Diseño in silico de una vacuna multiepítopo quimérica promiscua contra Mycobacterium Tuberculosis Parte 1

Abstracto

La tuberculosis (TB) es una amenaza para la salud mundial, que mata aproximadamente a 1,5 millones de personas cada año. La erradicación de Mycobacterium tuberculosis, el principal agente causante de la TB, es cada vez más difícil debido a la aparición de cepas extensas resistentes a los medicamentos. La vacunación se considera una forma eficaz de proteger al huésped de los patógenos, pero la única vacuna contra la TB clínicamente aprobada, Bacillus Calmette-Guérin (BCG), tiene una protección limitada en adultos. Se ha encontrado que las vacunas de múltiples epítopos mejoran la inmunidad a las enfermedades mediante la combinación selectiva de epítopos de varias proteínas candidatas.

La tuberculosis es una enfermedad infecciosa causada por la bacteria Mycobacterium tuberculosis que afecta principalmente a los pulmones pero también puede afectar a otros órganos. La inmunidad juega un papel importante en el desarrollo y tratamiento de la TB.

En el caso de inmunidad insuficiente, Mycobacterium tuberculosis puede invadir fácilmente el cuerpo humano y convertirse en tuberculosis. Por ejemplo, un sistema inmunológico comprometido por ciertas enfermedades o tratamientos médicos aumenta el riesgo de infección de TB. Además, factores como la desnutrición, la mala calidad de vida y el estrés excesivo también pueden debilitar la inmunidad, lo que lleva al desarrollo de la TB.

Por lo tanto, mantener una buena salud y fortalecer la inmunidad es muy importante para prevenir la tuberculosis. La inmunidad se puede reforzar a través de una dieta saludable, un estilo de vida regular, ejercicio adecuado y suficiente sueño, lo que puede reducir efectivamente el riesgo de contraer diversas enfermedades, incluida la tuberculosis.

La inmunidad también es importante para el tratamiento y la recuperación cuando ya se ha producido la TB. Cuanto más fuerte sea el sistema inmunitario, más eficazmente podrá defenderse el cuerpo contra un ataque del bacilo de la tuberculosis y producir suficientes anticuerpos para combatir la enfermedad. Por lo tanto, mantener una nutrición adecuada, ejercicio adecuado y una actitud positiva puede mejorar la inmunidad y promover la recuperación.

En conclusión, existe una fuerte relación entre la inmunidad y la TB. Mantener una buena salud y mejorar la inmunidad es una de las formas importantes de prevenir y tratar la tuberculosis. Enfrentemos la vida positivamente, mantengamos un estilo de vida saludable y alejémonos de las enfermedades. Desde este punto de vista, necesitamos mejorar nuestra inmunidad. Cistanche puede mejorar significativamente la inmunidad, porque la ceniza de la carne contiene una variedad de componentes biológicamente activos, como polisacáridos, dos hongos, Huang Li, etc. Estos componentes pueden estimular el sistema inmunológico. Varios tipos de células en el sistema aumentan su actividad inmunológica.

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Este estudio tuvo como objetivo diseñar una vacuna multiepítopo contra la TB utilizando un enfoque inmunoinformático. A través del enriquecimiento funcional, identificamos ocho proteínas secretadas por M. tuberculosis que son necesarias para la patogénesis, secretadas en el espacio extracelular o ambas. Luego analizamos los epítopos de estas proteínas y seleccionamos 16 epítopos de linfocitos T auxiliares con actividad inductora de interferón, 15 epítopos de linfocitos T citotóxicos y 10 epítopos de células B lineales, y los conjugamos con adyuvante y epítopo de unión a Pan HLA DR (PADRE) utilizando enlazadores.

Además, predijimos la estructura terciaria de esta vacuna, su posible interacción con el receptor tipo Toll-4 (TLR4) y la respuesta inmunitaria que podría provocar. Los resultados mostraron que esta vacuna tenía una fuerte afinidad por TLR4, lo que podría estimular significativamente a las células CD4 plus y CD8 plus a secretar factores inmunes y a los linfocitos B a secretar inmunoglobulinas, para obtener una buena inmunidad humoral y celular. En general, se predijo que esta proteína de múltiples epítopos sería estable, segura, altamente antigénica e inmunogénica, lo que tiene el potencial de servir como una vacuna global contra la TB.

