Análisis Del Tubular Proximal Y Glomérulo Del Riñón
Mar 15, 2022
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Perfiles proteómicos casi unicelulares del túbulo proximal y el glomérulo del riñón humano normal
Tara K Sigdel1, Paul D. Piehowski2, Sudeshna Roy1, Juliana Liberto1, Joshua R. Hansen2, Adam C. Swensen2, Rui Zhao3, Ying Zhu3, Priyanka Rashmi1, Andrew Schroeder1, Isabella Damm1, Esvástica Sur1, Jinghui Luo4, Yingbao Yang4, Wei-Jun Qian2* y Minnie M. Sarwal1* para el Consorcio del Proyecto de Medicina de Precisión del Riñón (KPMP)
1División de Trasplante de Múltiples Órganos, Departamento de Cirugía, Universidad de California, San Francisco, San Francisco, CA, Estados Unidos
2Laboratorio Nacional del Noroeste del Pacífico, División de Ciencias Biológicas, Richland, WA, Estados Unidos
3Laboratorio de Ciencias Moleculares Ambientales, Laboratorio Nacional del Noroeste del Pacífico, Richland, WA, Estados Unidos
4Departamento de Patología, Universidad de Michigan, Ann Arbor, MI, Estados Unidos
Palabras clave:glomérulo, espectrometría de masas, análisis unicelular, proteómica,riñón
Las evaluaciones moleculares a nivel de una sola célula pueden acelerar la investigación biológica al proporcionar evaluaciones detalladas de la organización celular y la heterogeneidad de los tejidos tanto en la enfermedad como en la salud. El humanoriñóntiene estados multicelulares complejos con funcionalidad variable, muchos de los cuales ahora pueden aprovecharse por completo con los avances tecnológicos recientes en proteómica tisular a un nivel casi unicelular. Discutimos los pasos fundamentales en la primera aplicación de este método proteómico basado en espectrometría de masas (MS) para el análisis de subsecciones del ser humano normal.riñón, como parte del Proyecto de Medicina de Precisión del Riñón (KPMP). Usando ~ 30-40 células renales microdisectadas capturadas con láser, identificamos más de 2500 proteínas humanas, con especificidad para eltúbulo proximal(PT; n=25 proteínas) y glomerular (Glom; n=67 proteínas) delriñóny sus funciones metabólicas únicas. Este estudio piloto proporciona la hoja de ruta para la aplicación de nuestro flujo de trabajo de proteómica casi unicelular para el análisis de otros microcompartimentos renales, a mayor escala, para desentrañar las perturbaciones de la función subcelular renal en el riñón normal, así como diferentes etiologías. de agudos y crónicosenfermedad del riñon.
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Introducción
Los avances recientes en el perfil molecular, específicamente el análisis transcripcional a nivel de una sola célula, pueden descubrir poblaciones de células raras dentro de tejidos clínicos heterogéneos, lo que contribuye a nuestra comprensión de la biología renal y sus procesos moleculares (1–7). Existe una necesidad insatisfecha de desarrollar métodos que puedan proporcionar información biológica completa a nivel de ARN y ADN y que también permitan el análisis proteómico de tejidos unicelulares.
Las tecnologías proteómicas, a diferencia de la genómica, pueden proporcionar información funcional sobre estados celulares y redes reguladoras (2). Un desafío tecnológico para la proteómica basada en espectroscopia de masas (MS) es la limitación del material de partida. A diferencia de la transcriptómica, la proteómica no permite la amplificación molecular. Este factoide ha resultado en esfuerzos sustanciales para mejorar la sensibilidad analítica de la proteómica basada en MS, incluida la miniaturización de la tecnología y mayores eficiencias en la fuente de ionización por electrospray (8, 9), de modo que la sensibilidad analítica ahora es suficiente para detectar proteínas en mamíferos individuales. células. A pesar de tener una alta sensibilidad analítica, las aplicaciones proteómicas a pequeños volúmenes de muestra han presentado desafíos adicionales, como la adsorción no específica de proteínas y péptidos en las superficies de los tubos de reacción, la cinética de digestión ineficiente, la necesidad de limpieza y desafíos con la entrega. Nuestro grupo ha informado recientemente sobre el método de proteómica de células casi unicelulares (nscProteomics) en células HeLa, que proporciona una tecnología altamente innovadora y sensible para las mediciones de proteoma de muestras con cantidades de proteína de sub-nanogramos de un pequeño número de células (10). Este método requiere un equipo de procesamiento de muestras altamente personalizado y es difícil de transferir a otros laboratorios de investigación en su estado actual de desarrollo. procesamiento humanoriñónLos tejidos a través de esta tubería han requerido una atención especial al desarrollo del protocolo para optimizar la conservación del tejido y la captura de células.
