enfermedades glomerulares, como la glomeruloesclerosis focal segmentaria, típicamente asociada con albuminuria marcada y progresión de patología renal. Las anomalías estructurales y la pérdida de podocitos también están relacionadas con el mínimo cambiar la enfermedad y más comúnenfermedad renal diabética. Aquí aplicamos la primera vez que escaneamos la técnica de microscopía de conductancia iónica (SICM) para evaluar el recién llegado humano aisladoglomérulotopología. SICM ofrece una oportunidad única para evaluarglomérulopodocitos, así como otros segmentos estructurales de nefrona con electrones resolución de microscopía pero en muestras vivas. Aquí se muestra la aplicación del SICM método en el humano vivoglomérulo, que proporciona una prueba de principio para el futuro análisis dinámico de la morfología de la membrana y diversos parámetros funcionales en células vivas.

Haga clic para cistanche efectos secundarios y Cistanche para la enfermedad renal

1. INTRODUCCIÓN

Glomérulorepresenta un mechón de capilares ubicado en la porción de entrada de la nefrona, donde la sangre se filtra selectivamente a través de la barrera de filtración glomerular que consiste en células endoteliales, membrana basal glomerular y podocitos. Primaria y secundaria Los procesos de los podocitos adyacentes se entrelazan, creando un diafragma de hendidura que cubre firmemente los capilares glomérulos. Este diafragma tiene una morfología compleja y forma la barrera final para la filtración de la sangre contribuyendo a la selectividad del tamaño y permitiendo la permeabilidad a moléculas más pequeñas que la albúmina. Una reducción en el número de podocitos y Se notificó un borrado del proceso del pie en la glomeruloesclerosis focal segmentaria, la enfermedad de cambio mínimo y la nefropatía diabética.1-3 Además, la pérdida de podocitos y la modificación de su arquitectura pueden ser evidente en las primeras etapas deriñónenfermedades que pueden ser la base/exacerbación de su progresión. Imágenes de alta resolución de la célula La morfología se está convirtiendo en una herramienta esencial y útil para el estudio las estructuras celulares y el papel que desempeñan en la función celular y la progresión de la enfermedad.4 La microscopía electrónica de barrido (SEM) es una método utilizado para la realización de dichos estudios. Aún así, requiere múltiples procedimientos complejos para la preparación de muestras, lo que hace imposible analizar una muestra viva.5 Por lo tanto, existe una necesidad crítica de desarrollar nuevas herramientas para estudiar las alteraciones de la morfología de los podocitos. en muestras vivas. Modo de sonda de salto de la conductancia de iones de escaneo La microscopía (SICM) es una técnica que permite obtener imágenes de alta resolución y no ópticas de superficies de células vivas con morfología compleja.6-8 La principal ventaja de este método es cerca de varios nanómetros. resolución espacial y un largo rango Z (vertical), que se puede aplicar a muestras vivas con morfología enrevesada bajo fisiológicamente condiciones pertinentes. SICM es una técnica de imagen multimodal que se puede combinar con otras técnicas establecidas, concurrentes y análisis dinámico de la morfología de la membrana, y varios parámetros funcionales, como el volumen celular, los potenciales de membrana, corrientes de canal iónico, e incluso la dinámica de la proteína de membrana complejos en células vivas.9-11 Aquí, proporcionamos un ejemplo de la aplicación de SICM para analizar la morfología de humanos vivosgloméruloestructura.

