¿Cómo afecta la óxido nítrico sintasa al riñón?

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Estudio molecular de la toxicidad del diazinón basado en la expresión de la sintasa de óxido nítrico inducible (iNOS) en hepatocitos e histopatología renal de ratas (Rattus norvegicus)

Resumen

El diazinón es un insecticida organofosforado que se usa ampliamente para erradicar plagas pero tiene una toxicidad más alta que otros insecticidas. El diazinón que se consume accidentalmente por vía oral tiene un impacto en el aumento de las especies reactivas de oxígeno (ROS) en el cuerpo. Las especies reactivas de oxígeno (ROS) activarán la citoquina proinflamatoria que inducirá el inducibleÓxido nítrico sintasa(iNOS) en el que iNOS (Óxido nítrico sintasa) ProduciráÓxido nítrico(NO) como radical libre. Un alto nivel de ROS causará daño a las células. Este estudio tuvo como objetivo determinar el efecto de toxicidad del diazinón hacia iNOS (Óxido nítrico sintasa)expresión en hígado yriñónhistopatología de ratas (Rattus norvegicus). Las ratas se dividieron en 4 grupos que consisten en el grupo de control negativo y tres grupos experimentales a los que se les administró diazinón 20 mg/kg BW (P1), 40 mg/kg BW (P2) y 60 mg/kg BW (P3). Los parámetros que se observaron en esta investigación son la expresión de iNOS (Óxido nítrico sintasa)en el hígado usando tinción de inmunohistoquímica y luego se analizó usando ANOVA unidireccional seguido de la prueba de Tukey (a=0,05), yriñónhistopatología que se observó mediante tinción de Hematoxilina-Eosina y se analizó cualitativamente descriptivamente. Los resultados mostraron que la administración de diazinón por vía oral aumentó significativamente iNOS (Óxido nítrico sintasa)expresión (pag<0,001)in the="" liver="" and="" caused="" damage="" to="" the="">riñóncorteza que se mostró por infiltración de células inflamatorias, necróticas deriñóncélulas tubulares y hemorragia en el espacio intertubular.

Palabras clave:Diazinón, organofosforados, iNOS (Óxido nítrico sintasa)expresión,riñónhistopatología

Cistanche mejora la función renal

1. Introducción

El uso de pesticidas se ha sentido para aumentar la producción, especialmente como preventivo contra plagas y malezas (Kusriani, 2012). Sin embargo, el uso frecuente de pesticidas puede causar que estos pesticidas sean tóxicos para los consumidores, incluidos los animales, tanto por inhalación como por vía oral y a través de la piel (Ameriana, 2006). Un pesticida que se usa comúnmente es el diazinón. El diazinón es un pesticida organofosforado que tiene un mecanismo que inhibe la función de la enzima colinesterasa. Estos pesticidas también tienen menos efecto sobre los organismos no objetivo y son más tóxicos para los animales vertebrados en comparación con los organoclorados (Luthfanto, 2014). Normalmente, los pesticidas serán neutralizados en el hígado por los hepatocitos a través de la desintoxicación, pero estos compuestos también son capaces de formar radicales libres debido al daño celular. La exposición continua a organofosforados puede desencadenar daño hepático como órgano que desempeña un papel en el proceso de desintoxicación (Ginting, 2014). Los organofosforados que han sido metabolizados en el hígado tienen la potencia de inhibir la enzima AChE. La inhibición de esta enzima produce directamente un aumento de los niveles de acetilcolina en el sistema nervioso y el sistema neuromuscular. El aumento de AChE puede hacer que los iones en las células se vuelvan inestables y desencadenen la formación de especies reactivas de oxígeno (ROS) (Uchendu, 2012). El aumento de ROS desencadenará la producción de citocinas proinflamatorias. Naik y Vishva (2011) afirman que ROS afecta la transcripción de citoquinas proinflamatorias donde los altos niveles de ROS serán seguidos por altos niveles de citoquinas proinflamatorias y si la producción de ROS es inhibida por inhibidores afectará la disminución en la producción de citoquinas proinflamatorias como como IL-6 y TNF. El aumento de la producción de citoquinas proinflamatorias inducirá iNOS (Óxido nítrico sintasa)y formar NO en cantidades excesivas (Aktan, 2004).

losriñónes el principal órgano que mantiene el equilibrio del Líquido Extra Celular (LEC) realizando sus funciones en la excreción y el metabolismo (Curthoys, 2014). La excreción o eliminación de los resultados del metabolismo xenobiótico se lleva a cabo en elriñón. losriñónel daño puede reducir el nivel de excreción de químicos sin aumentar la toxicidad de las sustancias tóxicas (Gupta, 2012). La condición de estrés oxidativo iniciará el proceso de peroxidación de lípidos tomando iones de hidrógeno del enlace de ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) para formar una molécula más estable. El proceso de ruptura de enlaces en PUFA puede causar necrosis celular o tisular (Sharma et al.. 2003).