En este estudio, nos hemos centrado en proporcionar una hoja de ruta para la medición exitosa de la interrogación proteómica de varios subcompartimentos deriñón, a nivel de casi una sola célula, con los siguientes resultados: (i) Evaluación de la recolección y el almacenamiento óptimos de tejido renal para nscProteomics; (ii) Identificación del estándar de referencia apropiado para nscProteomics; (iii) Optimización del grosor del tejido renal para microdisección por captura láser (LCM); (iv) Optimización de los parámetros LCM; (v) Descripción del método nscProteomics utilizando un método micro POTS completamente automatizado basado en LC-MS (μPOTS; Procesamiento en un recipiente para muestras traza) (11); (vi) Análisis de datos para nscProteomics.
Para lograr las tareas antes mencionadas, hemos procesado 11 humanos únicosriñónbiopsias y desarrolló protocolos y metodologías para recolectar, procesar e interrogar la expresión proteómica de humanosriñónmuestras por μPOTS. Cuando se combina con LC-MS de alta sensibilidad, mostramos un método μPOTS totalmente automatizado que permite la reproducibilidad y proporciona mediciones proteómicas cuantitativas de ~3,000 proteínas de 10 a 100 células renales microdisectadas por captura láser (LCM), un nivel de cobertura solo alcanzado anteriormente para miles de celdas (12–17). Este estudio ayudará a la caracterización molecular de la heterogeneidad celular tisular y la patología en biopsias renales de pacientes con diferentes causas de enfermedad renal aguda y crónica. Esta tecnología única tiene el potencial de desentrañar la heterogeneidad proteómica y los marcadores de proteínas únicos en diferentesriñónsubtipos y subestructuras de enfermedades que se correlacionarán con la patogénesis, el pronóstico y la estratificación del riesgo de la enfermedad. El estudio se resume en la Figura 1.
Figura 1. El flujo de trabajo de proteómica casi unicelular (nscProteomics) está optimizado para procesar humanosriñóntejidos El flujo de trabajo incluye la identificación deriñónrecolección y almacenamiento de tejidos, los controles de calidad para el establecimiento de microdisección de captura láser del método nscProteomics para células renales.
Procedimientos experimentales
Diseño del estudio
La representación esquemática de los estudios proteómicos realizados en 11 humanos normales únicosriñonesse muestra en la Figura 2A. Se realizaron un total de 28 ciclos de espectrometría de masas (MS) para nscProteomics microdiseccionado (LCM) de captura masiva y láser en secciones glomerulares (Glom) y tubulares contorneadas proximales (PT) emparejadas. Tejidos de los dos primerosriñonesse conservaron como FFPE y en medio compuesto de temperatura de corte óptima (OCT). Los problemas de tejidos renales de 9 riñones más solo se procesaron en OCT (Figura 2A).