Síntomas de la enfermedad cistanche-renal

2. MATERIALES Y MÉTODOS

Para el experimento, utilizamos una parte del área cortical del humano trasplantado descartado.riñóndiseccionado y almacenado en Wisconsin solución de preservación seguida de la incubación en un oxigenado solución salina fisiológica (PSS).12 Se aislaron glomérulos renales utilizando una técnica de vibrodisociación como se describió anteriormente.13 El enfoque permite el aislamiento rápido de glomérulos renales bien conservados de los humanosriñones. Para realizar imágenes SICM, humanos recién aisladosglomérulose unieron a la superficie de vidrio de poli-L-lisina colocado en la cámara celular llena de solución PSS. Las muestras fueron colocado manualmente en las direcciones x-y bajo una óptica invertida microscopio Nikon TE2000-U (Nikon Instruments). Para el salto sonda, SICM imaging nanopipetas de vidrio de borosilicato con una resistencia de aproximadamente 100 MΩ, que corresponde a un diámetro de punta estimado alrededor de 120 nm, se utilizaron. Las nanopipetas fueron tiradas con el tirador horizontal de tipo llameante/marrón P-97 (Sutter Instruments, Novato, CA). Las nanopipetas se llenaron con la misma solución PSS utilizada para el baño y se colocaron en la dirección z con un actuador piezoeléctrico. La corriente iónica que fluye a través de las nanopipetas se midió con un amplificador de abrazadera de parche Axopatch 700B (Axon Instruments) en modo de abrazadera de voltaje y monitoreado por el controlador universal modificado a medida (ICAPPIC Ltd, Reino Unido), que controlaba simultáneamente el posicionamiento de la muestra y la pipeta.6 Todos los experimentos se realizaron a temperatura ambiente (20-22°C). Para imágenes estructuras complejas enrevesadas como los podocitos del pie procesos en elglomérulo, utilizamos el modo de retroceso / salto SICM que es el más aplicable para obtener imágenes de la topografía de células vivas con alta resolución.6,14 El paso único del principio de salto consiste en un evento cuando la corriente de referencia se mide colocando la nanopipeta muy por encima de la muestra. Entonces, la nanopipeta se acerca a lo largo del eje Z hasta la superficie de la muestra hasta la corriente medida el nivel cae al punto de ajuste preestablecido correspondiente a ~ 1.0%-1.2% de la corriente de referencia. En este momento, el enfoque se termina, Se registran las coordenadas XYZ de los actuadores piezoeléctricos XY y Z como coordenada de la superficie de muestra para el primer punto de imagen, y el la pipeta se retira de la superficie. Este procedimiento se repite en cada punto de imagen individual a lo largo del eje x-y determinado por resolución preestablecida y rango de área de escaneo. Para la Figura 1B, rango de escaneo y las resoluciones de imagen fueron de 30 μm × 30 μm y 512 px × 512 px, y para La Figura 1C fue de 5 μm × 5 μm y 480 px × 480 px, respectivamente. Crudo Se realizaron datos topográficos SICM y post-procesamiento de imágenes uso del software de análisis de microscopía SICM ImageViewer (ICAPPIC) Ltd, Reino Unido).

FIGURA 1 Aplicación de imágenes de microscopía de conductancia iónica de barrido. A, Humano recién aisladoglomérulounido a la superficie de vidrio de poli-lisina. A la izquierda se muestra una micropipeta que se acerca a la superficie del glomérulo para realizar imágenes SICM. B, Un ejemplo de componentes de barrera de filtración glomérulo, incluidos los procesos de podocitos y pies cubiertos por los vasos, visualizados por SICM. 45 min para el área total escaneo (30 × 30 μm, resolución 512 × 512 píxeles; cambios en el eje Z 15 μm). C, Visión ampliada sobre la arquitectura del podocito humano secundario procesos de pie revelados por SICM de alta resolución. 12 min para escaneo de área total (resolución 5 × 5 μm, resolución 480 × 480 píxeles; cambios en el eje Z 3 μm). Se muestran las barras de escala

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

La calidad de imagen SICM es comparable a SEM y permite un examen preciso degloméruloestructura superficial, incluidos los vasos sanguíneos y los podocitos y la arquitectura de los procesos secundarios del pie.4 En nuestro estudio anterior, utilizamos imágenes SICM para estimar los cambios estructurales patológicos en los procesos del pie de podocitos en diabéticos tipo 2 ratas con nefropatía (T2DN)15. la arquitectura tridimensional de la barrera de filtración de podocitos en ratas no diabéticas y T2DN. Nuestros datos revelaron una pérdida significativa de los procesos del pie de podocitos en los glomérulos T2DN proporcionando una precisión evaluación de los cambios histopatológicos que ocurrieron en la nefropatía diabética que subyacen a la nefringuria y la albuminuria en estas ratas.15 Aquí, por primera vez, demostramos un enfoque exitoso en evaluar la estructura tridimensional de la superficie de los recién aislados, glomérulo humano vivo. Los glomérulos renales humanos son estructuras esféricas con un diámetro de alrededor de 300 μm16; por lo tanto, la punta de la pipeta debe acercarse cuidadosamente a la parte superior de la región de interés. Nuestro SICM La configuración tiene un eje z de 25 μm y un rango de escáner de eje x-y de 30 × 30 μm, que nos permitió obtener una imagen de alta resolución de la mayor parte de lagloméruloSuperficie. El tiempo de adquisición depende en gran medida de la rango de escaneo, resolución y tamaño de la punta del electrodo de salto. Para las imágenes de células vivas en estructuras complejas como el glomérulo recién aislado, el tiempo de escaneo varía de 10 a 50 minutos por fotograma (consulte la leyenda de la figura para más detalles). El efecto acumulativo de la alta resolución, grande El área de escaneo y las fluctuaciones estocásticas en los sistemas vivos pueden dar lugar a artefactos de imagen representados como desplazamientos horizontales y verticales entre ciclos de reposición de pipetas. Tenga en cuenta que en geometrías complejas con los cambios repentinos en las ubicaciones de la superficie, tanto el el tiempo de adquisición y los artefactos de imagen, como píxeles oscuros o malos, podrían aumentar. La imagen topográfica del SICM (Figura 1A) ilustra los capilares glomerulares cubiertos por capilares primarios y secundarios claramente visibles procesos del pie de podocitos. SICM permite adquirir imágenes de muestra con diferentes rangos de escaneo en la escala nanométrica, manteniendo un nivel de resolución suficiente.17 La Figura 1B representa la arquitectura de los procesos secundarios del pie de los podocitos humanos revelados por el SICM de alta resolución. Se puede utilizar un análisis adicional de tales imágenes topográficas para estudiar cambios morfológicos de los procesos del pie de podocitos en condiciones patológicas y en respuesta a diversas aplicaciones de medicamentos.