Este estudio se realizó para determinar el efecto de toxicidad del diazinón contra iNOS (Óxido nítrico sintasa)expresión en el hígado y la histopatología renal de ratas.

La óxido nítrico sintasa afecta la función renal

2. Materiales y métodos

2.1. Modelos animales y diseño experimental

Veinte ratas (Rattus norvegicus) se dividieron en 4 grupos: grupo de control negativo (ratas sanas). A los grupos P1, P2 y P3 se les administró diazinón durante 8 semanas por vía oral utilizando una sonda de alimentación con dosis de 20 mg/kg de peso corporal, 40 mg/kg de peso corporal y 60 mg/kg de peso corporal, respectivamente. Se mezcló diazonio 600EC con agua destilada hasta contener 5 mg de diazonio en 1 mL (Baconi et al., 2013).

Las ratas se aclimataron durante una semana antes de recibir el tratamiento. Todas las condiciones y el manejo de los animales se realizaron con el protocolo aprobado por el Comité de autorizaciones éticas de la Universidad Brawijaya (No: 732-KEP-UB).

2.2.Preparación y Observación de Histopatología Renal

Preparación deriñónLa histopatología consta de las siguientes etapas: fijación, deshidratación, limpieza, inclusión, corte, pegado a objetos de vidrio según Muntiha (2001). Observaciones deriñónla histopatología se llevó a cabo utilizando un microscopio de luz binocular con un aumento del microscopio de 100x seguido hasta 400x. La observación se realizó sobre glomérulos renales y túbulos renales.

2.3.Análisis de la expresión de iNOS (óxido nítrico sintasa) en hígado

iNOS (Óxido nítrico sintasa)la expresión en el hígado se analizó con métodos de inmunohistoquímica, usando anti iNOS (Óxido nítrico sintasa) como anticuerpo primario y anti-IgG de conejo marcada con biotina como anticuerpo secundario. La medición de iNOS (Óxido nítrico sintasa)la expresión en el hígado se realizó utilizando el software Immunoratio. Los resultados del área porcentual de expresión de iNOS se analizaron cuantitativamente utilizando la prueba de análisis de varianza (ANOVA) unidireccional y se siguieron con la prueba de Tukey.

3. Resultados y Discusiones

3.1.Análisis de la expresión de iNOS (óxido nítrico sintasa) en hígado

Analizar la expresión de iNOS (Óxido nítrico sintasa)en células hepáticas se realizó mediante el método de inmunohistoquímica. La expresión de iNOS (Óxido nítrico sintasa)se puede mostrar como una expresión de color marrón en los hepatocitos, que se puede ver en la Figura 1.

Figura 1. iNOS (Óxido nítrico sintasa)expresión en el hígado.

(1) Grupo de control negativo (K-). (2) P1 (inducida con 20 mg/kg de peso corporal de diazinón. (3) P2 (inducida con 40 mg/kg de peso corporal de diazinón).

(4) P3 (inducida con diazinon 60 mg/kg BW. El círculo blanco muestra el área de la iNOS (Óxido nítrico sintasa)expresión.

El resultado de la inmunohistoquímica se analizó cualitativamente y mostró que hay un aumento de la intensidad del color marrón (Figura 1). Este resultado indica que hay un aumento en iNOS (Óxido nítrico sintasa)niveles de expresión en el grupo de tratamiento en comparación con el grupo de control.

Para medir el nivel de iNOS (Óxido nítrico sintasa)expresión en hepatocitos software de inmunorreacción utilizado. Los resultados del análisis cuantitativo del iNOS (Óxido nítrico sintasa)La expresión en el hígado de ratas se puede ver en la Tabla 1 y se puede concluir que existe una diferencia significativa (p<0.001) between="" the="" treatment="" groups="" compared="" to="" the="" negative="" control="" group="" (k-).="" in="" the="" negative="" control="" group="" that="" was="" the="" group="" without="" diazinon="" organophosphate="" induction,="" the="" average="" percentage="" area="" of=""> (Óxido nítrico sintasa)La expresión sexual fue de 1,340 ±0,092 por ciento. En el grupo de tratamiento 1 (P1), que fue el grupo inducido por organofosfato de diazinón a una dosis de 20 mg/kg de peso corporal, el área porcentual promedio de iNOS (Óxido nítrico sintasa)la expresión fue de 4,184±1,041 por ciento. El grupo de tratamiento 2(P2) fue un grupo inducido por organofosfato de diazinón a una dosis de 40 mg/kg de peso corporal y el promedio de iNOS (Óxido nítrico sintasa)expresión fue 7.496±0.997 por ciento. El grupo de tratamiento 3 (P3) fue un grupo inducido por organofosfato de diazinón a una dosis de 60 mg/kg de peso corporal y el promedio de iNOS (Óxido nítrico sintasa)expresión fue 11.604 ± 0.864.