1. Introducción

La tuberculosis (TB), una enfermedad altamente contagiosa causada por Mycobacterium tuberculosis, está clasificada por la Organización Mundial de la Salud (OMS) como la principal causa de muerte por un solo agente infeccioso [1–3]. En 2021, el número estimado de muertes por TB y nuevos casos alcanzó 1,6 millones y 10,6 millones, respectivamente [4]. Actualmente, el tratamiento clínico de la TB es relativamente escaso, y se utiliza principalmente la combinación de múltiples fármacos antimicrobianos.
Este ciclo de quimioterapia es muy largo, por lo general tarda de nueve a doce meses, o incluso más [5], lo que aumenta el riesgo de mutaciones resistentes a los medicamentos en M. tuberculosis [6,7]. En los últimos años, la quimioterapia se ha vuelto menos eficaz debido a la aparición y al aumento de la proporción de M. tuberculosis multirresistente y ampliamente resistente a los fármacos [6]. Prevenir el desarrollo de la TB puede ser más eficaz que tratarla. Se sabe que la vacunación es una forma eficaz de proteger al huésped de las bacterias patógenas [8].

Actualmente, Bacillus Calmette-Guérin (BCG), desarrollado hace más de 100 años, es la única vacuna contra la TB clínicamente aprobada [9]. Desafortunadamente, la BCG solo protege a los recién nacidos y a los bebés y es en gran medida ineficaz contra los adolescentes y los adultos [2,10], aunque la OMS informa que el 89 % de los casos de TB en 2021 fueron adultos [4]. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de desarrollar una vacuna antituberculosa novedosa y eficaz, especialmente para adolescentes y adultos.

El desarrollo de vacunas contra la TB se ve complicado por las múltiples características de las micobacterias, como la infección latente, la persistencia y la evasión inmunitaria [11–13]. Una vacuna ideal contra la TB debe diseñarse para dirigirse a las proteínas/vías responsables de estas propiedades en M. tuberculosis y ser capaz de inducir eficientemente respuestas inmunitarias mediadas por células T CD4+ y CD8+ [14].

Además, una vacuna eficaz también debe dirigirse a los complejos principales de histocompatibilidad (MHC) del huésped, que son altamente polimórficos [15]. Estas características plantean requisitos muy altos para la versatilidad de la vacuna, que obviamente no se puede lograr con una sola proteína natural. La vacuna multiepítopo, una proteína recombinante que consta de una serie de epítopos superpuestos (péptidos) [16], es un nuevo tipo de vacuna candidata que puede abordar los problemas anteriores.

En los últimos años, las vacunas multiepítopo han atraído mucha atención debido a sus ventajas de mayor inmunidad y menor alergenicidad que las vacunas convencionales [17,18]. Actualmente, se han diseñado vacunas multiepítopo contra muchos microorganismos patógenos, entre ellos Shigella spp. [19], virus de la fiebre aftosa [20], Helicobacter pylori [21,22], virus de la hepatitis B [23], Toxoplasma gondii [24], Leishmania infantum [25], virus Nipah [26], Onchocerca volvulus [27], Pseudomonas aeruginosa [28] y virus de la leucosis [29].

En particular, la aparición de la pandemia de COVID-19 ha fortalecido la aplicación de esta tecnología [16,30–32]. En cuanto a la TB, se han diseñado varias vacunas multiepítopo para atacar la TB intrínsecamente activa [33–39] y la TB latente [40,41]. Entre ellos, se diseñaron tres vacunas candidatas en forma de ADN [34,36,40], y dos de ellas incorporaron epítopos en los esqueletos proteicos para generar vacunas recombinantes [34,36].

Cabe señalar que las proteínas candidatas para algunas de las vacunas multiepítopo anteriores se seleccionan al azar, y la cobertura poblacional de estas vacunas requiere más estudios.

Además, se diseñaron dos vacunas candidatas contra la TB multiepítopo con una amplia cobertura poblacional, un epítopo se seleccionó de proteínas de vesículas de exosomas inmunogénicos con propiedades patogénicas [39], y el otro no se enfoca en proteínas candidatas, sino que selecciona directamente proteínas altamente conservadas y validadas experimentalmente. epítopos de la base de datos de epítopos inmunes (IEDB) [38]. Sin embargo, estas proteínas candidatas carecen de enriquecimiento funcional, y la capacidad de las vacunas candidatas para inducir la secreción de interferón-(IFN-) aún debe mejorarse.