Figura 2. (A) Un resumen de las muestras y ensayos del estudio. (B) El diagrama de control de calidad para la reproducibilidad del proceso utilizando tejido OCT. Las diferencias de conteo espectral entre proteínas para 2 corridas separadas usando tejido OCT se representaron frente al conteo espectral de proteína promedio para 1257 proteínas. En el gráfico, la línea azul representa la diferencia de medias; las líneas roja y verde representan límites de 2 SD y 3 SD respectivamente. El 97,96 % de las proteínas se encuentran dentro del límite de reproducibilidad calculado de 13,52, lo que indica un alto grado de reproducibilidad. También se observa que la variabilidad entre ejecuciones del proceso que involucra tejido OCT es menor que la del proceso que involucra tejido FFPE (límite de reproducibilidad calculado: 24,43). (C) Comparación de distribuciones de recuento espectral de 374 proteínas comunes en OCT y FFPE. Un mayor número de proteínas del tejido OCT muestran recuentos espectrales altos, mientras que se observa una mayor preponderancia de recuentos espectrales bajos para las proteínas del tejido FFPE. (D) Comparación de distribuciones de recuento espectral de 76 proteínas únicas en FFPE y 244 proteínas únicas en OCT. La mayor preponderancia de proteínas de bajo recuento espectral se observa en el tejido OCT. Esto puede indicar que la técnica de tejido OCT es mejor para la detección de proteínas poco abundantes en el escenario actual. El coeficiente de correlación entre las proteínas identificadas a partir de 2 tejidos congelados mediante OCT fue 0,96 (P <>
Adquisición de muestras de tejido renal
Humanotejidos renalesse recolectaron de un total de 11 nefrectomías parciales no identificadas, obtenidas de la Universidad de California en San Francisco (UCSF) y la Universidad de Michigan (UM), con IRB aprobado, como parte de un estudio de viabilidad de tecnología piloto en el NIH Kidney Precision Medicine Proyecto (KPMP). Sólo el área sana delriñónsegún lo determinado por un patólogo capacitado se utilizó para este propósito. Las muestras se anonimizaron con la única salvedad de que los tejidos se recolectaron de adultos. Para evaluar el protocolo óptimo de recolección de muestras para la tecnología, inicialmente, ~100 mg de tejido de 2 riñones se dividió en partes iguales y se preparó como secciones de tejido fijadas con formalina e incluidas en parafina (FFPE) o se congeló en el Compuesto Tissue-Plus™ OCT (Fisher Scientific). Se cortaron una sección consecutiva de 5 μm y tres de 10 μm de cada bloque OCT con un criomicrotomo y se montaron en portaobjetos de membrana de tereftalato de polietileno (PET) 1.0 (Zeiss) para análisis glomerular y glomerular.túbulo proximaldisección. La sección de 5 μm de espesor se tiñó con H&E para visualizar las principales estructuras histológicas. Las secciones restantes de 10 μm de espesor se dejaron sin teñir. Todos los portaobjetos se almacenaron a -80 grados hasta la disección.
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Evaluación del impacto del envío y procesamiento de tejidos en la producción proteómica
Para evaluar el impacto de los retrasos en el análisis proteómico del tejido congelado OCT,riñóntissue samples were collected at one center, shipped to a second site >4 h de viaje, y procesado en el segundo centro, y viceversa. La proteómica a granel se realizó en dos 2 únicosriñones(riñón n.° 3, n.° 4), adquirido en la Universidad de Michigan y enviado a 2 ubicaciones diferentes (Universidad Estatal de Ohio y UCSF) para análisis de MS, utilizando el mismo protocolo y parámetros de MS en ambos sitios. Luego se compararon los resultados de las ejecuciones de MS entre los 2 sitios.