En el grupo de control negativo mostró iNOS (Óxido nítrico sintasa)expresión en baja intensidad (1,340 ± 0,092 por ciento). McNaughton et al. (2002) encontró que iNOS (Óxido nítrico sintasa)se expresó en acinos hepáticos normales. La propagación de iNOS (Óxido nítrico sintasa)en el hígado normal muestra el área alrededor del portal con la expresión más fuerte y la intensidad disminuye a lo largo de los ácinos hepáticos. Según Kubes (2000), iNOS (Óxido nítrico sintasa)puede proporcionar efectos terapéuticos si se regula en la cantidad y ubicación correctas, iNOS tiene un papel positivo que incluye la curación de la piel y la mucosa intestinal, la lucha contra ciertas bacterias, el potencial en la regulación de la proliferación y diferenciación de células T y la regulación del reclutamiento de leucocitos .

El grupo de tratamiento mostró un aumento significativo en el porcentaje de área de iNOS (Óxido nítrico sintasa) (p<0,001). diazinon="" such="" as="" organophosphate="" in="" general="" will="" be="" metabolized="" which="" mainly="" takes="" place="" in="" the="" liver.="" the="" metabolism="" that="" occurs="" in="" phase="" 1="" metabolism="" is="" an="" oxidation="" process,="" where="" organophosphate="" will="" be="" broken="" down="" into="" oxon-organophosphate="" metabolites="" and="" free="" sulfur="" ions="" with="" the="" help="" of="" cytochrome="" enzymes(cyp)(gupta,="" 2009).="" metabolites="" from="" phase="" 1="" metabolism="" are="" free="" radicals,="" unstable="" substances="" that="" have="" no="" electron="" pairs.="" free="" radicals="" will="" produce="" reactive="" oxygen="" species="" (ros)such="" as="" superoxide,="" hydroxyl="" radicals,="" and="" hydrogen="" peroxide="" through="" interactions="" with="" other="" molecules.="" free="" radicals="" react="" with="" phospholipids="" from="" the="" plasma="" membrane,="" endoplasmic="" reticulum="" membrane,="" or="" mitochondrial="" membrane="" and="" cause="" cell="" death="" (gupta,="" 2012).="" organophosphate="" pesticides="" can="" also="" cause="" oxidative="" stress(mishra,="" 2013).="" this="" oxidative="" stress="" condition="" is="" caused="" by="" diethyl="" as="" an="" organophosphate="" free="" radical(diazinon)that="" is="" capable="" to="" produce="" large="" amounts="" of="" ros.="" oxidative="" stress="" is="" an="" impaired="" balance="" between="" prooxidants="" and="" antioxidants="" that="" causes="" potential="" damage="" (uchendu="" et="" al.,="">

El aumento de ROS desencadenará la producción de citocinas proinflamatorias. Las especies reactivas de oxígeno afectan la transcripción de citocinas proinflamatorias donde los niveles altos de ROS serán seguidos por niveles altos de citocinas proinflamatorias, así mismo, si la producción de ROS se inhibe con inhibidores también afectará la disminución en la producción de citocinas proinflamatorias como IL{{0 }} y TNF (Naik y Vishva, 2012). Dunlop et al. (2014) y Pahan et al. (2000) afirmaron que TNF- e IL-1 desempeñan un papel en el aumento de la expresión de iNOS (Óxido nítrico sintasa)en tejidos a través de la activación de Nappar Kappa B (NF-kB) en el que NF-kB ingresa al núcleo y se une a la región promotora de iNOS (Óxido nítrico sintasa). El aumento de la producción de citoquinas proinflamatorias inducirá iNOS (Óxido nítrico sintasa)y formar cantidades excesivas deÓxido nítrico(NO) (Aktan, 2004).

3.2.Análisis de Histopatología Renal

Los resultados de esta investigación sobre el efecto de la toxicidad del diazinón en elriñónLas características histopatológicas usando la tinción de Hematoxilina-Eosina (HE) se presentan en la Figura 2. La imagen histológica de la corteza renal de la rata en el grupo de control negativo (K-) mostró una condición normal y no se encontró ninguna anormalidad. Esto se demuestra por la apariencia del cuerpo renal, los túbulos convulsivos proximal y distal con una capa de células epiteliales cuboides (Figura 2(1)).