Un estudio previo ha deducido que la optimización racional de los epítopos se puede lograr mediante una combinación de la capacidad de unión del MHC y la capacidad del epítopo para reaccionar con los receptores de células T [42]. Además, predijeron que las vacunas con epítopos de unión de linfocitos T citotóxicos (CTL) A1, A2, A3, A24 y B7 tendrían una cobertura de casi el 100 por ciento en los principales grupos étnicos (negros, asiáticos, hispanos y caucásicos).

Sin embargo, hasta ahora no ha habido un enfoque similar para diseñar una vacuna contra la TB. En este estudio, diseñamos una vacuna antituberculosa multiepítopo altamente promiscua utilizando varias características antigénicas de proteínas enriquecidas con ocho funciones. La vacuna candidata quimérica posee 15 epítopos de CTL, 16 epítopos de linfocitos T auxiliares (HTL) con propiedades inductoras de IFN- -y 10 epítopos de células B lineales. El análisis de inmunoinformática demostró que esta vacuna candidata era 'integral', lo que la convertía en una posible piedra angular para lograr la 'estrategia Fin de la TB'.

2. Materiales y método

2.1. Selección de proteínas y recuperación de secuencias.

Para construir una vacuna multiepítopo contra la TB, primero seleccionamos proteínas del complejo M. tuberculosis, que están depositadas en la base de datos IEDB [43] y han sido validadas como epítopos de unión a MHC de clase I y II. Las secuencias de aminoácidos (estructura primaria) de las proteínas de la cepa H37Rv de M. tuberculosis se obtuvieron de la base de datos UniProt [44]. Las predicciones independientes de la alineación de posibles antígenos basadas en propiedades fisicoquímicas se obtuvieron del servidor VaxiJen 2.0 [45], que se sometió a una transformación automática y de covarianza cruzada (ACC) de secuencias de proteínas en un vector uniforme de aminoácidos principales. propiedades, con el umbral de antigenicidad fijado en 0.4 para cada proteína bacteriana [45,46].

La anotación funcional de proteínas se evaluó utilizando la base de datos para anotación, visualización y descubrimiento integrado (DAVID) 6.8 [47]. Las proteínas secretadas se enriquecieron aún más utilizando dos categorías: espacio extracelular y patogénesis a través de las bases de datos DAVID y BioCyc [48], respectivamente. El proteoma de Homo sapiens GRCh38.p13 se descargó en formato FASTA de la base de datos del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) [49]. BLASTp se utilizó para predecir la homología (valor E =1e-5) entre las proteínas secretadas y las proteínas de H. sapiens.

2.2. Predicción de epítopos de células T

La predicción y selección de epítopos son pasos cruciales en la construcción de vacunas de múltiples epítopos. Las moléculas de MHC I se unen a péptidos cortos (9-11 aminoácidos) porque la hendidura de unión de péptidos de las moléculas de MHC I que consisten en una sola cadena está cerrada [50]. NetMHCpan-4.1 [51], de libre acceso, se usó para la predicción de epítopos CTL, que usa NNAlign_MA para generar rangos porcentuales (rango porcentual) basados ​​en una combinación de afinidades de unión MHC I y ligandos eluidos .

La "clasificación porcentual" de una secuencia de consulta se determinó comparando su puntuación de predicción con la distribución de puntuaciones de predicción para el MHC relevante calculado usando un conjunto de péptidos nativos elegidos al azar. Los epítopos con una clasificación porcentual < 0.5 por ciento se consideraron aglutinantes fuertes, mientras que los epítopos con una clasificación porcentual < 2 por ciento se consideraron aglutinantes débiles [51].

Aunque se pueden predecir hasta 12 epítopos de supertipo MHC clase I en el servidor, solo usamos A1, A2, A3, A24 y B7 porque estos cinco supertipos cubren el 100 por ciento de las principales razas humanas [42] . Seleccionamos aglutinantes fuertes y predijimos su antigenicidad usando VaxiJen2.0 [45], luego, predijimos la inmunogenicidad de clase I usando la base de datos internacional de epítopos (IEDB) [52], que usa validación cruzada 3- veces.