Extracción y Precipitación de Proteínas
Esto se llevó a cabo en los métodos de preparación de tejido OCT y FFPE para la selección del método óptimo para la proteómica tisular. El tejido OCT se seccionó en secciones de 10 μm de espesor utilizando un criomicrotomo. Para seleccionar la cantidad mínima de tejido necesaria para la extracción de proteínas para la EM, se cortaron, descongelaron y transfirieron a tubos de microcentrífuga tres rizos (una sección que se coloca en un tubo Eppendorf en lugar de extenderse sobre el portaobjetos) y 5 rizos de tejido congelado. que contiene una perla de acero inoxidable de 5 mm (Qiagen), expuesta a tampón de lisis de células de mamífero (que incluye solución inhibidora de nucleasa y proteasa Benzonase®; Qiagen) y homogeneizada en un TissueLyser LT (Qiagen) a 50 r/s durante 3 min. La concentración de proteína se cuantificó (ensayo de Bradford; Thermo Scientific) y se almacenó a -20 grados hasta su uso. Tejido almacenado para<2 months="" in="" ffpe="" was="" sectioned="" into="" ten="" 10="" μm="" thick="" sections="" using="" a="" microtome.="" three="" and="" five="" curls="" of="" tissue="" were="" cut,="" deparaffinized="" in="" xylene,="" centrifuged,="" and="" incubated="" in="" extraction="" buffer="" exb1="" (qiagen)="" supplemented="" with="" β-mercaptoethanol.="" samples="" were="" incubated="" on="" ice,="" followed="" by="" incubation="" at="" 80°c="" for="" 2="" h.="" protein="" was="" quantified="" (bradford="" assay;="" thermoscientific)="" and="" stored="" at="" −20°c="" until="" further="" use.="" protein="" was="" precipitated="" by="" the="" addition="" of="" cold="" acetone,="" followed="" by="" centrifugation="" to="" pellet="" and="" dry="" the="" precipitated="" protein.="" the="" pellet="" was="" re-suspended="" in="" 6="" m="" urea/100="" mm="" tris-hcl="" ph="" 7.8,="" and="" protein="" concentration="" was="" quantified="" (bradford="" assay;="" thermoscientific)="" and="" stored="" at="" −20°c="" until="" trypsin="">
digestión con tripsina
Aproximadamente 150 ug de proteína total (~15 % del aporte disponible) se expuso a agentes reductores (DTT 200 mM y Tris-HCl 100 mM) y reactivos alquilantes (yodoacetamida 200 mM y Tris-HCl 100 mM) y luego se diluyó con agua libre de ARNasa/ADNasa para reducir la concentración de urea a 0,6 M. Se añadieron cuatro µg de tripsina porcina (Sigma) y la muestra se digirió a 37 grados. Se cuantificó la concentración de proteína (ensayo de Bradford; ThermoScientific) y se usaron 10 ug de proteína para la EM.
MS para proteómica a granel para evaluar el método óptimo de procesamiento de tejido renal
La mezcla de péptidos trípticos se acidificó con ácido fórmico, se limpió con columnas C18 Monospin y se analizó en el Orbitrap Q Exactive HF-X (Thermo Scientific). MS/MS se realizó utilizando disociación de trampa C de energía superior (HCD). Los espectros de masas se analizaron usando Byonic v2.14.27 (Protein Metrics) que permite tolerancias de masa de 12 ppm. Se permitieron modificaciones postraduccionales variables, incluyendo oxidación, metilación, carbamilación y fosforilación. Las proteínas se limitaron a aquellas que obtuvieron una puntuación superior a una tasa de descubrimiento falso (FDR) del 1 por ciento. Se realizaron comparaciones de la abundancia de proteínas y los datos de MS para seleccionar el método óptimo parariñónrecogida de tejido entre FFPE y OCT.
Microdisección por captura láser
Se colocaron secciones sin teñir de 5, 10 y 20 μM de espesor montadas en portaobjetos de PET en la platina del sistema de microdisección láser Zeiss PALM MicroBeam (Zeiss) para probar el espesor de corte óptimo. glomerular ytúbulo proximallas regiones se seleccionaron utilizando la herramienta de mano alzada y las disecciones se realizaron con un objetivo de 10X. Se capturaron secciones con un área de ~4580 μm2 y un grosor de 10 uM, que representaron ~40 células glomerulares según la fórmula publicada anteriormente para la estimación de células glomerulares en un adulto sanoriñón(18). Para eltúbulo proximalcélulas, capturamos ~2,900 μm2 detúbulo proximalcélulas, que representaron ~ 36 células. Las secciones cortadas se catapultaron en una tapa adhesiva opaca de 200 μL (Zeiss) (LPC Energy, 66; LPC Focus, 79) y se almacenaron a -80 grados.