La aplicación de la técnica SICM para la investigación de la estructura superficial tridimensional de las muestras de tejidos blandos, incluyendogloméruloy las células de podocitos, fue introducida inicialmente por Nakajima et al4. Los autores utilizaronriñóncortes para comparar esta técnica con el SEM convencional. Aquí, extendimos estos estudios a glomérulo humano vivo. Usando este enfoque, revelamos el gran potencial de la técnica SICM para el examen rápido y fiable de laglomérulobarrera de filtración. Una de las grandes ventajas de SICM (además del uso de muestras vivas) es que no requieren múltiples procedimientos de preparación de muestras que normalmente se necesitan para Imágenes de microscopía EM, incluida la solución de deshidratación y fijación. Por lo tanto, SICM permite evitar la contracción de las muestras observadas con EM, lo que puede conducir a dimensiones reales engañosas. Importantemente SICM en tiempo real en glomérulos recién aislados también permite probar el dinámica de los procesos del pie del movimiento en respuesta a la exposición aguda a fármacos de interés. Por último, se puede utilizar la pipeta SICM Para realizar grabaciones con abrazadera de parche de corrientes de un solo canal.18 Para este propósito, después de la reconstrucción del mapa topográfico, el software de adquisición (ICAPPIC Ltd, Reino Unido) permitía un control freno de la sonda de salto de vidrio SICM en la superficie de la cámara, disminuyendo la resistencia del microelectrodo a las condiciones de la abrazadera de parche (7 a 12 MΩ) y lo hace adecuado para la grabación de un solo canal en el mismo experimento. El SICM permite la selección de la Ubicación exacta del electrodo patch-clamp en la superficie de la celda basada en datos topográficos mediante un enfoque vertical bien controlado con precisión nanométrica, lo que resulta en la fácil formación de un gigasellal de contacto con la membrana celular llamada Smart Patch.19

En resumen, el método descrito aquí tiene un excelente potencial. para los estudios de glomérulos y otros segmentos de nefrona recién aislados. Además, muestra que es posible utilizar humanos.riñónmuestras sin preparación elaborada para evaluar morfológicas cambios en el estudio de patologías.

Cistanche para la enfermedad renal

AGRADECIMIENTOS

La investigación en el laboratorio de los autores fue financiada por el Departamento de Asuntos de Veteranos I01 BX004024, el Corazón, pulmón y sangre nacional Instituto R35 HL135749 y P01 HL116264, el Instituto Nacional de Diabetes y Digestivo yRiñónEnfermedades R01 DK126720, y la Sociedad Americana de Fisiología Research Career Enhancement Adjudicar.

CONFLICTO DE INTERESES

El Dr. Andrew Shevchuk es accionista y recibe la consultoría tarifas de ICAPPIC Ltd. Todos los demás autores declararon que no competían Intereses

CONTRIBUCIONES DE LOS AUTORES

Ruslan Bohovyk: Conceptualización (igual); Curación de datos (lead); Análisis formal (lead); Redacción-borrador original (igual); Redacción-reseña y edición (igual). Mykhailo Fedoriuk: Curación de datos (apoyo); Análisis formal (apoyo); Redacción-revisión y edición (igual). Elena Isaeva: Conceptualización (apoyo); Curación de datos (soporte); Análisis formal (apoyo); Redacción-borrador original (apoyo); Redacción-revisión y edición (igual). Andrew Shevchuk: Conceptualización (apoyo); Software (soporte); Redacción del borrador original (apoyo); Redacción-revisión y edición (igual). Oleg Palygin: Conceptualización (igual); Análisis formal (apoyo); Metodología (apoyo); Administración de proyectos (apoyo); Redacción-borrador original (apoyo); Redacción-revisión y edición (igual). Alexander Staruschenko: Conceptualización (protagonista); Administración de proyectos (líder); Recursos (plomo); Supervisión (plomo); Escritura-original proyecto (igual); Redacción-revisión y edición (igual).

DECLARACIÓN DE DISPONIBILIDAD DE DATOS

Los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles en el autor correspondiente a petición razonable.