El cuadro histopatológico de la corteza renal de las ratas del grupo P1 mostró anormalidades, que se caracterizaron por la presencia de células en cariolisis e hipertrofia. Las células de cariolisis se caracterizaron por la desaparición del núcleo celular, mientras que las células epiteliales que experimentan hipertrofia tienen características de tamaño celular agrandado, de modo que la estructura de los túbulos renales aparece irregular. Los eritrocitos en el espacio intertubular se pueden ver en esta imagen que indica la presencia de hemorragia (Figura 2 (2). La imagen histopatológica en el grupo P2 muestra las anomalías como similares al grupo P1. Anomalías que se pueden observar en la corteza renal de ratas P2 incluyen la aparición de células que experimentan cariolisis, hipertrofia de células y hemorragia.Además, la estructura de lariñónlos túbulos parecen irregulares, en comparación con el grupo K (Figura 2(3)). El cuadro histopatológico de la corteza renal de las ratas del grupo P3 mostró anomalías como se observa en el cuadro histopatológico de la corteza renal de las ratas Pl y P2, caracterizadas por la aparición de hipertrofia celular, cariólisis y eritrocitos en el espacio intertubular (hemorragia ). También se puede observar la presencia de infiltración de células inflamatorias en los tejidos (Figura 2(4)).

El organofosfato de diazinón que se administró a las ratas por vía oral será digerido por el tracto digestivo que luego será absorbido por el intestino, especialmente por el duodeno. El metabolismo de los organofosforados tiene lugar principalmente en el hígado, pero en menor medida también se produce en la palma de la mano y el intestino. Los organofosfatos se someterán a un metabolismo de fase 1, que es un proceso de oxidación en el que los organofosforados se descompondrán en metabolitos de oxon-organofosfatos e iones de azufre libres con la ayuda de las enzimas citocromo (CYP) (Gupta, 2009; Elersek y Metka 2011). El metabolito de oxon-organofosfato luego ingresa al torrente sanguíneo y va al hígado para un mayor metabolismo. En el hígado, los metabolitos de oxón-organofosfato se hidrolizarán con la ayuda de las enzimas carboxilesterasa (CE) y paraoxonasa (PON), se dividirán en fosfato de dialquilo y abandonarán el grupo. La dialquilfosfatasa luego será catalizada por enzimas en el metabolismo de fase 2 que producirá moléculas que son hidrofílicas y pueden excretarse en la orina dejando grupos (en forma de dietilo) que pueden inducir estrés oxidativo en el cuerpo. El dietilo es una molécula muy reactiva y puede reaccionar con grupos radicales hidroxilo (-OH) para formar nuevos radicales libres (Elersek y Metka, 2011). El alto número de radicales libres en el cuerpo no puede ser neutralizado por los antioxidantes endógenos, lo que resulta en un desequilibrio entre los radicales libres y los antioxidantes que causa daño oxidativo (Caramori y Papi, 2004). Este daño oxidativo ocurre porque el dietil-hidroxilo como radical libre del organofosforado diazinón es capaz de producir grandes cantidades de ROS (Uchendu et al., 2012). El aumento de ROS causará entonces condiciones de estrés oxidativo e iniciará el proceso de peroxidación lipídica al tomar iones de hidrógeno de los ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) para formar moléculas más estables. El proceso de ruptura de enlaces de PUFA puede causar necrosis celular o tisular (Sharma et al., 2003).

Las anormalidades ocurrieron en elriñónepitelio tubular debido al contacto directo del epitelio con la sustancia tóxica de diazinón, y en elriñóntúbulo, hay un proceso de reabsorción y aumento en el proceso de formación de orina (Mescher, 2010). La sustancia tóxica de diazinón que todavía está en los vasos sanguíneos estará en contacto directo con el endotelio, provocando así la interrupción de la permeabilidad de la membrana vascular. La hemorragia en el espacio intertubular fue causada por la interrupción de la permeabilidad de la membrana de los vasos sanguíneos (capilares peritubulares) para que los eritrocitos puedan ingresar al tejido (Djumadi et al., 2008). La lesión de las células endoteliales inicia reacciones inflamatorias, lo que resulta en la acumulación de macrófagos y plaquetas fuera y dentro de las arterias. La aparición de infiltración de células inflamatorias en el tejido dañado indica que los metabolitos del diazinón causan toxicidad en elriñón(Khudair et al., 2017).

Según los resultados de la apariencia histopatológica, la corteza renal en el grupo de tratamiento experimentó anomalías en comparación con el grupo K. Se sabía que el grupo P1 con la dosis más baja de 20 mg/Kg BW había mostrado el daño deriñóncélulas tubulares en comparación con el grupo K.

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4. Conclusión

Se demostró que la administración de diazinón con la dosis más baja de 20 mg/kg BW tiene un efecto tóxico en ratas como lo indica un aumento significativo en iNOS (Óxido nítrico sintasa)expresión (pag<0.001)and showed="" the="" damage="" of="" the="" renal="" cortex="" in="" the="" form="" of="" renal="" tubular="" cell="" necrosis,="" hemorrhage,="" and="" renal="" tubular="" cell="">

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