Finalmente, organizamos los epítopos que eran tanto antigénicos como inmunogénicos según la clasificación porcentual y seleccionamos 15 epítopos de puntuación baja, tres para cada supertipo y al menos uno para cada proteína candidata, excepto una proteína candidata que no podía tener un epítopo de unión fuerte a CTL. que es antigénico e inmunogénico. Finalmente, los valores de IC50 para cada epítopo de CTL se predijeron a partir de NetMHC-4.0 [53].
Las moléculas del MHC de clase II se unen a péptidos antigénicos y HTL puede reconocer el complejo resultante. Por lo general, los péptidos antigénicos varían en longitud de 12 a 20 residuos de aminoácidos, pero con frecuencia se observan péptidos de entre 13 y 16 residuos de longitud [54].

Los {{0}}meros fueron los epítopos de MHC II más abundantes para M. tuberculosis y se han depositado en IEDB. Como resultado, usamos NetMHCIIpan-4.0 [51,55] para predecir la unión de 15-péptidos mer al antígeno leucocitario humano-DR (HLA-DR), HLADQ, HLA-DP, y H-2–1 alelo. La predicción también se basó en NNAlign_MA con una clasificación porcentual de < 2 por ciento y < 10 por ciento considerados aglutinantes fuertes y débiles, respectivamente [51].

Además, predijimos 15-epítopos inductores de IFN mer para proteínas candidatas utilizando el servidor IFNepitope [56], que utiliza un enfoque híbrido de máquina de vector de soporte que permite la detección virtual de péptidos/epítopos inductores de IFN- -en un péptido biblioteca que consta de aglutinantes de MHC II inducibles y no inducibles por IFN- -que activan las células T auxiliares. Luego predijimos la antigenicidad de los epítopos inductores de IFN [45] y, finalmente, seleccionamos los 16 epítopos más promiscuos que se unían fuertemente a MHC-II, inducían IFN y eran antigénicos.

Es importante señalar que los péptidos señal se eliminaron de las proteínas candidatas antes de la predicción del epítopo. En este estudio, los péptidos señal se seleccionaron mediante SignalP 5.0 [57] y TargetP2.0 [58].

2.3. Predicción lineal de epítopos de células B

Los epítopos de células B lineales (16-meros) se predijeron usando ABCpred [59,60] con un umbral predeterminado de 0.51. Además, para aumentar la confiabilidad de los resultados de predicción, también usamos BepiPred 2.0 [61] para predecir epítopos de células B lineales. Los epítopos obtenidos a partir de estos dos software se sometieron además a la predicción de antigenicidad utilizando VaxiJen2.0 [45]. Finalmente, seleccionamos diez epítopos de células B lineales en función de las altas puntuaciones de ABCpred y la antigenicidad, con al menos un epítopo seleccionado para cada proteína candidata.

2.4. Construcción del candidato vacunal multiepítopo con propiedades quiméricas

La vacuna multiepítopo diseñada contiene un adyuvante HBHA (hemaglutinina de unión a heparina), un epítopo de unión a Pan HLA DR (PADRE), 15 CTL, 16 HTL, 10 epítopos de células B lineales y una etiqueta Hisx 6 (Fig. 3). Los enlazadores se utilizaron para unir epítopos, prevenir la producción de epítopos de unión y mejorar la procesión y regeneración de epítopos individuales en vacunas quiméricas [62].

Para la construcción de esta vacuna candidata, el adyuvante HBHA (UniProt ID: P9WIP9) se ubicó en el extremo N y se conectó al PADRE corriente abajo a través de un enlazador EAAAK. Luego, los epítopos HTL unidos por los enlazadores GPGPG se unieron a PADRE. Además, los epítopos CTL unidos por el enlazador AAY se conectaron a los epítopos HTL a través del enlazador HEYGAEALERAG, que también unió la unidad de epítopo CTL a los epítopos de células B lineales enlazados mediante enlazadores KK. Finalmente, se unió una etiqueta Hisx6 al extremo C-terminal de la proteína quimérica.

2.5. Antigenicidad, alergenicidad y propiedades fisicoquímicas

El servidor VaxiJen 2.0 [45] predijo la antigenicidad de la vacuna de múltiples epítopos y las proteínas de ocho componentes, mientras que el servidor AllerTOP 2.0 predijo la alergenicidad de estas proteínas. 63]. AllerTOP 2.0 utiliza descriptores E de aminoácidos, transformación ACC de secuencias de proteínas y k-vecinos más cercanos (kNN) para la clasificación de alérgenos.