Proteómica de células casi unicelulares (nscProteomics)
Para solubilizar las proteínas recolectadas en las tapas de captura con LCM, se agregó directamente a la tapa una gota de 10 μL de 0,1 por ciento de DDM 50 mM Tris pH 8. Las muestras se incubaron durante 30 min a 37 grados en un termomezclador Eppendorf ThermoTop para reducir la evaporación, seguido de centrifugación a 2,000 × g durante 1 min para transferir el lisado al vial. Las proteínas se redujeron con ditiotreitol 5 mM y se incubaron a 37 grados durante 30 min. La alquilación se llevó a cabo en yodoacetamida 10 mM con una incubación de 45 min en la oscuridad a 25 grados. A continuación, se añadió una alícuota de 10 ng de Ls-C seguido de una incubación de 3 horas a 25 grados. Luego se añadió una alícuota de 10 ng de tripsina seguido de digestión durante la noche a 25 grados. Los péptidos digeridos se mezclaron con una alícuota de 15 μL de agua 18 MΩ.
Plataforma LC-MS para muestras ultrapequeñas
Las muestras de péptidos (25 μL) se separaron utilizando una columna de 60 cm, con un diámetro interno de 50 μm y un emisor integrado (Nuevo Objetivo). Las columnas se empaquetaron internamente con medio Waters BEH de 1,7 μm de diámetro. Se produjo un gradiente de 100-min utilizando una nanobomba Dionex Ultimate 3000 RSLC (Thermo Scientific). Este sistema se acopló a un espectrómetro de masas QExactive Plus (Thermo Scientific). Los espectros de masas se recogieron de 300 a 1800 m/z, utilizando un método de adquisición dependiente de los 12 datos principales. Los espectros de MS1 se recogieron con una resolución de masa de 35K y MS2 con 17,5K. Se utilizó un TI máximo de 100 ms para aumentar las identificaciones de iones de baja abundancia.
Extracción de datos proteómicos
Todos los archivos sin procesar se procesaron con MaxQuant (versión 1.5.3.30) para la detección de características, la búsqueda en bases de datos y la cuantificación de proteínas/péptidos (19) siguiendo la configuración descrita anteriormente (10). Los espectros de masas en tándem se buscaron en la base de datos humana UniProtKB/Swiss-Prot (descargada el 29 de diciembre de 2018 y que contiene 20 417 entradas revisadas). Los datos de proteómica de MS para nscProteomics se depositaron en ProteomeXchange Consortium a través del repositorio de socios PRIDE (20) con el identificador de conjunto de datos PXD015058 y 10.6019/PXD015058.
Análisis de los datos
Los datos de MS se obtuvieron de ejecuciones realizadas en PNNL (nscProteomics) y la Universidad de Stanford (proteómica a granel). Para proteómica a granel. Los siguientes métodos estadísticos se utilizaron para seleccionar el óptimoriñónmétodo de recolección de tejido, ya sea congelado en OCT o procesado como FFPE, según lo evaluado por la proteómica cuantitativa del tejido a granel, (i) se calculó el rendimiento de proteína/mg de tejido de entrada equivalente; (ii) La reproducibilidad de MS se probó en la salida de MS de las secciones FFPE y OCT de cada uno de los 2 riñones, preparados por la misma persona usando el mismo protocolo, analizados en el mismo instrumento de MS usando un protocolo establecido, con unos pocos días de diferencia (21). Se utilizó un límite de reproducibilidad (22) para proporcionar un límite aproximado de las diferencias de medición entre ejecuciones sucesivas de un solo proceso, así como una estimación de la precisión para la comparación entre procesos. Se calculó el coeficiente de correlación, que proporcionó el grado de concordancia entre corridas sucesivas (usando el mismo tejido); (iii) Se calculó la abundancia de proteínas y la distribución del tamaño de fragmentos de péptidos para evaluar las variaciones originadas por la degradación de proteínas, el entrecruzamiento debido a la formalina, etc.riñónreferencia y (v) cálculo del sesgo. El análisis cuantitativo estricto y la identificación de proteínas únicas utilizaron datos solo con proteínas con recuentos espectrales mayores o iguales a 5 (23). Se usó la prueba exacta de Fisher para evaluar el enriquecimiento de proteínas comunes y únicas mapeadas entre dos riñones humanos normales (#1 y #2). En base al análisis anterior (ver resultados), se seleccionó tejido congelado OCT como método de recolección para todos los análisis posteriores.