El método logró una precisión del 85,3 por ciento con 5-validación cruzada. Para la predicción de propiedades fisicoquímicas como la vida media, el punto isoeléctrico, el índice de inestabilidad, el índice alifático y el gran promedio de hidropaticidad (GRAVY) de esta vacuna de múltiples epítopos, se utilizó el servidor ExPASy ProtParam [64].
Además, la solubilidad del péptido de la vacuna multiepítopo se evaluó utilizando el servidor proteinSol (PROSO II) [65] basado en un clasificador que aprovecha las diferencias sutiles entre las conocidas proteínas insolubles de TargetDB y las proteínas solubles de TargetDB y PDB [ 66]. Cuando se evaluó usando la validación cruzada de 10-veces, logró una precisión del 71.0 por ciento (área bajo la curva ROC=0.785).

2.6. Simulación inmune

Para caracterizar el perfil de respuesta inmunitaria y la inmunogenicidad de la vacuna, se realizaron simulaciones inmunitarias in silico utilizando el servidor C-ImmSim [67]. C-ImmSim predice interacciones inmunitarias utilizando matrices de puntuación específicas de posición derivadas de técnicas de aprendizaje automático para la predicción de péptidos.
Al mismo tiempo, simula tres compartimentos que representan tres regiones anatómicas separadas que se encuentran en los mamíferos: (i) la médula ósea, donde se simularon células madre hematopoyéticas para producir nuevos linfocitos y células mieloides; (ii) el timo, donde se seleccionaron células T vírgenes para evitar la autoinmunidad; y (iii) el órgano linfático tal como los ganglios linfáticos.

Para cebar y potenciar la vacuna de forma eficaz, seguimos el enfoque de [68], en el que se administraron dos inyecciones con cuatro semanas de diferencia. Todos los parámetros de simulación se establecieron en valores predeterminados, con pasos de tiempo establecidos en 10 y 94 (cada paso de tiempo es de ocho horas).

2.7. Predicción de regiones desordenadas

Las regiones intrínsecamente desordenadas (IDR) están presentes en muchas proteínas. La región desordenada se predijo usando DISOPRED3 [69], que usa DISOPRED2 y otros dos módulos basados ​​en aprendizaje automático entrenados en IDR grandes para identificar residuos desordenados. Entonces eran anno

2.8. Predicción de estructuras secundarias y terciarias

La estructura secundaria de la vacuna diseñada fue predicha por el servidor PSIPRED 4.0 [70], que primero usa PSI-BLAST para identificar secuencias estrechamente relacionadas con la proteína de consulta. La estructura terciaria de esta vacuna se predijo utilizando el servidor de refinamiento de ensamblaje de subprocesamiento iterativo (I-TASSER) [71].

Hay cuatro pasos clave en el modelado de ITASSER; a) identificación de la plantilla de enhebrado; b) simulación iterativa de ensamblaje de estructuras; c) selección y refinamiento del modelo; y d) anotación funcional basada en la estructura [72,73].

I-TASSER generó cinco modelos, que se analizaron mediante ProSA-web [74], y se seleccionó el modelo con la puntuación Z más baja para perfeccionarlo. ProSA-web compara las puntuaciones del modelo obtenidas de estructuras verificadas experimentalmente depositadas en PDB. Un gráfico de puntaje de calidad local ayuda a identificar áreas problemáticas en el modelo, y los mismos puntajes se representaron usando un código de color en la presentación de la estructura 3D. Esto es útil para la determinación y el refinamiento estructural temprano.

2.9. Refinamiento de la estructura terciaria

El modelo 3D "grueso" del candidato a vacuna obtenido por ITASSER se refinó en dos pasos utilizando dos servidores; primero con ModRefiner [75] seguido de GalaxyRefine [76]. ModRefiner utiliza rastros de C para afectar la construcción y el refinamiento de las proteínas obtenidas mediante la minimización de energía a nivel atómico en dos pasos.

En primer lugar, las trazas de C se utilizaron para construir la cadena principal, seguido del refinamiento de los rotámeros de la cadena lateral y los átomos de la columna vertebral utilizando campos de fuerza compuestos basados ​​en la física y el conocimiento. GalaxyRefine utiliza múltiples plantillas para generar estructuras centrales confiables, mientras que los bucles o terminales no confiables se generaron mediante el modelado basado en la optimización.