El siguiente paso del enfoque del análisis de datos fue identificar, cuantificar y validar conjuntos de proteínas enriquecidas o específicas de las ~10–100 células obtenidas de cada una de las dos seleccionadas.riñónsubcompartimentos: regiones Glom y PT, obtenidas del mismoriñón, a granel y LCM de OCT congeladostejido renal(n=9; riñones n.º 3–11) y dirigido por nscProteomics.
Se adoptó un enfoque de filtrado semiconservador de {{0}}pasos para tratar los problemas de datos faltantes o incompletos, y se usó la prueba G (24) para identificar si los datos faltaban al azar (MAR) o Falta no al azar (MNAR). Se realizó una evaluación adicional de la confiabilidad de los datos seleccionando estrictamente las proteínas observadas en un 50 % o más de todas las muestras. Se usó la prueba T para identificar el enriquecimiento significativo de proteínas en glomming o PT y se aplicó la corrección de prueba múltiple (Benjamini-Hochberg FDR) con un umbral significativo de 0,1. A los fines del análisis, los datos de MS de intensidad relativa (log 2 transformados) obtenidos de las fracciones Glom, PT y a granel de un soloriñónse consideraban emparejados. Identificamos proteínas enriquecidas en Glom (con niveles bajos en PT/bulk) y exclusivas de Glom (ausentes en PT), así como proteínas enriquecidas en PT (con niveles bajos en Glom/bulk) y exclusivas de PT (ausentes en Glom) . El análisis de enriquecimiento se realizó solo en datos sin valores faltantes en cada grupo para aumentar la confianza. La correlación entre los valores de abundancia de las proteínas comunes se utilizó para evaluar el grado de concordancia entre las proteínas del subcompartimento enriquecido entre ejecuciones separadas del mismo experimento. También realizamos una validación cruzada de proteínas significativamente enriquecidas en cada compartimento mediante el análisis de estas comparaciones de conjuntos de muestras únicos entre 2 ejecuciones diferentes, la ejecución 1 y la ejecución 2. La validación biológica para conjuntos de proteínas de subcompartimentos enriquecidos (Glom y PT) fue realizada por preguntando si las proteínas enriquecidas en subcompartimentos conocidas podrían localizarse en sus regiones específicas en los datos públicos del Human Protein Atlas (https://www.proteinatlas.org/) (25).
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Comparación/integración de datos Cross-Omics
Para evaluar la concordancia de la expresión de proteínas a nivel de ARN, se utilizaron los datos generados a partir de la secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA Seq) realizada en 10 nefrectomías nativas, 9 de las cuales se superponían con lariñonesutilizado en nscProteomics. Para ello, se utilizó la plataforma 10x Genomics Chromium con química v3 usando el método optimizado en el laboratorio de Sarwal como Sitio de Interrogación de Tejidos (TIS) del Consorcio KPMP (se está preparando un manuscrito que detalla el método y los resultados). Para este análisis de ómica cruzada, usamos datos transcriptómicos de 45,411riñónLas células se resolvieron en nueve tipos principales de células: Podocitos, células mesangiales, endotelio glomerular, estroma/intersticio, células inmunitarias,túbulo proximal, rama ascendente gruesa del asa de Henle, túbulo distal/de conexión y conducto colector. El análisis de los datos de una sola celda se realizó utilizando el paquete Seurat R versión 2.3.4. Se está desarrollando un análisis más profundo de estos datos (26).
De: 'Perfil proteómico de células casi unicelulares deltubulares proximalesyglomérulodel humano normalRiñónde Tara K. Sigdel1, Paul D. Piehowski2, Sudeshna Roy1, Juliane Liberto1, Joshua R. Hansen2, Adam C. Swensen2, Rui Zhao3, Ying Zhu3, Priyanka Rashmi1, Andrew Schroeder1, Izabella Damm1, Swastika Sur1, Jinghui Luo4, Yingbao Yang4, Wei-Jun Qian2* y Minnie M. Sarwal1* por laRiñónConsorcio del Proyecto de Medicina de Precisión (KPMP)
---Artículo de INVESTIGACIÓN ORIGINAL Portada. Med., 17 de septiembre de 2020 |