2.10. Validación de estructuras terciarias

La estructura refinada de la vacuna candidata se validó mediante gráficos de Ramachandran generados a partir de las bases de datos PROCHECK [77] y MolProbity [78]. Los diagramas de Ramachandran evalúan la conformación de la columna vertebral de las proteínas dividiendo los residuos de aminoácidos en dos regiones: permitidas y no permitidas. PROCHECK utiliza la estereoquímica para evaluar la calidad neta de las estructuras proteicas comparándolas con las estructuras refinadas con la misma resolución y luego presentando las regiones que requieren más análisis.

Molprobity valida modelos de macromoléculas locales y globales (proteínas y ácidos nucleicos) mediante una combinación de criterios de rayos X, RMN, computacionales y cryoEM [79]. La potencia y la sensibilidad para optimizar la ubicación del hidrógeno y el análisis de contacto de todos los átomos se utilizan ampliamente en una versión actualizada de los criterios de geometría covalente y ángulo de torsión [80].

2.11. Epítopos discontinuos de células B

Los epítopos de células B discontinuos en la estructura de la proteína nativa se predijeron utilizando ElliPro [81]. ElliPro implementa tres algoritmos para aproximar la forma de la proteína como un elipsoide, calcula el índice de protrusión de residuos (PI) y agrupa los residuos vecinos en función de sus valores de PI. ElliPro proporciona a cada epítopo de salida una puntuación descrita como el valor promedio de PI para el residuo del epítopo. Un elipsoide con un valor de PI de 0.9 consta del 90 por ciento de los residuos de proteínas contenidos, mientras que el 10 por ciento restante de los residuos se encuentran fuera del elipsoide. Para cada residuo de epítopo, el valor de PI se calcula a partir del centro de masa del residuo que se encuentra fuera del elipsoide más grande posible.

2.12. Acoplamiento molecular de proteínas quiméricas

El acoplamiento molecular de la vacuna diseñada (ligando) con el receptor inmunitario Toll-Like Receptor-4 (TLR4) (PDB ID: 3FXI) se realizó mediante Patchdock [82]. Luego, los 10 mejores modelos se refinaron utilizando FireDock [83]. PatchDock reemplaza la representación de superficie de puntos de Connolly de las moléculas con parches cóncavos, convexos y planos.

Luego, los modelos se calificaron en función del ajuste geométrico y la desolvatación atómica. [82]. FireDock optimiza las conformaciones de la cadena lateral y la orientación del cuerpo rígido y genera una salida de un complejo refinado en 3D basado en la energía de enlace [83]. Seleccionamos el primer modelo de Firedock basado en la energía global como complejo de acoplamiento. Finalmente, la energía de unión y el contenido de disociación dentro del complejo de acoplamiento se predijeron utilizando el servidor PRODIGY [84].

2.13. Simulación de dinámica molecular

Se realizaron simulaciones de dinámica molecular en proteínas utilizando el servidor web rápido y de libre acceso, el servidor de análisis de modo normal de coordenadas internas (iMODS) [85], y se obtuvieron resultados de acoplamiento consistentes y óptimos del servidor PatchDock-FireDock. En coordenadas internas, el análisis de modo normal (NMA) genera movimientos colectivos críticos para la función macromolecular. iMODS presenta mecanismos para explorar estos modos como análisis de vibraciones, animaciones de movimiento y trayectorias de transformación que se llevaron a cabo de forma casi interactiva a diferentes resoluciones [85].

2.14. Traducción inversa, optimización de codones y clonación in silico de la vacuna

Para expresar eficazmente la vacuna candidata en células de Escherichia coli, se generó cDNA in silico a través de la optimización de codones y la traducción inversa utilizando la herramienta de adaptación de codones de Java (JCAT) [86].

La optimización involucró (i) evitar los terminadores transcripcionales independientes de rho, ii) evitar los sitios de unión al ribosoma procariótico, (iii) evitar el sitio de escisión de las enzimas de restricción NcoI y XhoI, que sirven como sitios de restricción N-terminal y C-terminal para la inserción de ADNc plantilla de vacuna, y (iv) solo optimización parcial para aplicar mutagénesis dirigida al sitio. El Índice de Adaptación de Codón (CAI) y el contenido de GC predijeron la calidad del ADNc con un codón de terminación opal (TGA) insertado después de la etiqueta Hisx 6. Luego, el fragmento de ADN optimizado de la vacuna candidata quimérica se integró en la hebra inversa de pET-28a( plus ) utilizando la herramienta SnapGene [87].

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